שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

Summary

מאמר זה מתאר שיטה לטעינת עוברי שברירי הדגים עבור מיקרוסקופ הזמן המורחבת הקפיצה הדקה. שיטה בעלות נמוכה זו קלה לביצוע באמצעות מנות מיקרוסקופית תחתית רגילות של זכוכית להדמיה בכל מיקרוסקופ הפוך. ההרכבה מבוצעת בשכבות של הצמח בריכוזים שונים.

Abstract

הדינמיקה של פיתוח יכול להיות בעקבות מיקרוסקופ זמן הקפיצה של התהליך של העוברים חיים הטרנסגניים לחיות ביטוי של זריחה ברקמות או בתאים ספציפיים. קושי עם הדמיה של התפתחות העובר כולו הוא כי עוברי דגים לצמוח באופן משמעותי באורך. כאשר נטען באופן קבוע ב-0.3-1% ממיסים נמוך, מטילה הצמח מגבלות גידול, המובילות לעיוותים בגוף העובר הרך. ובכל זאת, כדי לבצע מיקרוסקופ לצניחה בזמן מיקוד, העובר חייב להיות ללא תנועה. מאמר זה מתאר שיטת הרכבה שכבתית עבור עוברי דגים המגבילים את תנועתיות העוברים ומאפשרת צמיחה בלתי מוגבלת. ההרכבה מבוצעת בשכבות של הצמח בריכוזים שונים. כדי להדגים את השימושיות של שיטה זו, כלי הדם של העובר כולו, התפתחות עצבית ושרירים הייתה התמונה בדגים טרנסגניים במשך 55 שעות רצופות. שיטה זו הרכבה ניתן להשתמש בקלות, בעלות נמוכה הדמיה של עוברי דג זברה שלמים באמצעות מיקרוסקופים הפוכה ללא דרישות של תבניות או ציוד מיוחד.

Introduction

הדג הגדול הינו אורגניזם מודל לביולוגיה התפתחותית, והמיקרוסקופיה היא השיטה העיקרית להמחיש את ההתפתחות העובלנית. יתרונות השימוש בעוברי דגים למחקרים התפתחותיים כוללים גודל קטן, בהירות אופטית, פיתוח מהיר ופוריות גבוהה של הדג המבוגר. הדור של הקווים הטרנסגניים המבטא זריחה ברקמות או תאים מסוימים אפשרו הדמיה ישירה של פיתוח רקמות בדרכים לא אפשרי עם בעלי חיים גדולים יותר בעלי חוליות. בשילוב עם מיקרוסקופ לשגות בזמן, פרטים ודינמיקה של פיתוח רקמות ניתן ללמוד בקלות.

קושי בהתפתחות הדמיה של דגי ההדמיה הוא שהעוברים גדלים באופן משמעותי באורך; העובר מרחיב את אורכו ארבע פעמים בתוך 3 הימים הראשונים של החיים¹. גם, הגוף של העובר המוקדם הוא רך, ובקלות הופך להיות מעוות אם הצמיחה היא מוגבלת. ובכל זאת, כדי לבצע מיקרוסקופ ממוקד, העובר חייב להיות ללא תנועה. כדי לשמור על העוברים בעמדה קבועה עבור הדמיה זמן מיקוד התמונה, הם מורדם באופן קבוע ורכוב ב 0.3-1% נמוך להמיס. לדבר זה יש יתרון של התרת צמיחה מסוימת במהלך ההדמיה לתקופה מסויימת, תוך הגבלת תנועות העובר. חלקים של העובר יכול להיות ביעילות להיות בתמונה כך. עם זאת, בעת שימוש בשיטה זו עבור הדמיה של העובר כולו עבור פרקי זמן מורחבים, עיוותים הם נצפו בשל הצמיחה המוגבלת הנגרמת על ידי הצמח. לכן, נדרשות שיטות הרכבה אחרות. קאופמן ועמיתיו תיארו הרכבה חלופית של עוברי דג דג זברה עבור מיקרוסקופ גיליון אור, כגון מיקרוסקופ התאורה סלקטיבי המטוס (spim), על ידי הרכבה העוברים ב-fluorinated אתילן פרופילן (fep) צינורות המכילים ריכוזים נמוכים של agarose או מתילתאית². טכניקה זו מייצרת ויזואליזציה מעולה של embryogenesis לאורך זמן. Schmid ואח ' לתאר הרכבה של עד שישה עוברים ב agarose בצינורות פבואר עבור מיקרוסקופ גיליון אור³ מתן ויזואליזציה של מספר עוברים במפגש אחד הדמיה. בתבניות נעשה שימוש כדי ליצור מערכי העובר להרכבה יעילה של מספר גדול יותר של עוברים⁴. מסקינקיות ואח ' בנויים בתבניות פלסטיק מודפס 3d שניתן להשתמש בהם כדי להפוך סיליקון מטיל כי העוברים בשלבים שונים ניתן להציב, המאפשר להרכבה בעמדה קבועה עבור הדמיה, כולל הדמיה קונפוקלית וקד⁵. הדפסה תלת-ממדית השתמשה גם כדי ליצור תבניות עבור מיקום עקבי של עוברי צבפיש 96-ובכן פורמט⁶. תבניות מסוימות מותאמות אישית עבור שלבים מסוימים ולא ניתן להתיר צמיחה בלתי מוגבלת לפרקי זמן ארוכים, בעוד שתבניות אחרות גמישות יותר. לאחרונה, Weijts ואח ' פרסמה את העיצוב והייצור של מאכל ארבע היטב עבור הדמיה חיה של עוברי דגים^{שבעה 7}. בתבשיל זה, הזנב והגזע של עוברי דגים מורדם ממוקמים באופן ידני תחת גג סיליקון ברור מחובר ממש מעל זכוכית כיסוי כדי ליצור כיס. העובר הוא תוקן לאחר מכן במיקום זה על ידי תוספת של 0.4% agarose. הרכבה זו מאפשרת הדמיה של החלק האחורי של כ 2 מ"מ (העורק והזנב) של העובר, וכמו עד 12 עוברים ניתן לרכוב לכל טוב, השיטה מאפשרת הדמיה של דגימות מרובות. באופן דומה, הירסינגר ו סטבנטון הציגו לאחרונה שיטה שבה ראש הדג מותקן בתוך agarose, בעוד הזנב יכול לצמוח בחופשיות, ושיטה זו גם מקלה ביעילות הדמיה של הגזע והזנב של העובר⁸.

מאמר זה מתאר שיטת הרכבה שכבתית עבור עוברי דגים המגבילים את תנועות העוברים תוך התרת צמיחה בלתי מוגבלת. היתרונות של שיטה זו הרכבה הם כי היא בעלות נמוכה, שיטה מהירה וקל לעלות על העוברים של שלבים שונים עבור הדמיה באמצעות כל מיקרוסקופ הפוך. ההרכבה מאפשרת הדמיה ארוכת טווח של הגוף כולו (ראש, גזע וזנב) במהלך התפתחות העובר. כדי להציג את השימושיות של שיטה זו, כלי הדם של העובר כולו, התפתחות עצבית ושרירים הייתה מתמונה בדגים טרנסגניים. שני עוברים בכל הפעלה, בשני אורכי גל תלת-ממד הוצגו על ידי מיקרוסקופ הזמן לשגות עבור 55 שעות רצופות כדי להפוך סרטים של פיתוח רקמות.

Protocol

עבודת החיות המוצגת כאן אושרה על ידי הטיפול המוסדי בעלי חיים וועדות השימוש (IACUCs) של אוניברסיטת יוסטון ואוניברסיטת אינדיאנה.

1. גידול דגים

הערה: עבודה עם דגמי בעלי חוליות דורשת פרוטוקול מאושר IACUC. היא צריכה להתבצע על פי ההנחיות הלאומיות והבינלאומיות הרלוונטיות.

1. שמירה על דגי מבוגרים כמתואר בספרות⁹בעבר.
2. בשעות אחר הצהריים, במקום מבוגר. מזדגים במיכלי רבייה מתרבים זכרים לנקבות ביחס של 1:2.

2. הכנת פתרונות

1. הפוך פתרון מניות של 1% להמיס ממיסים נמוכה באמצעי תקשורת העובר (E3:5 מ"מ הנאגל, 0.17 מ"מ KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 Mm MgSO₄, מותאם ל-pH 7.0). מחלקים את פתרון המניה לצינורות 1.5 mL ומאחסנים אותם ב -4 ° c.
2. הפוך פתרון מניות של 4% (w/v) Tricaine (MS-222) במים מזוקקים. חנות ב -4 ° c בבקבוק כהה.
   התראה: Tricaine רעיל ויש לשקול ולהתפרק בתוך מכסה המנוע.
3. הפוך פתרון מניות של 20 מ"מ N-פנילתיואוראה (PTU) במים מזוקקים. חנות ב-20 ° c.

3. הכנת העוברים

1. לאחר ההזדווגות, עוברי הקציר ב-E3 בצלחת פטרי ומודחת אותם ב 26.5 ° c עבור כ 28 h לפני הטעינה.
   הערה: זה מאט את ההתפתחות של העוברים כך העוברים הם כ 30 הבמה הסומטים בתחילת ההדמיה.
2. עוברים מורדם ב-0.016-0.020% Tricaine ב-E3. כדי לעכב את הפיגמנטציה, הוסף PTU לריכוז של 200 μM.
3. העוברים באמצעות מלקחיים תחת מיקרוסקופ מבתר. שימוש בשני מלקחיים, אחיזה ומשוך בעדינות את הצ בנפרד כדי לשחרר את העובר.

4. הרכבה בתוך הצמח

הערה: שיטת ההרכבה המפותחת מחייבת שני ריכוזים שונים של מחסור במיסים בשנת E3 עם 0.02% Tricaine ו-PTU לפי הצורך. הפתרון הראשון מכיל ריכוז מיטבי של הצמח שבו מינימום העיוות והתנועתיות. האופטימיזציה מתוארת בשלב 5 להלן.

1. מחממים את הפתרונות האגתיים לשתי השכבות (ריכוז המוגדר בשלב 5 למטה ו -1%) עד 65 ° c. תנו לאגקם להתקרר כ-30 ° צ' בדיוק לפני הטעינה, כך שהוא לא ייפגע מהחום. להרכבה, השתמש במנות בתחתית זכוכית של 35 מ"מ עם תחתית זכוכית מס ' 0. זכוכית העטיפה המצורפת לתחתית המנה יוצרת 10 מ"מ רדוד (כ-1.2 מ"מ עמוק) ובכן, שבו יש להציב את העובר.
   הערה: במקרה זה, הריכוז עם התנועתיות והעיוותים הפחותים בין 0.025 ל-0.040% התעוררה.
2. הנח בעדינות על העובר התחתון עם אחד הצדדים הצדדיים שלו לקראת תחתית המנה באמצעות פיפטה זכוכית או מיקרופיפטה. אם נשתמש במיקרופיפטה, חותכים את החלק החיצוני של הקצה כדי להגדיל את גודל הפתח כדי להתאים לעובר (איור 1א). הסר בזהירות את הE3 שנותרה עם מיקרופיפטה.
3. הוסף את הפתרון הראשון שנוצר על ידי הזכוכית המכסה המצורפת לתחתית המנה כדי לכסות את העובר (שכבה 1) (איור 1B). ודא כי ה-agarose מכסה את הבאר הקטנה, אך לא גולש אותו.
4. כסו את הבאר הקטנה עם זכוכית כיסוי (22 מ"מ x 22 מ"מ) (איור 1ג) כדי ליצור חלל צר מלא עם העובר בין שתי כוסות הכיסוי.
5. מניחים שכבה של 1% הפתרון על גבי הזכוכית המכסה בכל החלק התחתון של המנה (שכבה 2) (איור 1ד). כפי ששכבה זו מתקשה, הוא מחזיק את הזכוכית המכסה במקום.
6. למלא את החלק הנותר של המנה עם E3 המכיל 0.02% Tricaine כדי לשמור על המערכת להתייבש (שכבה 3) (איור 1E).
   הערה: בכיוונון זה, זכוכית העטיפה ו-1% agarose להגן על השכבה התחתונה מלקבל מדולל.

5. אופטימיזציה של הפתרון הראשון עבור שכבה 1

1. כדי לזהות את הריכוז האופטימלי של הצמח עבור שכבה 1, השתמש בגישה לחיפוש ברשת בקנה מידה רב. העוברים הר בריכוזים גוברת של agarose החל 0.01% אל 1% ואחריו לפקיעה זמן הדמיה של הגבלת גידול העובר ותנועתיות בשדה הראייה. זהה את הריכוזים שבהם העיוות והתנועתיות הם מינימום.
2. כדי לייעל את הריכוז של agarose עוד, הר העוברים באמצעות מגוון עדין של ריכוזים של agarose (למשל, בין 0.025 ו 0.040% agarose) בהתאם לריכוז נמצא להיות הטוב ביותר בשלב 5.1 (למשל, 0.025%, 0.028%, 0.031%, וכו ').
   הערה: במעבדה שלנו, הריכוז האופטימלי ביותר היה בסביבות 0.03%.

6. הזמן לפקיעה הדמיה

הערה: שיטת הרכבה זו פועלת עבור כל מיקרוסקופ הפוך עם פונקציונליות לפקיעה זמן עבור הדמיה של שדות פלואורסצנטית ובהיר.

1. לבצע הדמיה זמן לפקיעה עבור העובר כולו או חלקים ממנו עד 55 h. עבור הדמיה של מספר עוברים, השתמש במתאם שלב המכיל מספר מנות עם עובר אחד רכוב לכל מנה. סובב את הכלים אחד אחרי השני כך שעוברי האורך יהיו בערך אופקית כפי שנקבע בעין. לצמיחת העובר והפיתוח האופטימליים, השתמשו בשלבי מיקרוסקופ עם אינקובטור שהוגדר ב-28.5 ° c.
2. בחרו מטרת הגדלה נמוכה בתוכנת המיקרוסקופ. תחת העין, לאתר וליישר דק את העוברים אופקית על ידי סיבוב הכלים באמצעות תאורה בהירה בשדה ולהקליט את מיקומם בתוכנה. צור שם קובץ לצורך שמירה אוטומטית של הנתונים.
   הערה: בניסוי זה, תוכנית apo λ 4x 0.2 NA מטרה ו- XY tab בתוך חלון הרכישה הND שימשו כדי להקליט את מיקומי העוברים. הנתונים נשמרו בתבנית. nd2. המטרה נבחרה על ידי לחיצה על הסמלים שלה בכרטיסיה משטח Ti .
3. הגדר את גודל הנקב, מהירות הסריקה, גודל התמונה והזום. לאחר מכן, בחרו מטרת הגדלה גבוהה יותר ללכידת התמונות.
   הערה: בניסוי זה, תוכנית-apo 10x 0.45 NA מטרה שימש לדימות של עוברים שלמים, ו-super-fluor 20 x 0.75 NA מטרה שימש הדמיה הגדלה גבוהה יותר של חלקים של העובר. חריר הוגדר 1.2 AU (19.2 יקרומטר עבור עדשת 10x), מהירות הסריקה הוגדרה עבור פיקסל זמן לשכון של 2.4 μs ואת גודל התמונה היה מוגדר 1024 x 1024 פיקסלים עם זום סריקה של אחד, מתן גודל פיקסל של 1.24 יקרומטר עבור עדשת 10x ו 0.62 יקרומטר עבור עדשת 20x.
4. בחר את הערוצים ליצירת תמונה של הקרינה הפלואורסצנטית. כוונן את הגדרות לכידת התמונה בערוץ אחד בכל פעם. עבור כל ערוץ פלואורסצנטית להתאים את כוח הלייזר ואת המתח הגבוה גלאי, ומוודאים לאסוף את הטווח הדינמי הטוב ביותר האפשרי תוך הימנעות הרוויה והגבלת photobleaching לבנה.
   הערה: בניסוי זה, gfp היה התמונה עם הערוץ 488 ירוק, (488 ננומטר לייזר ופליטה בין 500 ו 550 nm), ו rfp עם ערוץ אדום 561 (561 nm לייזר ופליטה בין 570 ו-600 nm), ואת תמונת השידור נאסף באמצעות הלייזר לייזר nm וגלאי אור המשודר (TD ערוץ).
5. כדי לדמות את העובר כולו עם המטרה 10x, תמונה מספר שדות של תצוגה עם חפיפה ולתפור אותם יחד באמצעות תוכנת המיקרוסקופ.
   הערה: כאשר העוברים יגדלו במידה ניכרת במהלך ההדמיה, ודא שיש מקום בשדה הראייה הקדמי והאחורי של העובר. השתמש בכרטיסייה ' סרוק תמונה גדולה ' של חלון הרכישה הND ובחר תבנית 4 x 1 עם חפיפה של 10% ללכידת ארבעה שדות תצוגה סמוכים.
6. הגדר את ההגדרות עבור לכידת Z-ערימות באמצעות תוכנת המיקרוסקופ.
   הערה: מכיוון שהעובר מותקן קרוב לתחתית צלחת הזכוכית, המרכז שלה יזוז מלמטה כפי שהוא צומח. השתמש בכרטיסייה Z של חלון הרכישה הND ובחר בטווח היחסי הסימטרי. בשיטה זו, מישור המיקוד הנוכחי משמש כמישור הייחוס ושאר המטוסים מסימטרית לעיל ולמטה כדי לכלול את העובר כולו בתוך אמצעי האחסון של מחסנית Z, עם מספיק מקום כדי לחשבון את צמיחת הדגימה. בכל הניסויים, המרווח הוגדר עד 11 יקרומטר ואת הטווח הכולל על 45 מטוסים.
7. כדי לשמור על ההתמקדות של עוברים מרובים במהלך הדמיה לטווח ארוך זמן, השתמש בפוקוס אוטומטי. אם הדמיה של מספר עוברים, התאם את רמות ההיסט הבודדות עבור כל עובר כדי להתמקד במישור הייחוס.
   הערה: בניסוי זה, נעשה שימוש במערכת ייצוב מיקוד המבוססת על לייזר.
8. הגדרת פרמטרים לפקיעה זמן בתוכנת המיקרוסקופ ובתמונה למשך של 55 h בסביבות 1 h במרווחי זמן. בכל מחזור, לכוד שני מערכי נתונים של העובר ברציפות ושמור נתונים באופן אוטומטי לאחר כל מחזור.
9. עיבוד תמונות באמצעות גירסה מקוונת או מבוטלת של תוכנת המיקרוסקופ. אם יותר מעובר אחד היה בתמונה, צור קבצים עצמאיים עבור כל עובר על-ידי פיצול ערכת הנתונים בהתבסס על מיקום ההדמיה. השתמש בתחזיות אינטנסיביות מרביות או בכלי דומה כדי להמיר ערכות נתוני זמן תלת-ממד לערכות נתונים של זמן דו-ממדי. צרו קובצי סרטים בעזרת האפשרות ' שמור כתפריט ', בחירה ב-. avi כתבנית הקובץ. בחר באפשרות ללא דחיסה עם 200 ms מרווחי זמן עבור מהירות השמעה של 5 מסגרות/s.
   הערה: ערכת הנתונים המקורית של שני עוברים בניסוי זה היתה מפוצלת באמצעות מיקומי פיצול פונקציה בתוכנה (קובץ | ייבוא/ייצוא | פיצול מרובה נקודות). ערכות נתונים בזמן תלת-ממד הומרו לערכות נתוני זמן דו-ממדי באמצעות הפונקציה הקרנת עוצמה מרבית (תמונה | ND עיבוד | יצירת תמונת הקרנה בעוצמה מרבית ב-Z).

תוצאות

פיתוח שיטת ההרכבה
המטרה העיקרית של עבודה זו הייתה לפתח טכניקת הרכבה בעלות נמוכה להדמיה בזמן הדמיה של התפתחות הדגים במשך פרקי זמן ארוכים. שיטת ההרכבה שכבתית פותחה כדי לאפשר צמיחה מלאה של גוף העובר שברירי דג זברה, תוך הגבלת תנועותיו. אם ריכוז השכבה 1 גבוה מדי, העוברים יהפכו להיות מ?...

Discussion

שיטת הרכבה עבור מיקרוסקופיה מורחבת של מיקרוסקופית הזמן של עוברי הדגים השלם מתוארת כאן. הצעד הקריטי ביותר עבור שיטת ההרכבה היא לזהות את הריכוז האופטימלי של agarose כי יאפשר צמיחה בלתי מוגבלת של העובר, ובאותו זמן לשמור על העוברים בעמדה קבועה לחלוטין עבור הדמיה קונפוקלית וקד. מכיוון שהריכוז האו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067
Leica DMi8 fluorescence microscope	Leica	NA
LAS X software	Leica	NA	Microscope software
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Nikon A1S confocal microscope	Nikon Instruments Inc.	NA
Nikon NIS AR Version 4.40	Nikon Instruments Inc.	NA	Microscope software