Внутритековая доставка антисмысловых олигонуклеотидов в центральной нервной системе Крысы

Резюме

Здесь мы описываем метод доставки лекарств в центральную нервную систему крыс путем имплантации катетера в поясничное внутричебное пространство позвоночника. Мы ориентируемся на доставку антисмысловых олигонуклеотидов, хотя этот метод подходит и для доставки других терапевтических способов.

Аннотация

Гематоэнцефалический барьер (BBB) является важной защитой от входа потенциально токсичных или патогенных агентов из крови в центральную нервную систему (ЦНС). Однако его существование также значительно снижает доступность системно управляемых терапевтических агентов для ЦНС. Один из способов преодоления этого, заключается в том, чтобы вводить эти агенты непосредственно в спинномозговой жидкости (CSF), таким образом, в обход BBB. Это может быть сделано путем имплантации катетера либо для непрерывного вливания с помощью осмотического насоса, или для одной доставки болюса. В этой статье мы описываем хирургический протокол для доставки CNS-таргетинга антисмысловых олигонуклеотидов (ASOs) через катетер имплантированных непосредственно в cauda equina пространство взрослого позвоночника крысы. В качестве репрезентативного результата мы показываем эффективность одной инъекции болюса ASO внутритековой (ИТ) через эту систему катетеризации в сбивании целевой РНК в различных регионах крысы ЦНС. Процедура безопасна, эффективна и не требует дорогостоящего оборудования или хирургических инструментов. Описанный здесь метод может быть адаптирован для доставки наркотиков в других условиях.

Введение

Сосудистая система центральной нервной системы (ЦНС) превратилась в критический регулятор гомеостаза, контролирующий движение молекул, снабжающий питательными веществами и избавляющийся от отходов. Эта система также является первой линией защиты от атак внешних патогенов, благодаря плотному распределению плотных узлов вдоль стен эндотелиальных клеток. Эти плотные соединения составляют один аспект гематоэнцефалического барьера (BBB). В то время как BBB позволяет транспортировать молекулы, необходимые для удовлетворения потребностей в питательных веществах и энергии (например, ионы, глюкоза), он также избирательно ограничивает прохождение патогенных микроорганизмов, а также токсичных химических веществ^1,2,3.

По иронии судьбы, та же защитная функция BBB, что ограничивает прохождение патогенных микроорганизмов и токсичных химических веществ также является основным препятствием для нашей способности легко получить доступ к ЦНС с терапевтическим лечением после системного введения в организм^{2, 4,5}. Эта роль BBB побудила развитие множества новых технологий распределения наркотиков и подходов⁶.

Один из способов преодолеть это препятствие заключается в том, чтобы вводить наркотики непосредственно в спинномозговой жидкости (CSF), которая постоянно пронизывает как головной и спинной мозг^7,8,9,10. В этой статье мы описываем метод успешной доставки агентов в пояснично-поясничное внутреннее пространство, поместив внутренний конец катетера полностью в cauda equina пространстве крысиного позвоночника. Описание этой процедуры было ранее опубликовано Mazur et al. в другом месте¹¹.

Протокол является очень эффективным и производит более 90% успеха антисмысловых олигонуклеотидов (ASO) доставки в ЦНС при оценке количественной полимеразы цепной реакции (qPCR) анализ целевого гена нокдаун⁸. Процедура вызывает минимальный дискомфорт для животных, так как 100% крыс выживают в хирургии и показывают минимальный отек вокруг хирургической раны и никаких признаков бедствия (например, гиперактивность, обезвоживание, кружение, потеря равновесия, снижение приема пищи, и обезвоживание) во время послеоперационного наблюдения. Еще одним преимуществом описанного здесь метода является то, что он не требует ни дорогостоящего оборудования, ни каких-либо специальных инструментов.

протокол

Все процедуры in vivo были выполнены в соответствии с утвержденными протоколами Biogen Institutional Animal Use and Care Committee (IACUC), которые соответствуют руководящим принципам, изложенным в руководстве Национальных институтов здравоохранения Соединенных Штатов по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Подготовка материалов и инструментов

1. Подготовьте специальные направляющие канюли.
   1. Используйте роторный инструмент с отрезанным колесом (или острой пилой), чтобы отрезать два конца иглы 19 G, в результате чего направляющая канюля длиной 1,5-2 см(рисунок 1Aiii). Используйте шлифовающее колесо вращающегося инструмента, чтобы сгладить два конца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, предварительно изготовленные и стерильные консервы руководства могут быть приобретены у коммерческого поставщика (Таблица материалов).
2. Подготовьте сборку катетера/провода.
   1. Вырезать 8 см длиной кусок PE-10 трубки (полиэтиленовые трубки, диаметр 0,011 дюйма), чтобы служить в качестве интратекального катетера. Сделайте отметку 2 см с одного конца с помощью этанола устойчивостью маркерпер. Вырезать 11 см длиной стиль проволоки из политетрафторетилена покрытием из нержавеющей стали провода. Вставьте провод stylet(Рисунок 1Aii) в просвет катетера PE-10(рисунок 1Ай).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Один катетер / провод сборки набор(Рисунок 1Av) необходимо для каждого животного. Кроме того, катетеры и провода stylet могут быть приобретены у коммерческого поставщика(Таблица материалов).
3. Подготовьте сборку катетера доставки.
   1. Вырезать кусок катетера PE-50 (5-10 см, полиэтиленовые трубки, диаметр 0,023 дюйма)(рисунок 1Bi). На один конец катетера PE50 вставьте 23 G трубный адаптер(рисунок 1Biv). Этот конец будет соединен со шприцем 100 л(Таблица материалов) во время операции. Вставьте модифицированную иглу 30 G с отсеченным концентратором(рисунок 1Biii) в кусок PE-10(рисунок 1Bii)и соедините трубку PE-10 с другим концом катетера.
   2. 30 G иглы конце доставки катетер сборки(Рисунок 1Bv) будет подключен к дистальный конец имплантированного PE-10 катетер в крысы во время операции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, сборка катетера доставки(рисунок 1Bv)может быть приобретена у коммерческого поставщика(Таблица материалов).
4. Подготовьте направляющий cannula-иглы сборки (Рисунок 1Ави) путем размещения направляющей канюли (Рисунок 1Aiii) в конце 23 G иглы.
5. Стерилизовать все хирургические инструменты, включая направляющий канюлю и наборы провода/катетера с помощью стерилизатора оксида этилена на 12 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты, кроме катетера, могут быть аутоклавированы; катетер растает при высокой температуре.

2. Хирургическая подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура обычно выполняется на мужчин и женщин Sprague Dawley крыс с массой тела между 200 г и 400 г. Две крысы размещаются в клетке под 12 ч свет / темный цикл с бесплатным доступом к пище и воде.

1. Вес крысы и поместить его в изофларанкамеру, чтобы вызвать анестезию (1'5% изолюран в O₂, титр для эффекта).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крыса затем постоянно анестезируется с изофлюраном для поддержания глубокой анестезии через носовой конус на протяжении всей процедуры. Альтернативный метод анестезии (например, введение кетамина 100 мг/кг и ксилазина 10 мг/кг) может быть использован в соответствии с одобренным IACUC.
2. Когда крыса не в состоянии реагировать на щепотку ног, брить спиной от хвоста к хвостовой грудной отдел позвоночника и место бритая крыса на стерильный лист положил на верхней части грелки.
3. Позиция 50 мл конической центрифуги трубки под брюшной полостью крысы, чтобы сгибать позвоночник в поясничной области(рисунок2)и применять офтальмологическую мазь для глаз.
4. Вводят устойчивый высвобождение бупренорфин (1,0 мг/кг; Таблица материалов) подкожно в крысы. Очистите обнажённую кожу с чередующимися скрабы и алкоголем и повторите это три раза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативное обезболивание может быть использовано в порядке, утвержденном протоколом IACUC.
5. Drape животное с стерильной прозрачной драпировки, которая была fenestrated над хирургическим сайтом.

3. Хирургия

1. С крысой поддерживается 50 мл конической трубки, определить две естественные ямы между мышцами выше таза (стрелки на рисунке 2A). С одной стороны, держа эти ямы, использовать другую руку, чтобы мягко нажмите и почувствовать позвоночник от каудаля до рострального направления и найти первый крупный отступ между позвонками, и это межпозвонковое пространство между S1 и L6 позвонков (Рисунок 2B ).
2. Перемещение немного промежутке, чтобы определить следующий отступ, межпозвонковое пространство между l5 и L6 позвонков и инъекций (к рисунку 2A). Используйте скальпель, чтобы сделать разрез не более 2 см в длину в кожу вдоль средней линии от ростральной до каудальной так, что место инъекции находится в центре разреза (пунктирная линия на рисунке 2А).
3. Используйте ножницы для вскрытия, чтобы вскрыть соединительную ткань, чтобы визуализировать мышечный слой. Затем сделайте 1 см разрез в мышечной капсуле сразу боковой спинной спинной процесс поясничного позвонка L6.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кости поясничного позвонка L6 могут быть визуализированы в этой точке.
4. Расположите направляющий канюля-иглы сборки вблизи передней аспект 6-го поясничного позвонка и нажмите его в межпозвонковом пространстве вдоль передней аспект 6-го позвонка так, что конец иглы проникает в позвоночный канал. Нажмите направляющей канюли на месте вдоль иглы и удалите 23 G иглы оставляя только направляющий канюли на месте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно использовать тупые щипцы, чтобы найти процесс дозалока поясничного позвонка L6 перед вставкой иглы. Как правило, жидкость CSF можно увидеть ввода иглы концентратор (эта жидкость может быть оттенком с намеком крови, но это не означает, что вред был нанесен или что игла не помещается правильно). Авторы не видели большое количество крови или сильное кровотечение во время этой процедуры. Если любое происходит, ветеринар должен связаться, чтобы определить соответствующее лечение и если животные должны быть усыплены.
5. Вставьте катетер-проводсборки в направляющий канюли. Угол вниз катетер-провод сборки примерно на 45 "угол спинного канала и силы конца примерно 0,3 см в позвоночного канала.
6. Удалите направляющий канюли, оставив катетер со стилю провода на месте. Удалите провод стиле примерно 2,5 см от внутритековой кончик катетера и заранее катетер в позвоночный канал, пока 2 см знак находится на входе в канал (просто видимый ниже мышц), как показано на рисунке 1Bvi.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вставленный катетер должен распространяться на субарахноида. Успешное размещение должно обеспечить свободное движение катетера в этом пространстве.
7. Полностью снять стилизованный провод, и CSF можно увидеть ввод имплантированного катетера.
8. Подключите сборку катетера доставки к дистальной концу имплантированного катетера через конец иглы 30 G(рисунок 1Bv,vi).
9. Загрузите 60 л стерильного солей в шприц объемом 100 л (флешинг шприц). Загрузите болюс в 30 л испытательного соединения (например, раствор ASO) во второй шприц (инъекционный шприц).
10. Подключите шприц (загруженный сольником) к концу адаптера трубопровода доставки(рисунок 1Bv). Вводят 20 л стерильного солья в внутритекальное пространство (прединъекционная промывка).
11. Подключите инъекционный шприц (загруженный испытательным соединением) к концу адаптера трубопровода доставки(рисунок 1Bv). Впрысните 30 л испытательного соединения в внутритекатое пространство более 30 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычный объем инъекций ASO составляет 30 Зл для достижения хорошего нокдауна в спинном мозге и в коре головного мозга. Было сообщено, что объемы инъекций может повлиять на соединение распределения¹², хотя различные объемы инъекций не были протестированы. Если используется другое соединение или объем, безопасность и эффективность должны быть эмпирически определены.
12. Повторите шаг 3.10 и промойте катетер еще с 40 зл и сытости солей (после инъекции промывки). Затем отсоедините сборку катетера доставки от имплантированного катетера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: До и после инъекции флеш, как полагают, уменьшить локальное секвестр соединений и улучшить их распределение в ростральных структур¹².
13. Асептические вырезать и тепла печать имплантированного катетера: Поместите пару стерильных щиптов рассечения в стерилизатор абий, пока они не очень жарко, а затем зажать вниз на трубку с горячим концом щиптем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это действие расплавит катетер. Таким образом, отверстие в трубке разрушается и все стороны прилипают друг к другу, уплотнение труб в асептической моды, а затем он помещается в подкожное пространство.
14. Используйте абсорбируемые швы монофиплата для обеспечения оставшегося теплозащитного катетера в соединительной ткани. Затем используйте неабсорбируемые швы монофилом, чтобы закрыть кожу над защищенным тепло-запечатанным катетером.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зажимы для ран также могут быть использованы в порядке, утвержденном протоколом IACUC. Техника совместима с повторными инъекциями, хотя она используется только для одноразовых инъекций в наших руках. Осуществимость повторных инъекций должна быть эмпирически оценена с одобрения МАКУК.
15. Используйте марлю и солевой раствор для мытья крови из кожи и позволяют животному оправиться от наркоза в нагретом инкубаторе до мобильного, после чего оно возвращается в домашнюю клетку (две крысы на клетку).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении операций на нескольких крысах в тот же день, чистые инструменты с использованием воды для удаления крови и повторной стерилизации с помощью нагретого сухого стерилизатора биса (по крайней мере 20 с, со временем, чтобы охладить) между животными. Каждые 5 животных используется новый набор инструментов.
16. Мониторинг животных ежедневно, по крайней мере 3 дня после операции и продолжать следить за животными еженедельно после восстановления после операции в соответствии с протоколом IACUC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если какие-либо осложнения происходят (задержка мочи, разрез инфекций, неврологические расстройства, такие как захват или паралич), ветеринар должен связаться, чтобы определить соответствующее лечение и если животные должны быть усыплены. Если устойчивое высвобождение бупренорфин не используется, обезболивание должно быть дано ежедневно после операции в соответствии с протоколом IACUC.

4. Оценка ткани специфического нокдауна после инъекции ИТ

1. Через две недели после инъекции ИТ-болуса АСО собирают различные участки мозга (т.е. коры головного мозга, стриатум и мозжечок), а также различные сегменты спинного мозга (т.е. шейки матки, грудной и поясничной). Извлекайте полную РНК ткани с помощью коммерческого комплекта экстракции РНК и выполняйте реакцию синтеза кДНК, как описано ранее^13.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные реагенты были использованы для qPCR со следующими анализами: крыса Malat1 и крыса GAPDH. Относительные уровни стенограммы были рассчитаны с использованием метода 2^-ЗКТ (КТ и порогового цикла).

Результаты

Используя описанный здесь метод, мы ввели две группы взрослых самок крыс (250-300 г; n - 10/группы) либо одним болюсом фосфатно-буферного солевой PBS, либо 300 мкг АСО, нацеленным на длинную некодирующую (linc) РНК Malat1; в нашей лаборатории мы регулярно используем Malat1 ASO в качестве ин?...

Обсуждение

В настоящей статье показан мощный метод доставки терапевтических агентов непосредственно в крысу ЦНС. В теории, аналогичный метод может быть выполнена и у мышей, хотя из-за меньшего размера, метод может быть более сложным. Таким образом, наша группа выполняет инъекции инtracerebroventricular (ICV) ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture	3M		1020
70% ethanol	Decon Laboratories, Inc		8416-160Z
Alcohol swab sticks	Dynarex		NO 1204
BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip	BD	1ml TB Luer-Lok tip	BD 302830
BD Intramedic PE Tubing	BD	Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in	BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P)
BD Intramedic PE Tubing	BD	Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in	BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B)
BD Intramedic PE Tubing Adapters	BD	23 gauge intramedic luer stub adaper	BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E
BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G	BD		BD 305128
Buprenorphine Sustained Release-lab	ZooPharm	Prescription required
Ethylene oxide sterilizer	Andersen Sterilizer INC.	AN 74i, gas sterilizer	AN 74i
Guide cannula	BD	19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle	BD 305186
Hamilton syringe 100ul	Hamilton company	Hamilton syringe 100ul
Hot bead Sterilizer	Fine Science Tools		STERILIZER MODELNO FST 250
Ophthalmic ointment	Dechra veterranery product		17033-211-38
Pocket Pro Pet Trimmer	Braintree Scientific		CLP-9931 B
Povidone scrub	PDI		S48050
Saline	Baxter	Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml	FE1306G
Scalpel	Feather	disposable scalpel	No. 10
Small animal heating pad	K&H Manufacturing		Model # 1060
Stylet Wire	McMaster-Carr	1749T14	LH-36233780
Surgery Towel drape	Dynarex		4410
Surgical scissors and forceps	FST and Fisher Scientific
Sutures	Ethicon		4-0 or 5-0
Tool to make the Guide cannular	Grainger	Rotary tool (Dremel)	14H446 (Mfr: EZ456)
		EZ lock cut off Wheel	1PKX5 (Mfr: 3000-1/24)
		Grinding Wheel, Aluminum Oxide	38EY44 (Mfr: EZ541GR)
		EZ lock Mandrel	1PKX8 (Mfr: EZ402-01)
		Diamond wheel floor Tile	3DRN4 (Mfr: EZ545)
Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure
Dosing catheter system	SAI Infusion Systems		RIDC-01
Guide cannula	SAI Infusion Systems		RIDC-GCA
Internal Catheters	SAI Infusion Systems		RIDC-INC
Stylet Wire	SAI Infusion Systems		RIDC-STY