Excroissance glomerulaire en tant qu’essai Ex Vivo pour analyser les voies impliquées dans l’activation des cellules épithéliales pariétales

Résumé

Cet article décrit une méthode pour cultiver et analyser les excroissances épithéliales parétalaires glomertales des excroissances de globuleruli encapsulées isolées du rein de souris. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les voies impliquées dans la prolifération et la migration des cellules épithéliales pariétales.

Résumé

L’activation de la cellule épithéliale pariétale (PEC) est l’un des facteurs clés impliqués dans le développement et la progression de la glomerulosclérose. L’inhibition des voies impliquées dans l’activation épithéliale pariétale de cellules pourrait donc être un outil pour atténuer la progression des maladies glomerulaires. Cet article décrit une méthode pour la culture et l’analyse de l’excroissance épithéliale pariétale de glomeruli encapsulé isolé du rein de souris. Après avoir disséqué les reins isolés de souris, le tissu est haché, et les glomeruli sont isolés par tamisage. Glomeruli encapsulés sont recueillis, et le glomeruli simple sont cultivés pendant 6 jours pour obtenir l’excroissance glomerulaire des cellules épithéliales pariétales. Pendant cette période, la prolifération et la migration des cellules épithéliales pariétales peuvent être analysées en déterminant le nombre de cellules ou la surface des cellules qui dépassent. Ce test peut donc être utilisé comme un outil pour étudier les effets d’une expression génique altérée chez les souris transgéniques ou knock-out ou les effets des conditions de culture sur les caractéristiques de croissance et de signalisation des cellules épithéliales pariétales. En utilisant cette méthode, des voies importantes impliquées dans le processus d’activation des cellules épithéliales pariétales et par conséquent dans la glomerulosclérose peuvent être étudiées.

Introduction

Les maladies glomerulaires sont un groupe important de troubles rénaux et représentent une cause majeure de la maladie rénale terminale (ESRD). Malheureusement, les options de traitement spécifiques sont limitées et la progression vers l’ESRD est inévitable. Les maladies glomerulaires sont définies par la présence de lésions glomerulaires et peuvent être regroupées dans les maladies inflammatoires et non inflammatoires. Bien que l’insulte initiale soit différente, des études récentes ont montré qu’un mécanisme cellulaire commun conduit à l’hyperplasie épithéliale glomerulaire de cellules et finalement à la glomerulosclérose dans toutes les maladies glomerulaires, indépendamment de la cause sous-jacente^1,2,3,4.

Plus précisément, il a été démontré que les lésions glomerulosclérotiques sont principalement composées de cellules épithéliales pariétales activées^5,6. Dans des conditions physiologiques, les cellules épithéliales pariétales sont des cellules épithéliales plates qui tapissent la capsule du Glomerulus de Bowman. Cependant, toute lésion glomerulaire due à des mutations génétiques (p. ex., cytopathies spécifiques ou mitochondriales de podocyte), inflammation ou hyperfiltration (p. ex., causée par une masse rénale réduite, hypertension, obésité ou diabète sucré) peut déclencher l’activation des cellules épithéliales pariétales. Les cellules épithéliales pariétales activées prolifèrent et déposent la matrice extracellulaire qui entraîne la formation de croissants cellulaires ou de lésions sclérotiques^5,7,8. La progression de ces processus entraîne la perte de la fonction rénale⁹. Par conséquent, l’activation des cellules épithéliales pariétales est un facteur clé dans le développement et la progression de la glomerulosclérose dans les maladies glomerulaires inflammatoires et non inflammatoires^1,2,3,4,10.

Les processus moléculaires de médiation de l’activation des cellules épithéliales pariétales sont encore largement inconnus. Des études récentes montrent que les cellules épithéliales pariétales activées de novo express CD44, un récepteur qui est important pour l’activation de différentes voies impliquées dans la prolifération cellulaire et la migration. En outre, l’inhibition du CD44 a été montré pour inhiber l’activation épithéliale pariétale de cellules et atténuer la progression de la formation de croissant et de la glomerulosclérose dans les modèles animaux des maladies glomerulaires inflammatoires aussi bien que non-inflammatoires^11,12.

Comme l’activation des cellules épithéliales pariétales est un acteur clé pour le développement de la glomerulosclérose et de la formation de croissants, l’inhibition de ces cellules pourrait ralentir la progression des maladies glomerulaires. L’élucidation des voies moléculaires conduisant l’activation épithéliale pariétale de cellules peut mener au développement des interventions thérapeutiques spécifiques qui atténuent la formation des lésions hyperplastiques et glomerulosclérotiques dans la maladie glomerular.

Dans les modèles animaux expérimentaux, il est souvent difficile de fournir des preuves d’un effet direct d’une expression génétique altérée (modèles knock-out ou modèles transgéniques de souris) ou d’un traitement médicamenteux sur les cellules épithéliales pariétales. Dans une souris knock-out conventionnelle, les changements in vivo observés pourraient s’expliquer par des changements directs dans les cellules épithéliales pariétales. Cependant, puisque l’expression du gène est également modifiée dans d’autres types de cellules à l’intérieur de la souris, on ne peut exclure les effets indirects médiés par d’autres types de cellules. Le développement de souris cré-lox conditionnelles entraînées par des promoteurs principalement actifs dans les cellules épithéliales pariétales a fourni une solution dans certains cas¹³. Néanmoins, les modèles transgéniques conditionnels sont complexes et bien que des lignes plus conditionnelles deviennent disponibles, pour bon nombre des lignes de souris conventionnelles knock-out ou transgéniques il n’y a pas encore de substitut conditionnel.

Pour étudier les effets directs sur les cellules épithéliales pariétales, notre groupe a développé un test ex vivo utilisant un seul glomeruli encapsulé isolé des reins de souris pour mesurer et analyser la prolifération et la migration des cellules épithéliales pariétales. Cette méthode nous permettra de déterminer les effets spécifiques aux cellules épithéliales pariétales et de trouver des voies responsables pour l’activation des cellules épithéliales pariétales et les options de traitement d’essai pour inhiber cette activation.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été réalisées selon les directives du Comité d’éthique animale de l’Université Radboud de Nimègue.

REMARQUE : Des souris de type sauvage non traitées et saines (n = 4) et des souris cd44-/- (n = 4) ont été sacrifiées à l’âge de 12−16 semaines. Des souris mâles et femelles ont été utilisées. Toutes les souris étaient sur le fond C57Bl/6.

1. Dissection rénale de souris

1. Sacrifiez des souris WT en bonne santé ou des souris génétiquement modifiées par dislocation cervicale.
2. Disséquer les reins entiers de la souris directement après avoir sacrifié les souris. Pour cela, effectuer une laparotomie médiane à l’aide de ciseaux abdominaux, couper la peau, puis les muscles abdominaux. Retirez l’intestin et placez-le à côté de la souris.
3. Libérer les reins de connecter les tissus et retirer le rein à l’aide de forceps chirurgicaux, couper l’artère rénale, la veine rénale et l’uretère avec des ciseaux.
4. Retirez les capsules rénales des reins en tenant le rein avec des forceps chirurgicaux et retirez la capsule à l’aide d’une autre paire de forceps.
5. Placez les reins dans une plaque de culture cellulaire de 6 puits (2 reins/bien) préparée avec 2 mL de la solution de sel équilibrée (HBSS) de Hanks par puits et placez-la sur la glace.

2. Isolement des glomeruli du rein de souris

1. Transférer les reins dans une boîte de Pétri de 100 mm et hacher les reins en petits morceaux de 1 à 2 mm à l’aide de deux scalpels. Gardez les morceaux de rein hachés humides à l’aide de 1 à 2 mL de HBSS.
2. Placez les morceaux de rein hachés sur un tamis métallique de 300 μm et appuyez sur le rein à l’aide d’un piston d’une seringue de 20 mL. Rincez à plusieurs reprises le tamis avec le HBSS entre les deux et collectez le passage dans une boîte de Pétri propre à l’aide d’un tuyaut sérologique. Recueillir aussi tout ce qui reste / bâtons sur le côté inférieur du tamis en le grattant avec le scalpel et le transférer à l’écoulement collecté à travers (homogénéité rénale).
3. Rincer l’homogénéité rénale à travers un tamis de 75 μm avec HBSS. Recueillir le débit et ensuite rincer ce flux à travers un tamis de 53 μm. Laver les deux tamis à l’aide de HBSS pour enlever toutes les structures plus petites.
   REMARQUE : Dans cette étape, le débit n’est rincé que mais pas pressé à travers le tamis de 75 μm et 53 μm. Le lavage avec HBSS est nécessaire pour enlever les débris et les petites structures sur les tamis. Par conséquent, normalement 200−300 mL de HBSS sont utilisés au total.
4. Recueillir les structures/matériaux rénaux qui restent sur le tamis de 75 μm et 53 μm en lavant la surface supérieure des tamis avec le milieu modifié de l’Aigle (DMEM) de Dulbecco, complété par un sérum de veau foetal (FCS) à 20 % et transférer le matériel dans une microplaque d’attachement ultra-faible de 6 puits.
   REMARQUE : Pour laver la surface supérieure du tamis, rincez le tamis en position inclinée (>45°) et collectez le matériel rénal au bord du tamis. Le matériau collecté est enrichi pour les glomeruli encapsulés et décapsulés, ne montrant que quelques fragments tubulaires. Glomeruli encapsulé sont très collants. Pour recueillir un seul glomeruli, il est donc important d’empêcher glomeruli d’adhérer à la surface d’une boîte de Pétri ou d’une plaque de puits. Pour éviter l’adhérence, utilisez un support avec 20% de FCS et utilisez des plaques d’attachement ultra-basses pour cette étape.

3. Culture des excroissances glomerulaires

1. Apportez la microplaque de fixation ultra-faible à un microscope lumineux inversé et collectez un seul glomeruli encapsulé et/ou décapsulé avec une pipette de 20 μL. Évitez de faire des tuyaux dans d’autres structures et débris. Après avoir recueilli un seul glomerulus dans la pointe de la pipette, ajoutez un milieu DMEM frais sans matériel rénal recueilli dans la même pointe de pipette à un volume de 20 μL.
2. Transférer le glomerulus unique avec le milieu DMEM de 20 μL au centre d’un puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits et incuber pendant 3 h à 37 °C et 5 % (v/v) co₂ pour permettre l’attachement du glomerulus au centre du puits. Déplacez soigneusement la plaque pour éviter de flotter du glomerulus vers les pensionnaires du puits.
3. Après 3 h d’incubation, le glomerulus est fixé au centre du puits. Ajouter soigneusement 500 μL de milieu basal endothélial (EBM) complété par un kit de facteur de croissance contenant de l’hydrocortisone, facteur de croissance endothelial humain, extrait du cerveau bovin et sulfate de gentamicine-amphotéricine B(Tableau des matériaux)et 5% supplémentaires (v/v) FBS et 1% (v/v) pénicilline/streptomycine (pen/streptocoque) à bien chacun.
4. Culture le glomeruli unique pendant 6 jours à 37 °C, 5% (v/v) CO₂.
   NOTE : Dans les 6 jours, on forme l’excroissance composée de cellules épithéliales pariétales. Si l’on vise à tester les effets de composés ou de médicaments spécifiques sur les cellules épithéliales pariétales, il devrait être ajouté au milieu dans cette période de six jours.

4. Analyse de la prolifération des cellules épithéliales pariétales

1. Analyser l’excroissance glomerulaire après 6 jours. Prenez des images microscopiques à l’aide d’un microscope lumineux inversé numérique.
2. Utiliser un logiciel d’analyse d’images (p. ex., ImageJ/FIJI) pour déterminer la surface et le diamètre de l’excroissance glomerulaire, ainsi que le nombre de cellules en croissance ou de glomeruli qui dépasse la croissance.
   1. Pour déterminer la surface de l’excroissance glomerulaire, ouvrez le tif. fichier de l’excroissance glomerulaire avec barre d’échelle dans ImageJ. Dessinez une ligne droite sur la barre d’échelle et déterminez la distance en pixels en cliquant sur l’analyse et la mesure (p. ex., 1 mm = 460 pixels).
   2. Déterminez l’échelle en cliquant sur analyser,définir l’échelle et taper la distance connue en pixel (p. ex., 460), tapez également la distance connue (p. ex., 1) et l’unité de longueur (p. ex., 1 mm). Cliquez sur ok.
   3. Déterminez quels résultats s’afficheront dans le tableau des résultats en cliquant sur analyser puis définir des mesures. Pour déterminer la surface de l’excroissance glomerulaire, activez la zone d’options et l’étiquette d’affichage. Cliquez sur ok.
   4. Pour déterminer la surface de l’excroissance glomerulaire, dessinez une sélection à main levée autour de l’excroissance glomerulaire. Cliquez sur analyser puis mesurer, une table de résultats apparaîtra dans ImageJ montrant la surface de l’excroissance dans l’échelle déterminée antérieure (voir l’étape 4.4, par exemple, mm²).

5. Caractérisation de l’excroissance des cellules glomerulaires

REMARQUE : Pour évaluer la composition cellulaire de l’excroissance, la coloration d’immunofluorescence pour les marqueurs spécifiques aux cellules est effectuée sur les excroissances glomerulaires à t = 6 jours.

1. Retirez soigneusement le milieu et lavez doucement le glomeruli deux fois à l’aide de la solution saline tamponnée par le phosphate (PBS).
2. Fixer pendant 10 min à température ambiante en utilisant 2% (w/v) paraformaldéhyde (PFA) complété par 4% (w/v) saccharose dans PBS et laver soigneusement 2x à l’aide de PBS.
3. Incuber avec l’anticorps primaire avec une concentration appropriée (Tableau des matériaux) diluée dans l’albumine de sérum PBS-ovine (BSA) 1% (v/v) pendant 1 h à température ambiante.
4. Retirer la solution d’anticorps et laver soigneusement 3x avec PBS.
5. Incuber avec un anticorps secondaire (Tableau des matériaux) dilué dans PBS-BSA 1% (v/v) dans l’obscurité pendant 45 min à température ambiante.
6. Lavez soigneusement 3x avec pbs et montez à l’aide de 1−2 gouttes de milieu de montage aqueux avec 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour visualiser les noyaux et couvrir le puits d’un glissement de couverture rond.
7. Prenez des images microscopiques à l’aide d’un microscope fluorescent.

Résultats

La figure 1montre un diagramme systématique de la méthode d’exécution de l’essai d’excroissance glomerulaire . La figure 2A-D montre les excroissances glomerulaires de glomeruli encapsulé à différents moments comme observé à l’aide de la microscopie légère. Les excroissances sont indiquées aux jours 2, 4 et 6 (figure 2B-D) dans la culture après l?...

Discussion

En utilisant le protocole décrit dans cet article, on peut utiliser le glomeruli encapsulé unique pour évaluer la prolifération de cellules épithéliales pariétales qui est une conséquence de l’activation de cellules épithéliales pariétales. Ce modèle ex vivo nous permettra d’étudier en détail les voies moléculaires, qui sont impliquées dans l’activation des cellules épithéliales pariétales. La méthode décrite s’appuie sur le concept simple de dissection rénale et de tamisage pour isoler et c...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well cell culture plate	Corning Costar
anti-CD31	BD Pharmingen	Endothelial cell marker (used concentration 1:200)
chicken-anti-rat Alexa 647	Thermo Fisher	(used concentration 1:200)
DAPI-Fluoromount G	Southern Biotech	Mounting medium containing DAPI
Digital inverted light microscope	Westburg, EVOS fl microscope
donkey-anti-goat Alexa 568	Thermo Fisher	(used concentration 1:200)
donkey-anti-rabbit Alexa 568	Thermo Fisher	(used concentration 1:200)
Dulbecco's Modified Eagle's medium	Lonza
EBM Medium	Lonza
EBM-MV Single Quots kit	Lonza	containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE
Fetal Bovine Serum	Lonza
Fetal Calf Serum	Lonza
Fluorescent microscope	Leica Microsystems GmbH
goat-anti-synaptopodin	Santa Cruz	Podocyte marker (used concentration 1:200)
Hanks'Balanced Salt Solution	Gibco
ImageJ software	FIJI 1.51n
petri dish	Sarstedt	size 100
rabbit-anti-claudin1	Abcam	Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100)
rabbit-anti-SSeCKS	Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA	kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker
rat-anti-CD44	BD Pharmingen	Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200)
scalpel	Dahlhausen	size 10
Sieves	Endecotts Ltd	size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel
syringe	BD Plastipak	size: 20 ml
Ultra-Low Attachment Microplates	Corning Costar	6-well plates