Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Montage zerbrechlicher Zebrafischembryonen für eine längere konfokale Zeitraffermikroskopie. Diese kostengünstige Methode ist einfach mit normalen Glasbodenmikroskopie-Geschirr für die Bildgebung auf jedem invertierten Mikroskop durchzuführen. Die Montage erfolgt in Agaroseschichten in unterschiedlichen Konzentrationen.

Zusammenfassung

Auf die Entwicklungsdynamik kann eine konfokale Zeitraffermikroskopie lebender transgener Zebrafischembryonen folgen, die Fluoreszenz in bestimmten Geweben oder Zellen ausdrücken. Ein Problem bei der Bildgebung der entwicklung ganzer Embryonen ist, dass Zebrafischembryonen erheblich in der Länge wachsen. Bei regelmäßiger Montage in 0,3-1% niedriger Schmelzagarose erzwingt die Agarose Wachstumseinschränkungen, was zu Verzerrungen im weichen Embryokörper führt. Doch um eine konfokale Zeitraffermikroskopie durchführen zu können, muss der Embryo immobilisiert werden. Dieser Artikel beschreibt eine geschichtete Montagemethode für Zebrafischembryonen, die die Beweglichkeit der Embryonen einschränken und gleichzeitig das uneingeschränkte Wachstum ermöglichen. Die Montage erfolgt in Agaroseschichten in unterschiedlichen Konzentrationen. Um die Nutzbarkeit dieser Methode zu demonstrieren, wurde die entwicklung von ganzen Embryonen, Neuronalen und Muskeln 55 Stunden lang in transgenen Fischen abgebildet. Dieses Montageverfahren kann zur einfachen, kostengünstigen Abbildung ganzer Zebrafischembryonen mit invertierten Mikroskopen ohne Anforderungen an Formen oder spezielle Ausrüstung eingesetzt werden.

Einleitung

Der Zebrafisch ist seit langem ein Modellorganismus für die Entwicklungsbiologie, und die Mikroskopie ist die wichtigste Methode, um die embryonale Entwicklung zu visualisieren. Die Vorteile der Verwendung von Zebrafischembryonen für Entwicklungsstudien sind geringe Größe, optische Klarheit, schnelle Entwicklung und hohe Fruchtbarkeit der erwachsenen Fische. Die Erzeugung transgener Zebrafischlinien, die Fluoreszenz in bestimmten Geweben oder Zellen exdrücken, hat eine direkte Visualisierung der Gewebeentwicklung auf eine Weise ermöglicht, die bei größeren Wirbeltieren nicht möglich ist. In Kombination mit der Zeitraffermikroskopie lassen sich Details und Dynamiken der Gewebeentwicklung leicht untersuchen.

Ein Problem bei der Bildgebung der Zebrafischentwicklung ist, dass die Embryonen erheblich in der Länge wachsen; der Embryo verlängert seine Länge viermal innerhalb der ersten 3 Tage des Lebens¹. Auch der Körper des frühen Embryos ist weich und wird leicht verzerrt, wenn das Wachstum eingeschränkt wird. Doch um eine konfokale Mikroskopie durchführen zu können, muss der Embryo immobilisiert werden. Um Embryonen in einer festen Position für konfokale Zeitraffer-Bildgebung zu halten, werden sie regelmäßig beäscht und in 0,3-1% niedrigschmelzender Agarose montiert. Dies hat den Vorteil, dass während der Bildgebung für einen bestimmten Zeitraum ein gewisses Wachstum ermöglicht wird, während gleichzeitig die Bewegungen des Embryos eingeschränkt werden. Teile des Embryos können effizient so abgebildet werden. Bei der Verwendung dieser Methode zur Bildgebung des gesamten Embryos über einen längeren Zeitraum werden jedoch Verzerrungen aufgrund des durch die Agarose verursachten eingeschränkten Wachstums beobachtet. Daher sind weitere Montagemethoden erforderlich. Kaufmann und Kollegen haben eine alternative Montage von Zebrafischembryonen für die Lichtbogenmikroskopie beschrieben, wie z.B. die selektive Ebenenbeleuchtungsmikroskopie (SPIM), indem die Embryonen in fluorierten Ethylenpropylen (FEP)-Röhren montiert werden, die geringe Konzentrationen von Agarose oder Methylcellulose²enthalten. Diese Technik erzeugt eine hervorragende Visualisierung der Embryogenese im Laufe der Zeit. Schmid et al. beschreiben die Montage von bis zu sechs Embryonen in Agarose in FEB-Röhren für die Lichtbogenmikroskopie^3, die die Visualisierung mehrerer Embryonen in einer Bildgebungssitzung ermöglicht. Formen wurden verwendet, um Embryo-Arrays für die effiziente Montage einer größeren Anzahl von Embryonen zu erstellen⁴. Masselkink et al. haben 3D-gedruckte Kunststoffformen konstruiert, die verwendet werden können, um Siliziumgüsse herzustellen, in denen Zebrafischembryonen in verschiedenen Stadien platziert werden können, was die Montage in einer konstanten Position für die Bildgebung ermöglicht, einschließlich konfokaler Bildgebung⁵. 3D-Druck wurde auch verwendet, um Formen für die konsistente Positionierung von Zebrafisch-Embryonen im 96-Well-Format⁶zu machen. Einige Formen sind für bestimmte Stufen angepasst und erlauben möglicherweise nicht uneingeschränktes Wachstum für längere Zeiträume, während andere Formen flexibler sind. Vor kurzem veröffentlichten Weijts et al. das Design und die Herstellung einer Vier-Brunnen-Schale für die Live-Bildgebung von Zebrafisch-Embryonen⁷. In dieser Schale werden Schwanz und Rumpf von anästhesierten Fischembryonen manuell unter einem klaren Silikondach platziert, das knapp über einem Deckglas befestigt ist, um eine Tasche zu bilden. Der Embryo wird dann in dieser Position durch die Zugabe von 0,4% Agarose fixiert. Diese Montage ermöglicht die Abbildung des etwa 2 mm langen hinteren Teils (Stamm und Schwanz) des Embryos, und da bis zu 12 Embryonen pro Bohrgut montiert werden können, ermöglicht das Verfahren die Abbildung mehrerer Proben. In ähnlicher Weise präsentierten Hirsinger und Steventon vor kurzem eine Methode, bei der der Kopf des Fisches in Agarose montiert ist, während der Schwanz frei wachsen kann, und diese Methode erleichtert auch effizient die Bildgebung des Rumpf- und Schwanzbereichs des^{Embryos 8}.

Dieser Artikel beschreibt eine geschichtete Montagemethode für Zebrafischembryonen, die die Bewegungen der Embryonen einschränken und gleichzeitig ein uneingeschränktes Wachstum ermöglichen. Die Vorteile dieser Montagemethode sind, dass es sich um eine kostengünstige, schnelle und einfache Methode zur Montage von Embryonen verschiedener Stadien für die Bildgebung mit jedem invertierten Mikroskop handelt. Die Montage ermöglicht eine langzeitige Bildgebung des ganzen Körpers (Kopf, Rumpf und Schwanz) während der Embryoentwicklung. Um die Nutzbarkeit dieser Methode zu zeigen, wurde die entwicklung von ganzen Embryonastagen, Neuronalen und Muskeln in transgenen Fischen dargestellt. Zwei Embryonen pro Sitzung, bei zwei Wellenlängen in 3D, wurden durch Zeitraffermikroskopie für 55 aufeinander folgende Stunden abgebildet, um Filme der Gewebeentwicklung zu rendern.

Protokoll

Die hier vorgestellte Tierarbeit wurde von den Institutional Animal Care and Use Committees (IACUCs) der University of Houston und der Indiana University genehmigt.

1. Fischzucht

HINWEIS: Die Arbeit mit Wirbeltiermodellen erfordert ein von der IACUC zugelassenes Protokoll. Sie sollte nach den einschlägigen nationalen und internationalen Leitlinien durchgeführt werden.

1. Pflegen Sie erwachsene Zebrafische, wie in der zuvor veröffentlichten Literatur^{beschrieben 9}.
2. Am Nachmittag erwachsene Zebrafische in Zuchtbecken aufstellen. Züchtemännchen zu Weibchen im Verhältnis 1:2.

2. Vorbereitung von Lösungen

1. Machen Sie eine Lagerlösung von 1% niedriger Schmelzagarose in Embryomedien (E3: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄, angepasst auf pH 7,0). Aliquot die Lagerlösung in 1,5 ml Rohre und lagern Sie sie bei 4 °C.
2. Machen Sie eine Lagerlösung von 4% (w/v) Tricaine (MS-222) in destilliertem Wasser. Bei 4 °C in einer dunklen Flasche aufbewahren.
   VORSICHT: Tricain ist giftig und sollte gewogen und in einer Dunstabzugshaube gelöst werden.
3. Machen Sie eine Lagerlösung von 20 mM N-Phenylthiourea (PTU) in destilliertem Wasser. Bei -20 °C lagern.

3. Zubereitung von Embryonen

1. Nach der Paarung Embryonen in E3 in einer Petrischale ernten und bei 26,5 °C ca. 28 h vor der Montage bebrüten.
   HINWEIS: Dies verlangsamt die Entwicklung der Embryonen, so dass die Embryonen zu Beginn der Bildgebung ungefähr 30 Jahre alt sind.
2. Anästhetisieren Sie Embryonen in 0,016-0,020% Tricain in E3. Um die Pigmentierung zu hemmen, fügen Sie PTU zu einer Konzentration von 200 M hinzu.
3. Dechorionate die Embryonen mit Zangen unter einem Sezieren Mikroskop. Mit zwei Zangen greifen und ziehen Sie den Chorion vorsichtig auseinander, um den Embryo freizusetzen.

4. Montage in Agarose

HINWEIS: Das entwickelte Montageverfahren erfordert zwei verschiedene Konzentrationen von Niedrigschmelz-Agarose in E3 mit 0,02% Tricain und PTU bei Bedarf. Die erste Agaroselösung enthält eine optimale Konzentration von Agarose, bei der die Verzerrung und Beweglichkeit minimal sind. Die Optimierung wird in Schritt 5 unten beschrieben.

1. Erhitzen Sie die Agarose-Lösungen für die beiden Schichten (Konzentration definiert in Schritt 5 unten und 1%) bis 65 °C. Lassen Sie die Agarose kurz vor der Montage auf ca. 30 °C abkühlen, damit der Embryo durch die Hitze nicht geschädigt wird. Für die Montage verwenden Sie 35 mm Glasbodenschalen mit einem Abdeckungsboden Nr. 0. Das an der Unterseite der Schale befestigte Abdeckglas erzeugt einen 10 mm flachen (ca. 1,2 mm tiefen) Brunnen, in dem der Embryo platziert werden soll.
   HINWEIS: In diesem Fall lag die Konzentration mit der geringsten Beweglichkeit und Verzerrung zwischen 0,025 und 0,040% Agarose.
2. Legen Sie einen dechorionierten Embryo mit einer seiner Seiten mit einer Glaspipette oder Mikropipette vorsichtig zur Unterseite der Schale. Wenn Sie eine Mikropipette verwenden, schneiden Sie den äußeren Teil der Spitze, um die Größe der Öffnung zu erhöhen, um den Embryo zu passen (Abbildung 1A). Entfernen Sie alle verbleibenden E3 sorgfältig mit einer Mikropipette.
3. Fügen Sie die erste Agarose-Lösung zu dem kleinen Brunnen hinzu, der durch das an der Unterseite der Schale befestigte Abdeckglas geschaffen wurde, um den Embryo zu bedecken (Schicht 1)(Abbildung 1B). Stellen Sie sicher, dass die Agarose den kleinen Brunnen bedeckt, aber nicht überfließen wird.
4. Bedecken Sie den kleinen Brunnen mit einem Deckglas (22 mm x 22 mm)(Abbildung 1C), um einen schmalen Agarose gefüllten Raum mit dem Embryo zwischen den beiden Deckgläsern zu schaffen.
5. Legen Sie eine Schicht von 1% Agarose Lösung auf der Oberseite des Deckglases auf der untere Seite der Schale (Schicht 2)(Abbildung 1D). Wenn diese Schicht verfestigt, hält sie das Deckglas an Ort und Stelle.
6. Füllen Sie den restlichen Teil der Schale mit E3, das 0,02% Tricain enthält, um das System hydratisiert zu halten (Schicht 3) (Abbildung 1E).
   HINWEIS: In diesem Setup schützen das Deckglas und 1% Agarose die untere Schicht vor Verdünnung.

5. Optimierung der Agarose-Lösung für Schicht 1

1. Um die optimale Konzentration von Agarose für Layer 1 zu identifizieren, verwenden Sie einen mehrskalen Rastersuchansatz. Mount-Embryonen in zunehmenden Konzentrationen von Agarose im Bereich von 0,01% bis 1%, gefolgt von Zeitraffer-Bildgebung von Embryo-Wachstumsbeschränkung und Beweglichkeit im Sichtfeld. Identifizieren Sie die Konzentrationen, bei denen sowohl die Verzerrung als auch die Beweglichkeit minimal sind.
2. Um die Konzentration von Agarose weiter zu optimieren, montieren Sie die Embryonen mit einem feineren Bereich von Agarosekonzentrationen (z. B. zwischen 0,025 und 0,040% Agarose), je nach der Konzentration, die in Schritt 5.1 am besten ist (z. B. 0,025%, 0,028%, 0,031%, etc.).
   HINWEIS: In unserem Labor lag die optimale Agarosekonzentration bei etwa 0,03%.

6. Zeitraffer-Bildgebung

HINWEIS: Dieses Montageverfahren funktioniert für jedes invertierte Mikroskop mit Zeitrafferfunktionalität für Fluoreszenz und Lichtfeldbildgebung.

1. Zeitraffer-Bildgebung für den gesamten Embryo oder Teile davon für bis zu 55 h durchführen. Für die Bildgebung mehrerer Embryonen verwenden Sie einen Bühnenadapter, der mehrere Gerichte mit einem Embryo pro Schale hält. Drehen Sie die Gerichte nacheinander, so dass die Embryonen ungefähr horizontal positioniert sind, wie vom Auge bestimmt. Für ein optimales Embryowachstum und eine optimale Entwicklung verwenden Sie ein Mikroskopstadium mit einem Inkubator-Set bei 28,5 °C.
2. Wählen Sie ein Objektiv mit niedriger Vergrößerung in der Mikroskopsoftware aus. Unter dem Augenstück, lokalisieren und fein ausrichten die Embryonen horizontal durch Drehen der Gerichte mit hellen Feldbeleuchtung und erfassen ihre Positionen in der Software. Erstellen Sie einen Dateinamen für das automatische Speichern der Daten.
   HINWEIS: In diesem Experiment wurden ein Plan-Apo-Objektiv 4x 0,2 NA und die Registerkarte XY im ND-Erfassungsfenster verwendet, um die Positionen der Embryonen aufzuzeichnen. Die Daten wurden im .nd2-Format gespeichert. Das Ziel wurde ausgewählt, indem Sie auf die Symbole in der Registerkarte Ti Pad klicken.
3. Legen Sie die Lochgröße, die Scangeschwindigkeit, die Bildgröße und den Zoom fest. Wählen Sie als Nächstes ein höheres Vergrößerungsziel für die Aufnahme der Bilder aus.
   HINWEIS: In diesem Experiment wurde ein Plan-Apo-10x 0,45-NA-Objektiv für die Abbildung ganzer Embryonen verwendet, und ein Superfluor-20x 0,75-NA-Objektiv wurde für die höhere Vergrößerungsbildgebung von Teilen des Embryos verwendet. Das Loch wurde auf 1,2 AE (19,2 m für das 10-fache Objektiv) eingestellt, die Scangeschwindigkeit wurde für eine Pixelverweilzeit von 2,4 s eingestellt und die Bildgröße auf 1024 x 1024 Pixel mit einem Scan-Zoom von einem, was eine Pixelgröße von 1,24 'm für das 10x-Objektiv und 0,62 m für das 20-fache Objektiv.
4. Wählen Sie die Kanäle für die fluoreszenz, die abgebildet werden soll. Passen Sie die Einstellungen für die Bildaufnahme jeweils einen Kanal an. Passen Sie für jeden Fluoreszenzkanal die Laserleistung und die Hochspannung des Detektors an, um den bestmöglichen Dynamikbereich zu erfassen und gleichzeitig die Sättigung zu vermeiden und photobleichen zu begrenzen.
   HINWEIS: In diesem Experiment wurde GFP mit dem 488 grünen Kanal (488 nm Laser und Emission zwischen 500 und 550 nm) und RFP mit dem 561 roten Kanal (561 nm Laser und Emission zwischen570 und 600 nm) abgebildet, und das Übertragungsbild wurde mit dem 561 nm Laser und dem Übertragenlichtdetektor(T D-Kanal)gesammelt.
5. Um den gesamten Embryo mit dem 10-fachen Objektiv abzubilden, bilden Sie mehrere Sichtfelder mit Überlappung ab und nähen sie mit der Mikroskopsoftware zusammen.
   HINWEIS: Da die Embryonen während der Bildgebung erheblich an Größe zunehmen, stellen Sie sicher, dass es Platz im Sichtfeld vor und hinter dem Embryo gibt. Verwenden Sie die Registerkarte Großes Bild scannen des ND-Erfassungsfensters, und wählen Sie ein 4 x 1-Muster mit 10 % Überlappung aus, um vier benachbarte Ansichtsfelder zu erfassen.
6. Konfigurieren Sie die Einstellungen für die Erfassung der Z-Stacks mit der Mikroskopsoftware.
   HINWEIS: Da der Embryo in der Nähe des Bodens der Glasschale montiert ist, bewegt sich sein Zentrum vom Boden weg, während er wächst. Verwenden Sie die Registerkarte Z des ND-Erfassungsfensters, und wählen Sie den asymmetrischen relativen Bereich aus. Bei dieser Methode wird die aktuelle Fokusebene als Referenzebene verwendet und der Rest der Ebenen ist asymmetrisch über und unten verteilt, um den gesamten Embryo innerhalb des Z-Stack-Volumens einzuschließen, mit genügend Platz, um das Wachstum der Probe zu berücksichtigen. In allen Experimenten wurde das Intervall auf 11 m und der Gesamtbereich auf etwa 45 Ebenen eingestellt.
7. Um den Fokus mehrerer Embryonen während der Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung zu erhalten, verwenden Sie einen automatisierten Fokus. Wenn Sie mehrere Embryonen bildgeben, passen Sie die einzelnen Offset-Werte für jeden Embryo an, um sich auf die Referenzebenezu konzentrieren.
   HINWEIS: In diesem Experiment wurde ein laserbasiertes Fokusstabilisierungssystem eingesetzt.
8. Zeitrafferparameter in der Mikroskopsoftware und im Bild für eine Dauer von 55 h in ca. 1 h Intervallen einrichten. Erfassen Sie in jedem Zyklus zwei Embryo-Datasets sequenziell und speichern Sie Daten automatisch nach jedem Zyklus.
9. Verarbeiten Sie Bilder mit einer Online- oder Off-Line-Version der Mikroskopsoftware. Wenn mehr als ein Embryo abgebildet wurde, erstellen Sie unabhängige Dateien für jeden Embryo, indem Sie den Datensatz basierend auf dem Speicherort der Bildgebung aufteilen. Verwenden Sie Projektionen mit maximaler Intensität oder ein ähnliches Werkzeug, um 3D-Zeitdatensätze in 2D-Zeitdatensätze umzuwandeln. Erstellen Sie Filmdateien, indem Sie die Menüoption Speichern als verwenden und .avi als Dateiformat auswählen. Wählen Sie die Option Keine Komprimierung mit 200 ms Intervallen für eine Wiedergabegeschwindigkeit von 5 Frames /s.
   ANMERKUNG: Der ursprüngliche Datensatz von zwei Embryonen in diesem Experiment wurde mit der Split-Locations-Funktion in der Software geteilt (Datei | Import/Export | Split Multipoints). 3D-Zeitdatensätze wurden mithilfe der Projektionsfunktion Maximale Intensität in 2D-Zeitdatensätze konvertiert ( Bild| ND-Verarbeitung| Erstellen Sie ein Projektionsbild mit maximaler Intensität in Z).

Ergebnisse

Entwicklung des Montageverfahrens
Das Hauptziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer kostengünstigen Montagetechnik für die Zeitraffer-Bildgebung der Zebrafischentwicklung über einen längeren Zeitraum. Die geschichtete Montagemethode wurde entwickelt, um das volle Wachstum des zerbrechlichen Zebrafisch-Embryokörpers zu ermöglichen und gleichzeitig seine Bewegungen einzuschränken. Wenn die Agarosekonzentration der Schicht 1 zu hoch ist, werden die Embryonen verzerrt und gekrümmt (

Diskussion

Hier wird ein Montageverfahren zur erweiterten zeitraffenenkonfokalen Mikroskopie ganzer Zebrafischembryonen beschrieben. Der wichtigste Schritt für die Montagemethode besteht darin, die optimale Konzentration von Agarose zu identifizieren, die ein uneingeschränktes Wachstum von Zebrafischembryonen ermöglicht und gleichzeitig die Embryonen in einer vollständig fixierten Position für die konfokale Bildgebung hält. Da die optimale Konzentration von Agarose sehr gering ist, ist dieser Wert sehr empfindlich auf die Feh...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067
Leica DMi8 fluorescence microscope	Leica	NA
LAS X software	Leica	NA	Microscope software
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Nikon A1S confocal microscope	Nikon Instruments Inc.	NA
Nikon NIS AR Version 4.40	Nikon Instruments Inc.	NA	Microscope software