Une méthode de montage en couches pour la microscopie confocale de temps-lapse prolongée des embryons entiers de poisson zèbre

Résumé

Cet article décrit une méthode pour monter les embryons fragiles de poisson zèbre pour la microscopie confocale de time-lapse prolongée. Cette méthode à faible coût est facile à exécuter en utilisant des plats de microscopie à fond de verre réguliers pour l'imagerie sur n'importe quel microscope inversé. Le montage est effectué en couches d'agarose à différentes concentrations.

Résumé

La dynamique du développement peut être suivie d'une microscopie confocale en accéléré d'embryons transgéniques vivants de poissons zèbres exprimant la fluorescence dans des tissus ou des cellules spécifiques. Une difficulté avec le développement entier d'embryon d'imagerie est que les embryons de poisson zèbre se développent sensiblement dans la longueur. Lorsqu'elle est montée comme régulièrement fait dans 0.3-1% agarose basse de fonte, l'agarose impose la restriction de croissance, menant aux distorsions dans le corps mou d'embryon. Pourtant, pour effectuer une microscopie confocale en time-lapse, l'embryon doit être immobilisé. Cet article décrit une méthode de montage en couches pour les embryons de poisson zèbre qui limitent la motilité des embryons tout en permettant la croissance sans restriction. Le montage est effectué en couches d'agarose à différentes concentrations. Pour démontrer la facilité d'utilisation de cette méthode, le développement vasculaire, neuronal et musculaire d'embryon entier a été imaged dans les poissons transgéniques pendant 55 heures consécutives. Cette méthode de montage peut être utilisée pour l'imagerie facile et peu coûteuse d'embryons entiers de poisson zèbre à l'aide de microscopes inversés sans exigences de moules ou d'équipement spécial.

Introduction

Le poisson zèbre a longtemps été un organisme modèle pour la biologie du développement, et la microscopie est la principale méthode pour visualiser le développement embryonnaire. Les avantages de l'utilisation d'embryons de poisson zèbre pour les études de développement comprennent la petite taille, la clarté optique, le développement rapide et la fécondité élevée des poissons adultes. La génération de lignées transgéniques de poissons zèbres exprimant la fluorescence dans certains tissus ou cellules a permis une visualisation directe du développement des tissus d'une manière qui n'est pas possible avec les plus grands vertébrés. En combinaison avec la microscopie time-lapse, les détails et la dynamique du développement des tissus peuvent être facilement étudiés.

Une difficulté avec le développement de poisson zèbre d'imagerie est que les embryons se développent sensiblement dans la longueur ; l'embryon étend sa longueur quatre fois dans les 3 premiers jours de la vie¹. En outre, le corps de l'embryon précoce est mou, et devient facilement déformé si la croissance est limitée. Pourtant, pour effectuer une microscopie confocale, l'embryon doit être immobilisé. Pour maintenir les embryons dans une position fixe pour l'imagerie confocale en accéléré, ils sont régulièrement anesthésiés et montés en agarose à faible fonte de 0,3 à 1 %. Cela a l'avantage de permettre une certaine croissance pendant l'imagerie pendant une certaine période de temps, tout en limitant les mouvements de l'embryon. Certaines parties de l'embryon peuvent être efficacement représentées comme ceci. Cependant, lors de l'utilisation de cette méthode pour l'imagerie de l'embryon entier pendant de longues périodes de temps, des distorsions sont observées en raison de la croissance restreinte causée par l'agarose. Ainsi, d'autres méthodes de montage sont nécessaires. Kaufmann et ses collègues ont décrit un montage alternatif d'embryons de poisson zèbre pour la microscopie par feuille de lumière, comme la microscopie sélective d'éclairage d'avion (SPIM), en montant les embryons dans des tubes de propylène d'éthylène fluoré (FEP) contenant de faibles concentrations d'agarose ou de méthylcellulose². Cette technique produit une superbe visualisation de l'embryogenèse au fil du temps. Schmid et coll. décrivent le montage de jusqu'à six embryons dans l'agarose dans les tubes FEB pour la microscopie de feuille de lumière³ fournissant la visualisation de plusieurs embryons dans une session d'imagerie. Les moules ont été utilisées pour créer des tableaux d'embryons pour le montage efficace d'un plus grand nombre d'embryons⁴. Masselkink et coll. ont construit des moules en plastique imprimés en 3D qui peuvent être utilisés pour fabriquer des moulages de silicium dans lequel les embryons de poissons zèbres à différents stades peuvent être placés, permettant le montage dans une position constante pour l'imagerie, y compris l'imagerie confocale⁵. L'impression 3D a également été utilisée pour fabriquer des moules pour un positionnement cohérent des embryons de poissons zèbres dans le format⁶de 96 puits. Certains moules sont personnalisés pour certaines étapes et peuvent ne pas permettre une croissance illimitée pendant de longues périodes, tandis que d'autres moules sont plus flexibles. Récemment, Weijts et coll. ont publié la conception et la fabrication d'un plat à quatre puits pour l'imagerie en direct des embryons de poissons zèbres⁷. Dans ce plat, la queue et le tronc des embryons de poissons anesthésiés sont placés manuellement sous un toit en silicone transparent fixé juste au-dessus d'un verre de couverture pour former une poche. L'embryon est alors fixé dans cette position par l'ajout de 0,4% agarose. Ce montage permet l'imagerie de la partie postérieure d'environ 2 mm de long (tronc et queue) de l'embryon, et comme jusqu'à 12 embryons peuvent être montés par puits, la méthode permet l'imagerie de plusieurs échantillons. De même, Hirsinger et Steventon ont récemment présenté une méthode où la tête du poisson est montée en agarose, tandis que la queue peut se développer librement, et cette méthode facilite également efficacement l'imagerie de la région du tronc et de la queue de l'embryon⁸.

Cet article décrit une méthode de montage en couches pour les embryons de poisson zèbre qui restreignent les mouvements des embryons tout en permettant une croissance illimitée. Les avantages de cette méthode de montage sont qu'il s'agit d'une méthode peu coûteuse, rapide et facile pour monter des embryons de différentes étapes pour l'imagerie à l'aide de n'importe quel microscope inversé. Le montage permet l'imagerie à long terme de l'ensemble du corps (tête, tronc et queue) pendant le développement de l'embryon. Pour mettre en valeur la convivialité de cette méthode, le développement vasculaire, neuronal et musculaire de l'embryon entier a été représenté chez des poissons transgéniques. Deux embryons par session, à deux longueurs d'onde en 3D ont été photographiés par microscopie en time-lapse pendant 55 heures consécutives pour rendre des films de développement de tissu.

Protocole

Le travail animalier présenté ici a été approuvé par les Comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux (CCIA) de l'Université de Houston et de l'Université de l'Indiana.

1. Élevage de poissons

REMARQUE : Le travail avec des modèles de vertébrés nécessite un protocole approuvé par l'IACUC. Elle doit être menée conformément aux directives nationales et internationales pertinentes.

1. Maintenir le poisson zèbre adulte tel que décrit dans la littérature publiée précédemment⁹.
2. L'après-midi, placez le poisson zèbre adulte dans des réservoirs de reproduction. Races mâles/femelles à un rapport de 1:2.

2. Préparation de solutions

1. Faire une solution de stock de 1% de faible fonte agarose dans les médias embryonnaires (E3: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄, ajusté au pH 7,0). Aliquot la solution de stock dans des tubes de 1,5 ml et les stocker à 4 oC.
2. Faire une solution de stock de 4% (w/v) Tricaine (MS-222) dans de l'eau distillée. Conserver à 4 oC dans une bouteille foncée.
   CAUTION: La tricaine est toxique et doit être pesée et dissoute dans une hotte de fumée.
3. Faire une solution de stock de 20 mM N-phénylthiourea (PTU) dans de l'eau distillée. Conserver à -20 oC.

3. Préparation des embryons

1. Après l'accouplement, récoltez les embryons en E3 dans un plat Petri et incubez-les à 26,5 oC pendant environ 28 h avant de monter.
   REMARQUE : Cela ralentit le développement des embryons de sorte que les embryons soient environ à 30 stadesomite au début de l'imagerie.
2. Anesthésiez les embryons en 0,016-0,020% Tricaine dans l'E3. Pour inhiber la pigmentation, ajouter le PTU à une concentration de 200 M.
3. Déchorionate les embryons à l'aide de forceps sous un microscope à disséquer. À l'aide de deux forceps, agrippez-le et tirez doucement le chorion pour libérer l'embryon.

4. Montage en agarose

REMARQUE : La méthode de montage développée exige deux concentrations différentes d'agarose à faible fusion dans l'E3 avec 0,02% de Tricaine et de PTU au besoin. La première solution agarose contient une concentration optimale d'agarose à laquelle la distorsion et la motilité sont au minimum. L'optimisation est décrite à l'étape 5 ci-dessous.

1. Chauffer les solutions d'agarose pour les deux couches (concentration définie à l'étape 5 ci-dessous et 1%) à 65 oC. Laisser l'agarose refroidir à environ 30 oC juste avant le montage afin que l'embryon ne soit pas endommagé par la chaleur. Pour le montage, utilisez des plats à fond de verre de 35 mm avec un fond de verre de couverture no 0. Le verre de couverture fixé au fond du plat crée un puits de 10 mm de profondeur (environ 1,2 mm de profondeur), dans lequel l'embryon doit être placé.
   REMARQUE: Dans ce cas, la concentration avec le moins de motilité et de distorsions se situent entre 0,025 et 0,040% agarose.
2. Placez délicatement un embryon déchorionavec l'un de ses côtés latéraux vers le fond du plat à l'aide d'une pipette en verre ou d'une micropipette. Si vous utilisez une micropipette, couper la partie extérieure de la pointe pour augmenter la taille de l'ouverture pour s'adapter à l'embryon (Figure 1A). Retirez soigneusement l'E3 restant à l'eau avec une micropipette.
3. Ajouter la première solution d'agarose au petit puits créé par le verre de couverture fixé au fond du plat pour couvrir l'embryon (couche 1) (Figure 1B). Assurez-vous que l'agarose couvre le petit puits, mais ne sera pas le déborder.
4. Couvrir le petit puits d'un verre de couverture (22 mm x 22 mm) (Figure 1C) pour créer un espace étroit rempli d'agarose avec l'embryon entre les deux verres de couverture.
5. Placer une couche de 1% de solution d'agarose sur le dessus du verre de couverture sur tout le fond du plat (couche 2) (Figure 1D). Comme cette couche se solidifie, elle maintient le verre de couverture en place.
6. Remplissez la partie restante du plat avec e3 contenant 0,02% de Tricaine pour garder le système hydraté (couche 3) (Figure 1E).
   REMARQUE: Dans cette configuration, le verre de couverture et 1% agarose protéger la couche inférieure de se diluer.

5. Optimisation de la solution agarose pour la couche 1

1. Pour identifier la concentration optimale d'agarose pour la couche 1, utilisez une approche de recherche de grille à plusieurs échelles. Montdes embryons dans des concentrations croissantes d'agarose allant de 0,01% à 1% suivie par l'imagerie en time-lapse de la restriction de la croissance des embryons et la motilité dans le domaine de vision. Identifiez les concentrations où la distorsion et la motilité sont au minimum.
2. Pour optimiser davantage la concentration d'agarose, monter les embryons à l'aide d'une gamme plus fine de concentrations d'agarose (p. ex., entre 0,025 et 0,040% d'agarose) en fonction de la concentration jugée la meilleure à l'étape 5.1 (p. ex. 0,025%, 0,028%, 0,031%, etc.).
   REMARQUE : Dans notre laboratoire, la concentration optimale d'agarose était d'environ 0,03%.

6. Imagerie en accéléré

REMARQUE : Cette méthode de montage fonctionne pour n'importe quel microscope inversé avec la fonctionnalité time-lapse pour la fluorescence et l'imagerie lumineuse de champ.

1. Effectuez l'imagerie en accéléré pour l'embryon entier ou les parties de celui-ci jusqu'à 55 h. Pour l'imagerie de plusieurs embryons, utilisez un adaptateur de scène qui contient plusieurs plats avec un embryon monté par plat. Faites pivoter les plats un par un de sorte que les embryons soient placés à peu près horizontalement selon les yeux. Pour une croissance et un développement optimaux de l'embryon, utilisez un stade de microscope avec un incubateur fixé à 28,5 oC.
2. Sélectionnez un objectif de grossissement faible dans le logiciel de microscope. Sous l'œil, localiser et aligner finement les embryons horizontalement en tournant les plats à l'aide d'un éclairage lumineux du champ et enregistrer leurs emplacements dans le logiciel. Créez un nom de fichier pour l'enregistrement automatique des données.
   REMARQUE : Dans cette expérience, un objectif de plan apo 4x 0.2 NA et l'onglet XY dans la fenêtre d'acquisition ND ont été utilisés pour enregistrer l'emplacement des embryons. Les données ont été enregistrées en format .nd2. L'objectif a été sélectionné en cliquant sur ses icônes dans l'onglet Ti Pad.
3. Définir la taille du sténopé, la vitesse d'analyse, la taille de l'image et le zoom. Ensuite, sélectionnez un objectif de grossissement plus élevé pour capturer les images.
   REMARQUE : Dans cette expérience, un objectif plan-apo 10x 0,45 NA a été utilisé pour l'imagerie d'embryons entiers, et un objectif de super-fluor 20x 0,75 NA a été utilisé pour l'imagerie de grossissement plus élevée de parties de l'embryon. Le trou d'épingle a été fixé à 1,2 UA (19,2 m pour l'objectif 10x), la vitesse d'analyse a été fixée pour un temps de séjour de pixel de 2,4 's et la taille de l'image a été fixée à 1024 x 1024 pixels avec un zoom de balayage d'un, donnant une taille de pixel de 1,24 m pour l'objectif 10x et 0,62 m pour l'objectif 20x.
4. Sélectionnez les canaux pour que la fluorescence soit représentée. Ajustez les paramètres de capture d'image un canal à la fois. Pour chaque canal de fluorescence ajuster la puissance laser et le détecteur de haute tension, en veillant à recueillir la meilleure plage dynamique possible tout en évitant la saturation et en limitant le photoblanchiment.
   REMARQUE: Dans cette expérience, GFP a été photographié avec le canal vert 488, (488 nm laser et l'émission entre 500 et 550 nm), et la DP avec le canal 561 rouge (561 nm laser et l'émission entre 570 et 600 nm), et l'image de transmission a été recueillie à l'aide du laser 561 nm et le détecteur de lumière transmis( canalTD ).
5. Pour imager l'embryon entier avec l'objectif 10x, imagez plusieurs champs de vision avec chevauchement et assemblez-les à l'aide du logiciel de microscope.
   REMARQUE : Comme les embryons croissent considérablement en taille pendant l'imagerie, assurez-vous qu'il y a de l'espace dans le champ de vision antérieur et postérieur à l'embryon. Utilisez l'onglet Scan Large Image de la fenêtre d'acquisition ND et sélectionnez un modèle 4 x 1 avec un chevauchement de 10 % pour capturer quatre champs de vision adjacents.
6. Configurer les paramètres pour capturer les piles Z à l'aide du logiciel microscope.
   REMARQUE : Comme l'embryon est monté près du fond du plat en verre, son centre s'éloignera du fond au fur et à mesure qu'il grandit. Utilisez l'onglet Z de la fenêtre d'acquisition ND et sélectionnez la plage relative asymétrique. Avec cette méthode, le plan de mise au point actuel est utilisé comme plan de référence et le reste des plans sont répartis asymétriquement au-dessus et en dessous pour inclure l'embryon entier dans le volume De la pile Z, avec suffisamment d'espace pour tenir compte de la croissance du spécimen. Dans toutes les expériences, l'intervalle a été fixé à 11 m et la portée totale à environ 45 avions.
7. Afin de maintenir l'accent sur plusieurs embryons pendant l'imagerie time-lapse à long terme, utilisez une mise au point automatisée. Si l'imagerie de plusieurs embryons, ajuster les niveaux de compensation individuels pour chaque embryon de se concentrer sur le plan de référence.
   REMARQUE : Dans cette expérience, un système de stabilisation de mise au point laser a été utilisé.
8. Configurez des paramètres de time-lapse dans le logiciel et l'image de microscope pour une durée de 55 h à environ 1 h d'intervalles. À chaque cycle, capturez deux ensembles de données embryonnaires de façon séquentielle et enregistrez automatiquement les données après chaque cycle.
9. Traiter les images à l'aide d'une version en ligne ou hors ligne du logiciel microscope. Si plus d'un embryon a été photographié, créez des fichiers indépendants pour chaque embryon en fractionnant l'ensemble de données en fonction de l'emplacement de l'imagerie. Utilisez des projections d'intensité maximale ou un outil similaire pour convertir les ensembles de données de temps 3D en ensembles de données de temps 2D. Créez des fichiers de films en utilisant l'option Enregistrer comme menu, en sélectionnant .avi comme format de fichier. Sélectionnez l'option Pas de compression avec des intervalles de 200 ms pour une vitesse de lecture de 5 images /s.
   REMARQUE : Le jeu de données original de deux embryons dans cette expérience a été divisé à l'aide de la fonction d'emplacements Split dans le logiciel (Fichier Importation/Exportation Split Multipoints). Les jeux de données temporels 3D ont été convertis en ensembles de données temporelles 2D à l'aide de la fonction de projection d'intensité maximale (Image Traitement ND Créer l'image de projection d'intensité maximale en Z).

Résultats

Développement de la méthode de montage
L'objectif principal de ce travail était de développer une technique de montage à faible coût pour l'imagerie en accéléré du développement du poisson zèbre pendant de longues périodes de temps. La méthode de montage en couches a été développée pour permettre la pleine croissance du corps fragile d'embryons de poisson zèbre, tout en limitant ses mouvements. Si la concentration d'agarose de la couche 1 est trop élevée, les embryons seront défor...

Discussion

Une méthode de montage pour la microscopie confocale de time-lapse prolongée des embryons entiers de poisson zèbre est décrite ici. L'étape la plus critique pour la méthode de montage est d'identifier la concentration optimale d'agarose qui permettra une croissance sans restriction des embryons de poisson zèbre, et en même temps de garder les embryons dans une position complètement fixe pour l'imagerie confocale. Parce que la concentration optimale d'agarose est très étroite, cette valeur est très sensible au...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067
Leica DMi8 fluorescence microscope	Leica	NA
LAS X software	Leica	NA	Microscope software
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Nikon A1S confocal microscope	Nikon Instruments Inc.	NA
Nikon NIS AR Version 4.40	Nikon Instruments Inc.	NA	Microscope software