ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡法の層状取り付け法

要約

この記事では、長時間経過共焦点顕微鏡用に脆弱なゼブラフィッシュ胚を取り付ける方法について説明する。この低コストの方法は、任意の反転顕微鏡でイメージングするための通常のガラス底顕微鏡用皿を使用して簡単に行うことができます。取り付けは、異なる濃度でアガロースの層で行われる。

要約

発達のダイナミクスは、特定の組織または細胞において蛍光を発現する生きているトランスジェニックゼブラフィッシュ胚の共焦点タイムラプス顕微鏡法に続くことができる。全胚のイメージングの難しさは、ゼブラフィッシュ胚が実質的に長くなるということです。0.3~1%低溶融アガロースに定期的に取り付けられると、アガロースは成長制限を課し、軟胚体の歪みにつながります。しかし、共焦点タイムラプス顕微鏡を行うには、胚を固定化する必要があります。この記事では、無制限の成長を可能にしながら胚の運動性を制限するゼブラフィッシュ胚の層状取り付け方法について説明します。取り付けは、異なる濃度でアガロースの層で行われる。この方法のユーザビリティを実証するために、全胚血管、神経および筋肉の発達を55時間連続してトランスジェニック魚に画像化した。この取り付け方法は、金型や特殊装置の要件なしに、反転顕微鏡を使用してゼブラフィッシュ胚全体を簡単かつ低コストでイメージングするために使用できます。

概要

ゼブラフィッシュは長い間発達生物学のモデル生物であり、顕微鏡検査は胚発生を可視化する主要な方法である。発達研究のためにゼブラフィッシュ胚を使用する利点は、小さなサイズ、光学的明瞭さ、急速な発達、および成虫魚の高い胎児性を含む。特定の組織または細胞で蛍光を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュラインの生成は、より大きな脊椎動物では不可能な方法で組織の発達を直接可視化することを可能にした。タイムラプス顕微鏡と組み合わせることで、組織現像の詳細とダイナミクスを容易に研究することができる。

ゼブラフィッシュのイメージングの難しさは、胚が実質的に長くなるということです。胚は、寿命^の最初の3日以内にその長さを4回延長します。また、初期胚の体は柔らかく、成長が制限されると歪みやすくなります。しかし、共焦点顕微鏡を行うには、胚を固定化する必要があります。胚を共焦点タイムラプスイメージングの固定位置に保つために、定期的に麻酔を行い、0.3~1%の低溶融アガロースに取り付けます。これは、胚の動きを制限しながら、一定期間のイメージング中にいくつかの成長を可能にするという利点を有する。胚の一部はこのように効率的に画像化することができる。しかし、この方法を長期間胚全体のイメージングに用いる場合、アガロースによる成長制限により歪みが見られる。したがって、他の取り付け方法が必要です。カウフマンたちは、無濃度のアガロースまたはメチルセルロース²を含むフッ素化エチレンプロピレン(FEP)チューブに胚を取り付けることにより、選択的プレーン照明顕微鏡(SPIM)などの光シート顕微鏡用ゼブラフィッシュ胚の代替実装について説明した。この技術は、時間の経過とともに胚発生の優れた可視化を生成します。Schmid et al. は、1 回のイメージング セッションで複数の胚の可視化を提供する光シート顕微鏡³用FEBチューブ中のアガロース内の最大6個の胚の取り付けについて説明する。金型は、より多くの数の胚⁴を効率的に取り付けるために胚アレイを作成するために使用されてきました。Masselkinkららは、ゼブラフィッシュ胚を異なる段階で配置できるシリコン鋳造物を作るために使用できる3Dプリントプラスチック金型を構築しており、共焦点イメージング⁵を含むイメージングのための一定の位置への取り付けを可能にする。3Dプリンティングはまた、96ウェルフォーマット⁶でゼブラフィッシュ胚の一貫した位置のための金型を作るために使用されています。一部の金型は特定のステージに合わせてカスタマイズされており、長期間無制限に成長できない場合がありますが、他の金型はより柔軟です。最近、Weijtsらゼブラフィッシュ胚の生イメージングのための4ウェル皿のデザインと製作^{を発表しました}7.この料理では、麻酔をかけた魚の胚の尾と幹をカバーガラスのすぐ上に取り付けた透明なシリコーン屋根の下に手動で配置し、ポケットを形成します。胚は、0.4%アガロースを添加することによって、この位置に固定される。この取り付けにより、胚の約2mmの後部(幹および尾部)のイメージングが可能であり、ウェルごとに最大12個の胚を取り付けることができるように、この方法は複数のサンプルのイメージングを可能にする。同様に、ヒルシンガーとスティーブントンは最近、魚の頭部をアガロースに取り付け、尾部を自由に成長させる方法を提示し、この方法はまた、胚⁸の幹および尾部領域のイメージングを効率的に容易にする。

この記事では、無制限の成長を可能にしながら胚の動きを制限するゼブラフィッシュ胚の層状取り付け方法について説明します。この取り付け方法の利点は、任意の反転顕微鏡を用いてイメージングするための様々な段階の胚を取り付ける低コスト、迅速かつ容易な方法である。取り付けは胚の発達の間に全身(頭部、幹および尾)の長期のイメージ投射を可能にする。この方法の使いやすさを示すために、全胚血管、神経および筋肉の発達をトランスジェニック魚に画像化した。セッションあたり2つの胚は、3Dの2つの波長で、組織発達の映画をレンダリングするために55時間連続してタイムラプス顕微鏡によって画像化された。

プロトコル

ここで発表された動物の仕事は、ヒューストン大学とインディアナ大学の制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. 魚の夫

注: 脊椎動物モデルの操作には、IACUC 承認プロトコルが必要です。これは、関連する国内および国際的なガイドラインに従って行われるべきです。

1. 以前に出版された文献⁹で説明されているように、成虫ゼブラフィッシュを維持する。
2. 午後は、繁殖タンクに大人のゼブラフィッシュを置きます。1:2の比率でメスにオスを繁殖させる。

2. ソリューションの作成

1. 胚媒体中の1%低溶融アガロースのストック溶液を作る(E3:5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl 2、0.33 mM MgSO_4、pH7.0に調整)。1.5 mLチューブに原液をアリコートし、4°Cで保存します。
2. 蒸留水中で4%(w/v)トリカイン(MS-222)の原液を作ります。暗いボトルに4°Cで保管してください。
   注意:トリカインは有毒であり、計量し、ヒュームフードに溶解する必要があります。
3. 蒸留水中で20 mM N-フェニルチウラ(PTU)の原液を作ります。-20°Cで保管してください。

3. 胚の調製

1. 交配後、E3で胚をペトリ皿で収穫し、取り付ける前に26.5°Cで約28時間インキュベートします。
   注:これは胚の発達を遅くし、胚がイメージングの開始時に約30ソマイト段階になるようにする。
2. E3の0.016-0.020%トリカインで胚を麻酔する。色素沈着を阻害するには、200μMの濃度にPTUを加えます。
3. 解剖顕微鏡下で鉗子を用いて胚を脱酸させる。2つの鉗子を使用して、グリップし、穏やかに胚を解放するために絨毛を引き離します。

4. アガロースへの取り付け

注:開発された取り付け方法では、必要に応じて0.02%のトリカインとPTUを有するE3の低溶融アガロースの2つの異なる濃度が必要です。最初のアガロース溶液には、歪みと運動性が最小限であるアガロースの最適濃度が含まれています。最適化については、以下のステップ 5 で説明します。

1. 2つの層のアガロース溶液を加熱する(ステップ5で定義された濃度以下および1%)65 °C に変更します。アガロースは、胚が熱によって害を受けないように、取り付けの直前に約30°Cまで冷却します。取り付けには、35 mm ガラス底の皿を 0 番カバーガラス底で使用します。皿の底に取り付けられたカバーガラスは、胚を配置する10ミリメートル浅い(約1.2ミリメートルの深さ)井戸を作成します。
   注:この場合、運動性と歪みが最も少ない濃度は0.025~0.040%のアガロースであった。
2. ガラスピペットまたはマイクロピペットを使用して、皿の底に向かって横側の1つと穏やかにデコリオネート胚を配置します。マイクロピペットを使用する場合は、先端の外側の部分をカットして、胚に合わせて開口部のサイズを大きくします(図1A)。マイクロピペットで残りのE3を慎重に取り外します。
3. 最初のアガロース溶液を、皿の底部に取り付けたカバーガラスによって作成された小さな井戸に追加して胚を覆います(レイヤー1)(図1B)。アガロースが小さな井戸を覆っているが、それをオーバーフローしないことを確認してください。
4. 小さな井戸をカバーガラス(22mm×22mm)(図1C)で覆い、2つのカバーグラスの間に胚を持つ狭いアガロース充填空間を作成します。
5. 皿の底面にカバーガラスの上に1%アガロース溶液の層を置きます(レイヤー2)(図1D)。この層が固化するにつれて、カバーガラスを所定の場所に保持する。
6. 0.02% のトリカインを含む E3 で皿の残りの部分を埋め、システムを水和状態に保ちます (図 1E)。
   注:この設定では、カバーガラスと1%アガロースは、希釈から底層を保護します。

5. 層1のアガロース溶液の最適化

1. レイヤ 1 のアガロースの最適な濃度を特定するには、マルチスケール グリッド検索アプローチを使用します。アガロースの濃度を0.01%から1%に増加させる胚に続いて、胚の成長制限と視野における運動性のタイムラプスイメージングが続く。歪みと運動性の両方が最小である濃度を特定します。
2. アガロースの濃度をさらに最適化するには、ステップ5.1(例えば、0.025%、0.028%、0.028%、0.031%など)で最良であることが判明した濃度に応じて、より細かい範囲のアガロース濃度(例えば、0.025~0.040%アガロース)を用いて胚を取り付けます。
   注:当研究室では、最適なアガロース濃度は0.03%程度でした。

6. タイムラプスイメージング

注:この取り付け方法は、蛍光および明視野イメージングのためのタイムラプス機能を備えた任意の反転顕微鏡で動作します。

1. 胚全体またはその一部に対して最大55時間タイムラプスイメージングを行います。複数の胚のイメージングには、1皿につき1個の胚を取り付けた複数の皿を保持するステージアダプターを使用します。胚が目で決められたようにほぼ水平に配置されるように、皿を1つずつ回転させます。最適な胚の成長と発達のために、28.5 °Cに設定されたインキュベーターを備えた顕微鏡段階を使用してください。
2. 顕微鏡ソフトウェアで低倍率目標を選択します。目の部分の下で、明るいフィールド照明を使用して皿を回転させることによって、胚を水平に見つけて細かく整列させ、ソフトウェアでその位置を記録します。データを自動的に保存するためのファイル名を作成します。
   注:この実験では、ND取得ウィンドウ内の計画apo λ 4x 0.2 NA目標とXYタブを使用して胚の位置を記録しました。データは .nd2 形式で保存されました。目的は、Ti Padタブでそのアイコンをクリックして選択されました。
3. ピンホールサイズ、スキャン速度、画像サイズ、ズームを設定します。次に、画像をキャプチャするための高い倍率目標を選択します。
   注:この実験では、胚全体のイメージングに計画アポ10x 0.45 NA目標を使用し、胚の一部のより高い倍率イメージングにスーパーフルオ20x 0.75 NA目標を使用しました。ピンホールは1.2 AU(10xレンズの場合は19.2μm)に設定され、スキャン速度は2.4μsのピクセルドウェル時間に設定され、画像サイズは1024 x 1024ピクセルに設定され、10xレンズには1.24μmのピクセルサイズが与え、10xレンズのピクセルサイズは1.24μmに設定され、10xレンズには1.24μmのピクセルサイズが与えられた。20xレンズの場合は0.62μm。
4. 画像化する蛍光のチャネルを選択します。イメージ キャプチャの設定を一度に 1 チャンネルずつ調整します。各蛍光チャネルについて、レーザーパワーと検出器の高電圧を調整し、彩度を回避し、光漂白を制限しながら、可能な限り最高のダイナミックレンジを収集するようにしてください。
   注:この実験では、GFPを488グリーンチャンネル(488nmレーザーと500~550nmの発光)、および561赤チャネル(561nmレーザーと570~600nmの発光)でRFPを画像化し、561nmレーザーと透過光検出器(TDチャネル)を用いて伝送画像を収集した。
5. 10倍の目的で胚全体を画像化するには、いくつかの視野を重ね合わせて画像化し、顕微鏡ソフトウェアを使用してそれらを一緒にステッチします。
   注:胚はイメージング中に大きさが大幅に大きくなるので、胚の視野前部および後部にスペースがあることを確認してください。ND取得ウィンドウの[大きな画像をスキャン]タブを使用し、10%の重なりを持つ4 x 1パターンを選択して、隣接する4つの視野をキャプチャします。
6. 顕微鏡ソフトウェアを使用してZスタックをキャプチャするための設定を設定します。
   メモ:胚はガラス皿の底の近くに取り付けられるので、その中心は成長するにつれて底から離れて移動します。ND 取得ウィンドウの[Z]タブを使用し、[非対称相対範囲] を選択します。この方法では、現在のフォーカスプレーンが参照面として使用され、残りの平面は上下に非対称的に分布し、標本の成長を考慮した十分なスペースを持つ Z スタックボリューム内に胚全体を含めます。すべての実験では、間隔は11μmに設定され、合計範囲は約45面に設定されました。
7. 長期タイムラプスイメージング中に複数の胚の焦点を維持するために、自動焦点を使用します。複数の胚をイメージングする場合は、各胚の個々のオフセットレベルを調整して、参照面に焦点を合わせる。
   注:この実験では、レーザーベースの焦点安定化システムを用いた。
8. 顕微鏡ソフトウェアと画像で、約1時間間隔で55時間のタイムラプスパラメータを設定します。各サイクルで、2 つの胚データセットを順番にキャプチャし、各サイクルの後に自動的にデータを保存します。
9. 顕微鏡ソフトウェアのオンラインまたはインラインバージョンを使用して画像を処理します。複数の胚がイメージングされた場合は、イメージングの場所に基づいてデータセットを分割して、各胚に対して独立したファイルを作成します。最大強度投影法または同様のツールを使用して、3D 時間データ セットを 2D 時間データ セットに変換します。[名前を付けて保存] メニュー オプションを使用してムービー ファイルを作成し、ファイル形式として [.avi] を選択します。再生速度を 5 フレーム /秒にするには、[圧縮なし] 間隔を 200 ミリ秒間隔で選択します。
   注: この実験の 2 つの胚の元のデータセットは、ソフトウェアの[位置の分割] 関数を使用して分割されました (File |インポート/エクスポート |マルチポイントの分割)。3D 時間データセットは、最大強度投影関数を使用して 2D 時間データセットに変換されました (Image |ND 処理|Z で最大強度投影イメージを作成します。

結果

取り付け方法の開発
この研究の主な目的は、ゼブラフィッシュ開発のタイムラプスイメージングのための低コストの取り付け技術を長期間開発することでした。層状取り付け方法は、その動きを制限しながら、脆弱なゼブラフィッシュ胚体の完全な成長を可能にするために開発されました。層1のアガロース濃度が高すぎると、胚が歪んで湾曲します(図2)。

ディスカッション

ここでは、ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡検査の取り付け方法について説明する。取り付け方法の最も重要なステップは、無制限のゼブラフィッシュ胚の成長を可能にするアガロースの最適な濃度を特定すると同時に、共焦点イメージングのために胚を完全に固定された位置に保つことです。アガロースの最適濃度は非常に狭いため、この値は、溶液の調製中にア?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067
Leica DMi8 fluorescence microscope	Leica	NA
LAS X software	Leica	NA	Microscope software
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Nikon A1S confocal microscope	Nikon Instruments Inc.	NA
Nikon NIS AR Version 4.40	Nikon Instruments Inc.	NA	Microscope software