大鼠中枢神经系统中反义寡核苷酸的细胞内传递

摘要

在这里，我们描述了一种通过将导管植入脊柱的腰间空间来向大鼠中枢神经系统输送药物的方法。我们专注于反义寡核苷酸的输送，尽管这种方法也适合其他治疗方式的交付。

摘要

血脑屏障 （BBB） 是防止潜在毒性或致病剂从血液进入中枢神经系统 （CNS） 的重要防御手段。然而，它的存在也大大降低了系统管理的治疗剂对CNS的可及性。克服这一难题的一种方法是将这些制剂直接注入脑脊液（CSF），从而绕过BBB。这可以通过植入导管进行连续输注，使用渗透泵或单核聚子输送。在本文中，我们将描述通过直接植入成年大鼠脊柱的cauda equina空间的导管输送CNS靶向反义寡核苷酸（ASOs）的手术方案。作为代表性的结果，我们展示了通过该导管系统单次博鲁斯ASO内注射在大鼠CNS不同区域击倒目标RNA的功效。该程序安全、有效，不需要昂贵的设备或手术工具。此处描述的技术也可以用于以其他方式提供药物。

引言

中枢神经系统（CNS）的血管系统已经演变为平衡、控制分子交通、提供营养和清除废物的关键调节器。该系统也是抵御外部病原体攻击的第一道防线，这要归功于内皮细胞壁上紧密结的密集分布。这些紧密的交汇点构成血脑屏障 （BBB） 的一个方面。虽然BBB允许输送满足营养和能量需求所需的分子（如离子、葡萄糖），但它也有选择地限制病原体和有毒^{化学品1、2、3}的通过。

具有讽刺意味的是，BBB相同的保护功能，限制病原体和有毒化学品的通过，也是我们能否在系统给生物体进行系统管理后，通过治疗轻松获得中枢神经系统^{的主要障碍2， 4，5}.BBB的这一作用促使大量新的药物分销技术和方法^的发展。

克服这个障碍的一个方法是将药物直接注射到脑脊液（CSF），这种液不断渗透大脑和脊髓7，8，9，10。在本文中，我们将描述一种通过将导管内端完全置于大鼠脊柱的cauda equina空间中，成功地将代理传递到腰间空间的方法。马祖尔等人曾^{在其他地方11}日发表了对这一程序的描述。

该方案非常有效，通过定量聚合酶链反应（qPCR）分析靶基因敲^除8，使反义寡核苷酸（ASO）输送到CNS的成功率超过90%。手术对动物造成最小的不适，因为100%的老鼠在手术中幸存下来，手术伤口周围肿胀最小，没有痛苦的迹象（例如，多动、脱水、盘旋、失去平衡、食物摄入量减少，以及脱水）在手术后观察。此处描述的方法的另一个优点是，它不需要昂贵的设备，也不需要任何特殊工具。

研究方案

所有体内程序均根据生物基因机构动物使用和护理委员会（IACUC）批准的协议进行，这些规程遵循美国国家卫生研究院关于照料和使用实验室动物的指南。

1. 材料和仪器制备

1. 准备特殊的导引管。
   1. 使用带有切断轮（或锋利锯）的旋转工具切断 19 G 指针的两端，从而产生 ±1.5⁄2 厘米长的导管（图 1Aiii）。使用旋转工具的砂轮使两端平滑。
      注:或者，预做和无菌导管可以从商业供应商（材料表）购买。
2. 准备导管/导线组件。
   1. 切割一块 8 厘米长的 PE-10 管（聚乙烯管，直径 0.011 英寸），作为导管内导管。用耐乙醇标记笔从一端制作一个 2 厘米的标记。用聚四氟乙烯涂层不锈钢丝切割11厘米长的样式线。将样式线（图1Aii）插入 PE-10 导管的流明（图 1Ai）。
      注:每种动物都需要一个导管/线组件集（图1Av）。或者，导管和样式电线可以从商业供应商购买（材料表）。
3. 准备输送导管组件。
   1. 切割一块 PE-50 导管（5⁄10 厘米，聚乙烯管，直径 0.023 英寸） （图 1Bi）。PE50 导管的一端插入 23 G 管适配器（图1Biv）。在手术过程中，此端将连接到 100 μL 注射器 （材料表）。将带轮毂切断的经过修改的 30 G针插入大约0.5 厘米的 PE-10 管（图 1Bii），并将 PE-10 管连接到导管的另一端。
   2. 分娩导管组件的30G针端（图1Bv）将在手术期间连接到大鼠中植入的PE-10导管的远端。
      注:或者，交付导管组件（图1Bv）可以从商业供应商（材料表）购买。
4. 通过在 23 G 针头的末端放置导管（图 1Aiii），准备导管-针组件（图1Avi）。
5. 使用环氧乙烷消毒器对所有手术器械进行消毒，包括导管和导线/导管套，使用环氧乙烷消毒器12小时。
   注:除导管外，所有手术器械均可高压灭菌;导管在高温下会熔化。

2. 手术准备

注:此程序通常对体重在 200 g 和 400 g 之间的雄性和雌性斯普拉格道利大鼠进行。两只老鼠被安置在每个笼子的12小时光/暗循环下，免费获得食物和水。

1. 给大鼠重量，并将其放入一个异常鲁兰室，以诱导麻醉（O₂中的1~5%的异常鲁兰，滴定作用）。
   注:大鼠然后用电子曲一不断麻醉，在整个过程中通过鼻锥保持深层麻醉。替代麻醉方法（例如，使用氯胺酮100毫克/千克和木兰素10毫克/千克）可作为经IACUC批准使用。
2. 当大鼠对脚趾挤压没有反应时，将其背部从尾巴切到胆椎，并将被裁过的老鼠放在放在加热垫顶部的无菌纸上。
3. 在大鼠腹部下放置一个50ml圆锥形离心管，使脊柱弯曲在腰部区域（图2A），并在眼睛上涂上眼药膏。
4. 注射持续释放丁丙诺啡（1.0毫克/千克;材料表）在老鼠皮下。用交替的波维酮和酒精磨砂清洁暴露的皮肤，并重复三次。
   注: 替代止痛可用于经IACUC协议批准。
5. 用无菌透明窗帘覆盖动物，在手术部位上被覆盖。

3. 外科

1. 在大鼠由50 mL锥形管支撑时，识别骨盆上方肌肉之间的两个自然坑（图2A中的箭头）。用一只手握住这些坑，用另一只手轻轻按压和感觉脊柱从牛骨方向，并找到椎骨之间的第一个主要缩进，这是S1和L6椎骨之间的椎间空间（图2B).
2. 稍微旋转，以识别下一个缩进，L5 和 L6 椎骨之间的椎间空间以及注射部位（图 2A中* ）。使用手术刀使切口在皮肤中，从玫瑰石到乳管的切口不超过2厘米，使注射部位位于切口的中心（图2A中的虚线）。
3. 使用解剖剪刀解剖结缔组织，以可视化肌肉层。然后在肌肉胶囊中切开1厘米，立即横向到L6腰椎的背脊过程。
   注:此时可以可视化 L6 腰椎骨骼。
4. 将导管针组件放置在第 6 腰椎的前部附近，然后沿着第 6 椎骨的前部将其推入椎间空间，使针的末端穿透脊髓管。沿着针将导管推入原位，取出 23 G 针头，仅将导管留在原位。
   注:在插入针头之前，使用钝钳定位 L6 腰椎的背风是很有帮助的。通常，可以看到CSF液体进入针轮毂（这种液体可能带有一丝血迹，但这并不意味着已经造成伤害或针头放置不正确）。在此过程中，作者没有看到大量血液或严重出血。如果发生上述情况，应联系兽医以确定适当的治疗以及是否应对动物实施安乐死。
5. 将导管导线组件插入导管管。以大约 45° 角将导管导线组件向下倾斜，以大约 45° 角向脊髓管倾斜，并将末端推入脊髓管约 0.3 厘米。
6. 拆下导管，将导管与样式导线留在原位。从导管的内端取约2.5厘米的样式线，并将导管推进到脊髓管中，直到2厘米标记位于运河入口（在肌肉下方可见），如图1Bvi所示。
   注: 插入的导管应以玫瑰形延伸到亚拉奇诺德空间。成功放置应允许导管在空间中自由移动。
7. 完全拔下样式导线，并且 CSF 可能会被视为进入植入的导管。
8. 通过 30 G 针端将输送导管组件连接到植入导管的远端（图 1Bv，vi）。
9. 将60 μL无菌盐水装入100μL注射器（冲洗注射器）。将30μL的测试化合物（例如ASO溶液）装入第二注射器（注射注射器）。
10. 将冲洗注射器（装有盐水）连接到输送导管组件的管杆适配器端（图1Bv）。将 20 μL 无菌盐水注入盘中空间（注射前冲洗）。
11. 将注射注射器（装有测试化合物）连接到输送导管组件的管杆适配器端（图1Bv）。将 30 μL 的测试化合物注入超过 30 s 的盘中空间。
    注:ASO的常规注射体积为30μL，以在脊髓和皮层中实现良好的击倒。据报道，注射体积可能会影响化合物^分布12，虽然不同的注射体积尚未测试。如果使用其他化合物或体积，需要根据经验确定安全性和有效性。
12. 重复步骤3.10，用另一个40μL无菌盐水冲洗导管（注射后冲洗）。然后从植入的导管上分离输送导管组件。
    注:注射前和注射后冲洗被认为可以减少化合物的局部固存，并改善其分布到玫瑰^结构12。
13. 无菌切割和热封住的导管:将一对无菌解剖钳放入珠消毒器中，直到它们非常热，然后用钳子的热端夹住管子。
    注:此操作会熔化导管。因此，管子中的孔是坍塌的，所有侧面相互粘住，以无菌方式密封管，然后将其放入皮下空间。
14. 使用可吸收的单丝缝合线将剩余的热密封导管固定到结缔组织。然后使用不可吸收的单丝缝合线在固定的热密封导管上关闭皮肤。
    注: 伤口夹也可以用作 IACUC 协议批准的。该技术与重复注射兼容，尽管它只用于我们手中的一次性注射。重复注射的可行性应经IACUC批准进行实证评估。
15. 使用纱布和盐水洗涤皮肤的任何血液，让动物从麻醉中恢复在加热的培养箱，直到移动，在这一点上，它返回到其家庭笼子（每个笼子两只老鼠）。
    注:当在同一天对多只大鼠进行手术时，使用清水去除血液和在动物之间使用加热的干珠消毒器（至少20s，有时间冷却）进行再消毒。每5只动物就使用一套新的仪器。
16. 根据IACUC协议，每天监测动物至少3天，并在手术后继续每周监测动物。
    注:如果出现任何并发症（尿液保留、切口感染、神经紊乱（如癫痫发作或瘫痪），应联系兽医以确定适当的治疗以及动物是否应安乐死。如果不使用持续释放丁丙诺啡，应根据IACUC协议，在手术后每天给予疼痛缓解。

4. IT注射后组织特定敲除的评估

1. 在 IT Bolus 注射 ASOs 两周后，收集大脑的不同区域（即大脑皮层、纹状体和小脑）以及脊髓的不同部分（即颈椎、胸腔和腰部）。使用商业RNA提取试剂盒提取总组织RNA，并如^前13所述进行cDNA合成反应。
   注:标准试剂用于qPCR，其检测结果如下:大鼠马拉特1和大鼠GAPDH。使用 2^-+CT方法（CT =阈值周期）计算相对成绩单水平。

结果

使用此处描述的方法，我们给两组成年雌性大鼠（250–300克;n = 10/组）注射了单一磷酸缓冲盐水PBS或300μgASO，针对长非编码（林肯）RNA Malat1;在我们的实验室中，我们经常使用Malat1 ASO作为工具化合物，因为马拉特1在所有^组织（包括大脑和脊髓）中随处可见，并且含量很高。Malat1 ASO 通过 RNaseH1 介导机制¹⁵工作，该机制可降解 RNA，导致敲?...

讨论

本文展示了一种将治疗剂直接输送到大鼠CNS的有力方法。从理论上讲，类似的技术也可以在小鼠身上进行，但由于体积较小，这种方法可能更具挑战性。因此，我们小组在小鼠中执行中枢注射（ICV）注射，用于中枢神经系统药物输送，通过不同的给药途径达到相同的目标。另一^项研究16中已经描述了这种方法。

此处描述的方法的优点是，它不需要昂贵的设备...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture	3M		1020
70% ethanol	Decon Laboratories, Inc		8416-160Z
Alcohol swab sticks	Dynarex		NO 1204
BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip	BD	1ml TB Luer-Lok tip	BD 302830
BD Intramedic PE Tubing	BD	Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in	BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P)
BD Intramedic PE Tubing	BD	Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in	BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B)
BD Intramedic PE Tubing Adapters	BD	23 gauge intramedic luer stub adaper	BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E
BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G	BD		BD 305128
Buprenorphine Sustained Release-lab	ZooPharm	Prescription required
Ethylene oxide sterilizer	Andersen Sterilizer INC.	AN 74i, gas sterilizer	AN 74i
Guide cannula	BD	19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle	BD 305186
Hamilton syringe 100ul	Hamilton company	Hamilton syringe 100ul
Hot bead Sterilizer	Fine Science Tools		STERILIZER MODELNO FST 250
Ophthalmic ointment	Dechra veterranery product		17033-211-38
Pocket Pro Pet Trimmer	Braintree Scientific		CLP-9931 B
Povidone scrub	PDI		S48050
Saline	Baxter	Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml	FE1306G
Scalpel	Feather	disposable scalpel	No. 10
Small animal heating pad	K&H Manufacturing		Model # 1060
Stylet Wire	McMaster-Carr	1749T14	LH-36233780
Surgery Towel drape	Dynarex		4410
Surgical scissors and forceps	FST and Fisher Scientific
Sutures	Ethicon		4-0 or 5-0
Tool to make the Guide cannular	Grainger	Rotary tool (Dremel)	14H446 (Mfr: EZ456)
		EZ lock cut off Wheel	1PKX5 (Mfr: 3000-1/24)
		Grinding Wheel, Aluminum Oxide	38EY44 (Mfr: EZ541GR)
		EZ lock Mandrel	1PKX8 (Mfr: EZ402-01)
		Diamond wheel floor Tile	3DRN4 (Mfr: EZ545)
Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure
Dosing catheter system	SAI Infusion Systems		RIDC-01
Guide cannula	SAI Infusion Systems		RIDC-GCA
Internal Catheters	SAI Infusion Systems		RIDC-INC
Stylet Wire	SAI Infusion Systems		RIDC-STY