전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법

요약

이 문서에서는 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위해 깨지기 쉬운 제브라피시 배아를 장착하는 방법에 대해 설명합니다. 이 저가형 방법은 모든 반전된 현미경에 이미징을 위해 일반 유리 바닥 현미경 접시를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 장착은 다른 농도에서 아가로즈의 층에서 수행됩니다.

초록

발달의 역학은 특정 조직 또는 세포에 형광을 발현하는 살아있는 형질전환 제브라피시 배아의 공초점 시간 경과 현미경 검사법에 의해 뒤따를 수 있습니다. 화상 진찰 전체 배아 발달을 가진 어려움은 zebrafish 태아가 길이에서 실질적으로 증가한다는 것입니다. 0.3-1% 낮은 용융 아가로스에서 정기적으로 장착할 때, 아가로세는 성장 제한을 가하여 부드러운 배아 체체의 왜곡을 초래합니다. 그러나 공초점 시간 경과 현미경 검사를 수행하려면 배아를 고정시켜야합니다. 이 기사에서는 무제한 성장을 허용하면서 배아의 운동성을 제한하는 제브라피시 배아의 층상 장착 방법을 설명합니다. 장착은 다른 농도에서 아가로즈의 층에서 수행됩니다. 이 방법의 유용성을 입증하기 위해, 전체 배아 혈관, 신경 및 근육 발달은 55시간 연속으로 형질전환 어류에서 영상화되었다. 이 장착 방법은 금형이나 특수 장비의 요구 사항없이 반전 된 현미경을 사용하여 전체 얼룩말 배아의 쉽고 저렴한 이미징에 사용할 수 있습니다.

서문

제브라피쉬는 오랫동안 발달 생물학의 모델 유기체였으며, 현미경 검사법은 배아 발달을 시각화하는 주요 방법입니다. 발달 연구를 위해 zebrafish 배아를 사용하는 장점은 작은 크기, 광학 선명도, 빠른 개발 및 성인 어류의 높은 배변성을 포함합니다. 특정 조직 또는 세포에서 형광을 발현하는 형질전환 제브라피시 라인의 생성은 더 큰 척추동물로는 불가능한 방법으로 조직 발달을 직접 시각화할 수 있게 하였다. 시간 경과 현미경 검사법과 함께, 조직 발달의 세부 사항 및 역학을 쉽게 연구 할 수 있습니다.

화상 진찰 zebrafish 발달을 가진 어려움은 배아가 길이에서 실질적으로 증가한다는 것입니다; 태아는 수명^1의첫번째 3 일 안에 그것의 길이를 4 시간 연장합니다. 또한, 초기 배아의 몸은 부드럽고 성장이 제한되면 쉽게 왜곡됩니다. 그러나 공초점 현미경 검사를 수행하려면 배아를 고정시켜야합니다. 공초점 시간 경과 화상 진찰을 위한 고정된 위치에 배아를 지키기 위하여는, 그(것)들은 정규로 마취되고 0.3-1% 저용융 아가로즈에 거치됩니다. 이것은 태아의 운동을 제한하는 동안 특정 기간 동안 화상 진찰 도중 약간의 성장을 허용하는 이점이 있습니다. 배아의 부분은 이같이 능면화될 수 있습니다. 그러나, 장기간 동안 전체 배아의 화상 진찰을 위해 이 방법을 사용할 때, agarose에 기인한 제한된 성장 때문에 왜곡이 관찰됩니다. 따라서 다른 장착 방법이 필요합니다. Kaufmann 및 동료는 가로오스 또는 메틸셀룰로오스 2의 낮은 농도를 포함하는 불소 에틸렌 프로필렌 (FEP) 튜브에 배아를 장착함으로써 선택적 평면 조명 현미경 검사법 (SPIM)과 같은 가벼운시트 현미경 검사법에 대한 제브라피시 배아의 대체 장착을 설명했다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 배아 발생의 뛰어난 시각화를 생성합니다. Schmid 등은 1개의 화상 진찰 세션에서 몇몇 태아의 가시화를 제공하는 빛 시트 현미경 검사법^3를 위한 FEB 관에 있는 아가로제에 있는 최대 6개의 배아의 설치를 기술합니다. 금형은 배아의 큰 숫자의 효율적인 장착을위한 배아 배열을 만드는 데 사용되었습니다^4. Masselkink 등은 다양한 단계에서 제브라피시 배아를 배치할 수 있는 실리콘 주조를 만드는 데 사용할 수 있는 3D 프린팅 플라스틱 금형을 구성하여 공초점^이미징을포함한 이미징을 위한 일정한 위치에 장착할 수 있습니다 5. 3D 프린팅은 또한 96웰 포맷^6에서제브라피시 배아의 일관된 포지셔닝을 위한 금형을 만드는 데 사용되었습니다. 일부 금형은 특정 단계에 맞게 사용자 정의되며 장기간 무제한 성장을 허용하지 않을 수 있지만 다른 금형은 더 유연합니다. 최근, Weijts 등은 제브라피시 배아의 라이브 이미징을 위한 4웰 접시의 설계 및^제작을7. 이 요리에서는 마취 된 물고기 배아의 꼬리와 줄기가 커버 유리 바로 위에 부착 된 투명한 실리콘 지붕 아래에 수동으로 배치되어 주머니를 형성합니다. 배아는 0.4% 아가로스를 첨가하여 이 위치에 고정된다. 이 장착은 배아의 약 2 mm 긴 후방 부분 (트렁크 및 꼬리)의 이미징을 허용하고, 최대 12 개의 배아가 잘 당 장착 될 수 있으므로, 방법은 여러 샘플의 이미징을 허용합니다. 마찬가지로, Hirsinger와 Steventon은 최근 꼬리가 자유롭게 자랄 수 있는 동안 물고기의 머리가 아가로오스에 장착되는 방법을 제시했으며,이 방법은 또한 배아^8의트렁크 및 꼬리 부위의 이미징을 효율적으로 용이하게합니다.

이 기사에서는 무제한 성장을 허용하면서 배아의 움직임을 제한하는 제브라피시 배아의 층상 장착 방법을 설명합니다. 이 장착 방법의 장점은 모든 반전 된 현미경을 사용하여 이미징을위한 다양한 단계의 배아를 장착하는 저비용, 빠르고 쉬운 방법입니다. 장착은 배아 발달 도중 전신 (머리, 트렁크 및 꼬리)의 장기 적인 화상 진찰을 허용합니다. 이 방법의 유용성을 보여주기 위해, 전체 배아 혈관, 신경 및 근육 발달은 형질전환 어류에서 이미지화되었다. 세션당 2개의 배아, 3D의 2개의 파장에서 55시간 연속시간 경과 현미경검사법에 의해 이미지화되어 조직 발달의 영상을 렌더링하였습니다.

프로토콜

여기에 제시 된 동물 작품은 휴스턴 대학과 인디애나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUCs)에 의해 승인되었습니다.

1. 생선 축산

참고: 척추동물 모델로 작업하려면 IACUC 승인 프로토콜이 필요합니다. 관련 국내 및 국제 지침에 따라 수행해야 합니다.

1. 이전에 출판된 문헌^9에설명된 바와 같이 성체 얼룩말어를 유지한다.
2. 오후에는 성인용 제브라피시를 번식탱크에 놓습니다. 1:2의 비율로 암컷에 남성을 번식.

2. 솔루션 준비

1. 배아 매체에서 1% 낮은 용융 아가로즈의 스톡 용액을 만드십시오 (E3 : 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl_2,0.33 mM MgSO_4,pH 7.0으로 조정). 스톡 용액을 1.5 mL 튜브에 Aliquot하고 4 °C에 보관하십시오.
2. 증류수에서 4%(v) 트리카인(MS-222)의 재고 용액을 만드십시오. 어두운 병에 4 °C에서 보관하십시오.
   주의: 트리카인은 독성이 있으며 무게를 측정하고 연기 후드에 용해시켜야 합니다.
3. 증류수에서 20 mM N-페닐티우레아 (PTU)의 재고 용액을 만드십시오. -20 °C에서 보관하십시오.

3. 배아의 준비

1. 짝짓기 후, 페트리 접시에 E3에서 배아를 수확하고 장착하기 전에 약 28 시간 동안 26.5 °C에서 배양한다.
   참고: 이것은 태아가 화상 진찰의 시작에 대략 30 somite 단계에 이다 는 것을 그래서 태아의 발달을 감속합니다.
2. E3에서 0.016-0.020 % 트리카인에서 배아를 마취하십시오. 색소 침착을 억제하려면 PTU를 200 μM의 농도에 추가하십시오.
3. 해부 현미경으로 집게를 사용하여 배아를 초질. 두 개의 집게를 사용하여, 그립과 부드럽게 배아를 해제 하기 위해 떨어져 융기를 당겨.

4. 아가로즈에 장착

참고: 개발된 마운팅 방법은 필요에 따라 0.02% 트리카인과 PTU를 가진 E3에서 저용융 아가로스의 두 가지 농도가 필요합니다. 첫 번째 아가로즈 용액은 왜곡과 운동성이 최소한인 아가로스의 최적의 농도를 함유하고 있습니다. 최적화는 아래 5단계에서 설명합니다.

1. 두 층(5단계에서 정의된 농도) 및 1%에 대해 아가로즈 용액을 가열합니다. 65 °C. 아가로즈를 장착 직전에 약 30°C까지 식혀 배아가 열에 의해 해를 입지 않도록 하십시오. 장착시, No. 0 커버 유리 바닥이 있는 35mm 유리 바닥 접시를 사용하십시오. 접시의 바닥에 부착 된 커버 유리는 배아를 배치할 10mm 얕은 (약 1.2mm 깊이)을 잘 만듭니다.
   참고: 이 경우, 운동성 및 왜곡이 가장 적은 농도는 0.025~0.040% 아가로즈 사이였다.
2. 유리 피펫이나 마이크로 파이펫을 사용하여 접시의 바닥으로 측면 중 하나를 사용하여 dechorioned 배아를 부드럽게 놓습니다. 마이크로파이펫을 사용하는 경우, 배아에 맞게 개구부 크기를 증가시키기 위해 팁의 바깥 부분을 절단한다(도1A). 마이크로파이펫으로 남은 E3를 조심스럽게 제거하십시오.
3. 배아를 덮기 위해 접시의 바닥에 부착된 커버 유리에 의해 생성된 작은 우물에 제1 아가로즈 용액을 첨가한다(Layer 1)(도1B). 아가로즈가 작은 우물을 덮지만 넘지 않도록 하십시오.
4. 커버 글래스(22 mm x 22 mm)로 작은 우물을 덮어(도1C)를두 개의 커버 안경 사이에 배아로 채워진 좁은 아가로즈 공간을 조성한다.
5. 접시 의 바닥 전체에 커버 유리의 상단에 1 % 아가로즈 용액의 층을 놓습니다 (층 2)(그림 1D). 이 층이 굳어지면 커버 유리를 제자리에 고정시됩니다.
6. 접시의 나머지 부분을 0.02% 트리카인을 함유한 E3로 채우어 시스템을 수화(층 3)(도1E)로유지한다.
   참고: 이 설정에서 커버 글래스와 1% 아가로즈는 바닥 층이 희석되지 않도록 보호합니다.

5. 계층 1에 대한 아가로즈 솔루션의 최적화

1. 계층 1에 대한 아가로즈의 최적 농도를 식별하려면 다중 스케일 그리드 검색 방법을 사용합니다. 아가로즈의 농도가 0.01%에서 1%로 증가하는 데 서 배아를 탑재한 다음, 시야에서 배아 성장 제한 및 운동성의 시간 경과 이미징이 뒤따릅니다. 왜곡과 운동성이 모두 최소인 농도를 식별합니다.
2. 아가로즈의 농도를 더욱 최적화하기 위해, 5.1단계에서 가장 좋은 것으로 밝혀진 농도에 따라 아가로스의 농도(예를 들어, 0.025~0.040% 아가로즈)의 미세한 농도 범위를 사용하여 배아를 장착한다(예를 들어, 0.025%, 0.028%, 0.031%, 등).
   참고 : 우리의 실험실에서, 최적의 아가로즈 농도는 약 이었다 0.03%.

6. 타임랩스 이미징

참고: 이 장착 방법은 형광 및 밝은 필드 이미징을 위한 타임랩스 기능을 갖춘 모든 반전된 현미경에 작동합니다.

1. 최대 55 시간 동안 전체 배아 또는 그것의 부분에 대한 시간 경과 이미징을 수행합니다. 여러 배아의 이미징을 위해 접시당 하나의 배아가 장착된 여러 접시를 담는 스테이지 어댑터를 사용하십시오. 배아가 눈으로 결정된 대로 대략 수평으로 위치되도록 접시를 하나씩 회전시다. 최적의 배아 성장 및 발달을 위해 28.5°C로 설정된 인큐베이터를 사용하여 현미경 단계를 사용하십시오.
2. 현미경 소프트웨어에서 낮은 배율 목표를 선택합니다. 눈 조각 아래에서 밝은 필드 조명을 사용하여 접시를 회전시켜 배아를 수평으로 찾고 미세하게 정렬하고 소프트웨어에서 위치를 기록합니다. 데이터를 자동으로 저장하기 위한 파일 이름을 만듭니다.
   참고: 본 실험에서, 계획 apo λ 4x 0.2 NA 대물및 ND 획득 창 내의 XY 탭을 사용하여 배아의 위치를 기록하였다. 데이터는 .nd2 형식으로 저장되었습니다. 목표는 Ti 패드 탭에서 아이콘을 클릭하여 선택되었습니다.
3. 핀홀 크기, 스캔 속도, 이미지 크기 및 확대/축소를 설정합니다. 다음으로 이미지를 캡처할 때 더 높은 배율 목표를 선택합니다.
   참고: 본 실험에서, 전체 배아의 이미징에 계획-아포 10x 0.45 NA 목표가 사용되었고, 초형플루어 20x 0.75 NA 대물렌즈를 배아 부분의 더 높은 배율 이미징에 사용하였다. 핀홀은 1.2AU(10x 렌즈의 경우 19.2 μm)로 설정되었으며, 스캔 속도는 2.4 μs의 픽셀 거주 시간 동안 설정되었고 이미지 크기는 스캔 줌으로 1024 x 1024 픽셀로 설정되었으며, 10x 렌즈의 경우 1.24 μm의 픽셀 크기를 제공하며, 20x 렌즈의 경우 0.62 μm.
4. 이미지할 형광 채널을 선택합니다. 한 번에 하나의 채널에 이미지 캡처 설정을 조정합니다. 각 형광 채널에 대해 레이저 전력과 검출기 고전압을 조정하여 채도를 피하고 광 표백을 제한하면서 가능한 최상의 동적 범위를 수집하십시오.
   참고: 본 실험에서, GFP는 488 개의 녹색 채널(488 nm 레이저 및 500~550nm 사이 방출) 및 561 적색 채널(561 nm 레이저 및 570~600 nm 사이 방출)을 이용한 RFP로 이미지화되었고, 전송 이미지는 561 nm 레이저 및 투과광검출기(T)를 사용하여 수집하였다.
5. 전체 배아를 10배 의 목표로 이미지화하기 위해, 현미경 소프트웨어를 사용하여 여러 시야를 겹치게 하고 함께 스티치합니다.
   참고: 배아가 이미징 중에 크기가 상당히 커지기 때문에 배아의 전방 및 후방 시야에 공간이 있는지 확인하십시오. ND 수집 창의 큰 이미지 스캔 탭을 사용하고 10% 겹치는 4 x 1 패턴을 선택하여 인접한 4개의 뷰 필드를 캡처합니다.
6. 현미경 소프트웨어를 사용하여 Z 스택을 캡처하기 위한 설정을 구성합니다.
   참고 : 배아는 유리 접시의 바닥에 가깝게 장착되기 때문에, 그 중심은 성장함에 따라 바닥에서 멀리 이동합니다. ND 수집 창의 Z 탭을 사용하고 비대칭 상대 범위를선택합니다. 이 방법을 사용하면 현재 포커스 평면이 참조 평면으로 사용되고 나머지 평면은 Z 스택 부피 내에서 전체 배아를 포함하기 위해 위와 아래에 비대칭으로 분포되어 표본의 성장을 고려할 충분한 공간이 있습니다. 모든 실험에서, 간격은 11 μm및 약 45개의 평면으로 총 범위를 설정하였다.
7. 장기 시간 경과 화상 진찰 도중 다중 태아의 초점을 유지하기 위하여는, 자동화한 포커스를 이용하십시오. 여러 배아를 이미징하는 경우 각 배아의 개별 오프셋 수준을 조정하여 참조 평면에초점을 맞춥니다.
   참고: 이 실험에서는 레이저 기반 초점 안정화 시스템이 사용되었습니다.
8. 약 1시간 간격으로 55시간 동안 현미경 소프트웨어 및 이미지에서 타임랩스 파라미터를 설정합니다. 각 주기마다 두 개의 배아 데이터 집합을 순차적으로 캡처하고 각 주기 후에 자동으로 데이터를 저장합니다.
9. 현미경 소프트웨어의 온라인 또는 오프라인 버전을 사용하여 이미지를 처리합니다. 하나 이상의 배아가 이미지화된 경우, 이미징 위치에 따라 데이터 집합을 분할하여 각 배아에 대해 독립적인 파일을 만듭니다. 최대 강도 투영 또는 이와 유사한 도구를 사용하여 3D 시간 데이터 세트를 2D 시간 데이터 세트로 변환합니다. 메뉴로 저장 옵션을 사용하여 .avi를 파일 형식으로 선택하여 동영상 파일을 만듭니다. 5프레임/s의 재생 속도에 대해 200ms 간격으로 압축 없음 옵션을 선택합니다.
   참고 : 이 실험에서 두 배아의 원래 데이터 세트는 소프트웨어의 분할 위치 함수를 사용하여 분할되었습니다(파일 | 가져오기/내보내기 | 멀티포인트 분할). 3D 시간 데이터 세트를 최대 강도 프로젝션 기능을 사용하여 2D 시간 데이터 세트로 변환했습니다(이미지| ND 프로세싱 | Z)에서 최대 강도 투영 이미지를 만듭니다.

결과

마운팅 방법의 개발
이 작업의 주요 목적은 장기간 제브라피시 개발의 시간 경과 이미징을 위한 저비용 장착 기술을 개발하는 것이었습니다. 층상 장착 방법은 깨지기 쉬운 얼룩말 배아 몸체의 완전한 성장을 허용하면서 움직임을 제한하기 위해 개발되었습니다. 층 1의 아가로즈 농도가 너무 높으면 배아가 왜곡되고 구부러지게됩니다(그림 2). 0.1%와 0.5%로 자?...

토론

전체 제브라피시 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법에 대한 장착 방법이 여기에 설명되어 있다. 장착 방법에 대한 가장 중요한 단계는 무제한 제브라피시 배아 성장을 허용하는 아가로즈의 최적 농도를 식별하는 동시에 공초점 이미징을 위해 배아를 완전히 고정 된 위치에 유지하는 것입니다. 아가로즈의 최적 농도가 매우 좁기 때문에, 이 값은 용액을 제조하는 동안 아가로오스의 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
Micro cover glass 22x22 mm	VWR	48366 067
Leica DMi8 fluorescence microscope	Leica	NA
LAS X software	Leica	NA	Microscope software
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Nikon A1S confocal microscope	Nikon Instruments Inc.	NA
Nikon NIS AR Version 4.40	Nikon Instruments Inc.	NA	Microscope software