בלתי מימדית כמו לשעבר שיטת Vivo לנתח מסלולים מעורב הקודקוד הקודקודית התא ההפעלה

Summary

מאמר זה מתאר שיטה עבור culturing וניתוח החוצה הקודקוד הקודקודית תא האפיתל של פקולי כדורית מבודדים מכליה העכבר. שיטה זו יכולה לשמש לחקר מסלולים המעורבים התפשטות התא הקודקודית והגירה.

Abstract

תא האפיתל הקודקוד (הפעלה) הוא אחד הגורמים העיקריים המעורבים בפיתוח והתקדמות של טרשת נפוצה. עיכוב של מסלולים המעורבים ההפעלה התא אפיתל הקודקוד יכול אפוא להיות כלי כדי להחליש את ההתקדמות של מחלות פקפיות. מאמר זה מתאר שיטה לתרבות ולנתח את הצמיחה של תא אפיתל הקודקוד של פקולי כדורית מבודדים מכליה העכבר. לאחר ניתוח כליות מבודדות של העכבר, הרקמה היא כתוש, ו גלואראולי מבודדים על ידי ניפוי. פקאולי באנקפסולציה נאספים, ו פקולי בודד הם מתורבתים עבור 6 ימים כדי לקבל את הצמיחה של התאים הקודקודית של תאי אפיתל. במהלך תקופה זו, התפשטות הדופן הקודקודית והגירה ניתן לנתח על ידי קביעת מספר התא או שטח המשטח של תאים מתרחב. לפיכך, ניתן להשתמש באפשרות זו ככלי לחקר ההשפעות של ביטוי גנטי משתנה בטרנסגניים-או בעכברים או בהשפעות של תנאי התרבות על מאפייני הצמיחה של תאים אפיתל הקודקוד ואיתות. באמצעות שיטה זו, מסלולים חשובים המעורבים בתהליך של הפעלת תא אפיתל הקודקוד וכתוצאה מכך ניתן ללמוד טרשת נפוצה.

Introduction

מחלות פקבוליות הם קבוצה חשובה של הפרעות כליות ומייצגים הגורם העיקרי של מחלת כליות בשלב הסיום (ESRD). למרבה הצער, אפשרויות טיפול ספציפיות מוגבלות התקדמות כדי ESRD הוא בלתי נמנע. מחלות פקפיות מוגדרות על ידי נוכחות של פציעה פקפיות וניתן לקבץ במחלות דלקתיות ושאינן דלקתיות. למרות העלבון הראשוני הוא שונה, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי מנגנון הסלולר המשותף מוביל היפרפלזיה תאית האפיתל התאים ובסופו של דבר כדי גלולוולוטרשת בכל מחלות פקאיות, ללא קשר לגורם הבסיסי^1,2,3,4.

באופן ספציפי, זה הוכח כי נגעים גלובליים מורכבים בעיקר של הפעלת תאים אפיתל הקודקוד^5,6. התאים האפיתל הם שטוחים בתאים. שעומדים בתור הקפסולה של באומן עם זאת, כל פציעה גלובציט או בגלל מוטציות גנטיות (למשל, מסוים או cytopathies ספציפי או מיטוכונדריאלי), דלקת או היפרסינון (למשל, נגרמת על ידי מסה כליות מופחתת, יתר לחץ דם, השמנה או סוכרת) יכול להפעיל את ההפעלה של תאים אפיתל הקודקוד. תאי אפיתל הופעל הקודקוד מתרבים הפקדה לחילוץ מטריקס אשר תוצאות היווצרות של crescents סלולריים או נגעים מאוים^5,7,8. ההתקדמות של תהליכים אלה גורמת לאובדן תפקוד הכליות⁹. לכן, ההפעלה תא אפיתל הקודקוד הוא גורם מפתח בפיתוח והתקדמות של טרשת נפוצה במחלות פקפיות דלקתיות ולא דלקתיות,^1,2,3,4,10.

התהליכים המולקולריים של הפעלת תאי האפיתל הקודקודית עדיין אינם ידועים ברובו. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי הופעל תאים אפיתל הקודקוד דה נובו אקספרס CD44, קולטן כי חשוב להפעלת מסלולים שונים המעורבים התפשטות הסלולר והגירה. יתר על כן, עיכוב של CD44 הוכח לעכב את ההפעלה תא אפיתל הקודקוד והחליש את ההתקדמות של היווצרות הסהר לבין טרשת נפוצה במודלים של בעלי חיים של דלקת, כמו גם מחלות פקפיות דלקתיות לא דלקתית^11,12.

כמו ההפעלה תא האפיתל הקודקוד הוא נגן מפתח לפיתוח של טרשת נפוצה והיווצרות הסהר, עיכוב של תאים אלה יכול להאט את ההתקדמות של מחלות פקפיות. ההסבר של מסלולים מולקולריים הנהיגה הקודקודית התא ההפעלה עלולה להוביל לפיתוח של התערבויות טיפוליות ספציפיות כי החליש את היווצרות של הנגעים hyperplastic ו גלובאפיללותטיות במחלות פקפיות.

בדגמי בעלי חיים ניסיוניים, קשה לעתים קרובות לספק ראיות להשפעה ישירה של ביטוי גנטי משתנה (מודלים של מודלים או העכבר הטרנסגניים) או טיפול תרופתי בתאי האפיתל הקודקודית. בתוך העכבר הרגיל להוריד את הנצפים שינויים vivo עשוי להיות מוסבר על ידי שינויים ישירים בתאי אפיתל הקודקוד. עם זאת, מאחר שביטוי הגנים משתנה גם בסוגי תאים אחרים בתוך העכבר, אין אפשרות לכלול אפקטים עקיפים המתווכת על-ידי סוגי תאים אחרים. התפתחות של עכברים מותנה -לקס מונע על ידי יזמים פעילים בעיקר בתאי אפיתל הקודקוד סיפק פתרון במקרים מסוימים¹³. עם זאת, מודלים טרנסגניים מותנים הם מורכבים ולמרות שקווים מותנים יותר הופכים לזמינים, עבור רבים מקווי העכבר הרגילים או הטרנסגניים, אין עדיין תחליף מותנה.

כדי ללמוד את ההשפעות הישירות על התאים האפיתל הקודקודית, הקבוצה שלנו פיתחה שיטת vivo ex באמצעות בודד כדורית לשעבר מבודדים מכליות העכבר כדי למדוד ולנתח את התפשטות התא אפיתל הקודקוד והגירה. שיטה זו תאפשר לנו לקבוע הקודקודית תא האפיתל אפקטים ספציפיים כדי למצוא מסלולים אחראיים ההפעלה התא אפיתל הקודקוד ולבדוק אפשרויות טיפול כדי לעכב את ההפעלה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ניסויי החיות בוצעו על פי ההנחיות של ועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת רדבעוד בניימכן.

הערה: עכברים שאינם מטופלות, מסוג פראי בריא (n = 4) ו -cd44-/- (n = 4) הוקריבו בגיל 12 עד 16 שבועות. שימשו את שני העכברים הזכריים והנקביים. כל העכברים היו על הרקע C57Bl/6.

1. ניתוח כליה של העכבר

1. הקריבו עכברי WT בריאים או עכברים ששונו גנטית על ידי פריקה צוואר הרחם.
2. לנתח את כל הכליות העכבר ישירות לאחר הקרבת העכברים. בשביל זה, לבצע את הניתוח החציוני באמצעות מספריים הבטן, חיתוך העור ולאחר מכן שרירי הבטן. להסיר את המעיים ולמקם אותו ליד העכבר.
3. לשחרר את הכליות מרקמת חיבור ולהוציא את הכליה באמצעות מלקחיים כירורגי, חיתוך עורק הכליה, וריד הכליה ו שופכן עם מספריים.
4. הסר את קפסולות כליות מן הכליות על ידי החזקת הכליה עם מלקחיים כירורגי למשוך את הקפסולה באמצעות זוג אחר של מלקחיים.
5. מניחים את הכליות בלוח של 6-היטב התרבות התא (2 כליות/ובכן) הכין 2 מ ל של הנקס ' מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) לכל טוב ומקום על הקרח.

2. בידוד פקאולי מכליות העכבר

1. העבר את הכליות לצלחת פטרי 100 מ"מ והוא משתמש בכליות לחתיכות קטנות של 1-2 מ"מ באמצעות שני מנתחים. לשמור את חתיכות כליה טחון רטוב באמצעות 1-2 מ ל של HBSS.
2. מניחים את חתיכות כליה טחון על גבי מסננת מתכת 300 יקרומטר ולחץ על הכליה דרך המכתש באמצעות בוכנה של מזרק 20 מ ל. שוב ושוב את המסננת עם hbss בין לאסוף את הזרימה-דרך בצלחת פטרי נקי באמצעות pipet סרולוגית. לאסוף גם כל מה שנשאר/מקלות בצד התחתון של המסננת ידי לגרד אותו עם אזמל ולהעביר אותו לזרימה שנאספו דרך (הומוגון כליה ate).
3. לשטוף את הכליות הכליה לאכול דרך מסננת 75 יקרומטר עם hbss. לאסוף את הזרימה-דרך ולאחר מכן לשטוף את זה זרימה-דרך דרך מסננת 53 יקרומטר. שטוף את שני הצדדים באמצעות HBSS כדי להסיר את כל המבנים הקטנים.
   הערה: בשלב זה הזרימה-אף היא שוטפים אך לא לחצה דרך 75 יקרומטר ו 53 יקרומטר מסננת. כביסה עם HBSS היא הכרחית להסרת פסולת ומבנים קטנים יותר על הסיבס. לכן בדרך כלל 200-300 mL של HBSS משמשים בסך הכל.
4. לאסוף את מבני הכליה/חומר שנשאר על 75 יקרומטר ו 53 יקרומטר מסננת ידי שטיפת המשטח העליון של הסיבס עם בינונית שונה של מדיום של הנשר (dmem) שיושלם עם 20% סרום לעגל עוברי (fcs) ולהעביר את החומר לתוך 6-ובכן אולטרה מצורף מיקרופלייט.
   הערה: לשטוף את המשטח העליון של המכתש, לשטוף את המכתש בתנוחה מוטה (> 45 °) ולאסוף את חומר הכליה בקצה המכתש. החומר שנאסף מועשר עבור כימוס, כמו גם פקולי עריפת ראש, מציג רק כמה רסיסים צינורי. . פקולי האנקפסולציה הם דביקים מאוד כדי לאסוף בודד פקולי, ולכן חשוב למנוע פקולי לדבוק במשטח של צלחת פטרי או צלחת טובה. כדי להימנע מדבקות, השתמש במדיום עם 20% FCS והשתמש בלוחות מצורפים אולטרה-נמוכים לשלב זה.

3. התפתחות מגדילה של פקפיות

1. הביאו את המיקרו-לוחית המצורפים האולטרה-נמוכה למיקרוסקופ אור הפוך ואספו כימוו/או פקעיות מעריפת ראש בתוספת של 20 μL. הימנע ללטף מבנים אחרים פסולת. לאחר איסוף פקעית בודדת בקצה הפיפטה, הוסיפו בינונית DMEM דיום טרייה מבלי לאסוף חומר כליות לאותו קצה הפיפטה לנפח של 20 μL.
2. העבר את הגלובולוס היחיד עם 20 מדיום μL Dמאמ למרכז הבאר של לוח התרבות 24-התאים והדגירה עבור 3 h ב 37 ° צ' ו 5% (v/v) CO₂ כדי לאפשר חיבור של הפקעית למרכז הבאר. בזהירות להעביר את הצלחת כדי להימנע מרחף של הפקעית אל הדיירים של הבאר.
3. לאחר 3 שעות דגירה, הפקעית מחוברת למרכז הבאר. בקפידה להוסיף 500 μl של המדיום בסיס אנדותל (ebm) בתוספת עם ערכת פקטור גידול המכיל הידרוקורטיזון, גורם הצמיחה של האדם אנדותל, המוח פרה תמצית ו gentamicin סולפט-אמפוריטיצין B (לוח החומרים) ו נוספים 5% (v/v) fbs ו 1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין (עט/ה
4. תרבות הפקולי בודד עבור 6 ימים ב 37 ° c, 5% (v/v) CO₂.
   הערה: בתוך 6 ימים הצמיחה המורכבת של תאים אפיתל הקודקוד נוצרות. אם אדם שמטרתו לבדוק את ההשפעות של תרכובות או תרופות ספציפיות על התאים האפיתל הקודקודית זה צריך להיות מתווסף למדיום בתוך תקופה זו של ששה ימים.

4. ניתוח הפצת תאים אפיתל הקודקוד

1. . לנתח את הגדילה לאחר 6 ימים קח תמונות מיקרוסקופיים באמצעות מיקרוסקופ אור הפוכה דיגיטלית.
2. השתמש בתוכנת ניתוח תמונה (לדוגמה, ImageJ/פיג'י) כדי לקבוע את שטח פני השטח ואת קוטרו של הצמיחה של הפקפיות, ואת מספר התאים הצומחים או הגדלים החשופים.
   1. כדי לקבוע את פני השטח של צמיחה פקפיות, לפתוח את tif. קובץ של התפתחות הפקפיות עם סרגל בקנה מידה ב-ImageJ. לצייר קו ישר על סרגל סולם ולקבוע את המרחק בפיקסלים על ידי לחיצה על לנתח ולמדוד (למשל, 1 מ"מ = 460 פיקסל).
   2. לקבוע את הסולם על ידי לחיצה על לנתח, לקבוע קנה מידה ולהקליד את המרחק הידוע בפיקסל (למשל, 460), גם להקליד את המרחק הידוע (למשל, 1) ואת יחידת האורך (למשל, 1 מ"מ). לחץ על אישור.
   3. קבע אילו תוצאות יופיעו בטבלת התוצאות על-ידי לחיצה על ניתוח ולאחר מכן הגדר מדידות. כדי לקבוע את אזור פני השטח של צמיחת הפקפיות, הפעל את אזור האפשרויות ותווית התצוגה. לחץ על אישור.
   4. כדי לקבוע את פני השטח של צמיחת הפקפיות, לצייר בחירה ביד חופשית סביב הצמיחה הפקפיות. לחץ על לנתח ולאחר מכן למדוד, הטבלה התוצאה יצוץ ב-imagej מראה את שטח פני השטח של הצמיחה בקנה מידה מוקדם יותר נקבע (ראה שלב 4.4, למשל, mm²).

5. אפיון התפתחות התא הפקייתי

הערה: כדי להעריך את ההרכב הסלולארי של outgrowth, כתמים immunofluorescence לסמנים ספציפיים לתא מתבצעים על הoutgrowth הפקאופיות ב t = 6 ימים.

1. בזהירות להסיר את המדיום בעדינות לשטוף את הפקולי פעמיים באמצעות מלוחים מאגור פוספט (PBS).
2. מיקוד עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות 2% (w/v) שיושלם עם 4% (w/v) סוכרוז ב-PBS ולשטוף בזהירות 2x באמצעות PBS.
3. דגירה עם הנוגדן העיקרי עם ריכוזמתאים (טבלה של חומרים) מדולל ב-PBS-ovine סרום אלבומין (bsa) 1% (v/v) עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
4. הסר את פתרון נוגדן ולשטוף בזהירות 3x עם PBS.
5. דגירה עם נוגדן משני (טבלת חומרים) מדולל ב-PBS-bsa 1% (v/v) בחושך עבור 45 דקות בטמפרטורת החדר.
6. לשטוף בזהירות 3x עם PBS ו-mount באמצעות 1-2 טיפות של בינונית הרכבה מימית עם 4 ′, 6-diamidino-2-פנילילינדול (DAPI) כדי להמחיש גרעינים ולכסות את הבאר עם שובר כיסוי עגול.
7. לקחת תמונות מיקרוסקופיים באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

דיאגרמה שיטתית של השיטה לביצוע שיטת הגדילה הבין-מרבית מוצגת באיור 1. איור 2א-ד מציג את הגידולים המגלוניים של פקולי האנקפסולציה בנקודות זמן שונות כפי שנצפתה באמצעות מיקרוסקופ אור. גידולים החוצה מוצגים ביום 2, 4 ו 6 (איור 2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

באמצעות הפרוטוקול המתואר במאמר זה, ניתן להשתמש באחד לפקולי שעברו שימוש בודד כדי להעריך את התפשטות התא אפיתל הקודקוד שהיא תוצאה של הפעלת תא אפיתל הקודקוד. זה מודל vivo ex יאפשר לנו ללמוד בפירוט מסלולים מולקולריים, אשר מעורבים ההפעלה התא אפיתל הקודקוד. השיטה המתוארת מתבססת על המושג הפשוט של ני?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well cell culture plate	Corning Costar
anti-CD31	BD Pharmingen	Endothelial cell marker (used concentration 1:200)
chicken-anti-rat Alexa 647	Thermo Fisher	(used concentration 1:200)
DAPI-Fluoromount G	Southern Biotech	Mounting medium containing DAPI
Digital inverted light microscope	Westburg, EVOS fl microscope
donkey-anti-goat Alexa 568	Thermo Fisher	(used concentration 1:200)
donkey-anti-rabbit Alexa 568	Thermo Fisher	(used concentration 1:200)
Dulbecco's Modified Eagle's medium	Lonza
EBM Medium	Lonza
EBM-MV Single Quots kit	Lonza	containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE
Fetal Bovine Serum	Lonza
Fetal Calf Serum	Lonza
Fluorescent microscope	Leica Microsystems GmbH
goat-anti-synaptopodin	Santa Cruz	Podocyte marker (used concentration 1:200)
Hanks'Balanced Salt Solution	Gibco
ImageJ software	FIJI 1.51n
petri dish	Sarstedt	size 100
rabbit-anti-claudin1	Abcam	Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100)
rabbit-anti-SSeCKS	Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA	kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker
rat-anti-CD44	BD Pharmingen	Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200)
scalpel	Dahlhausen	size 10
Sieves	Endecotts Ltd	size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel
syringe	BD Plastipak	size: 20 ml
Ultra-Low Attachment Microplates	Corning Costar	6-well plates