Escrescenza glomerare come un'analisi di Ex Vivo per analizzare i percorsi coinvolti nell'attivazione delle cellule epiteliali Parietali

Riepilogo

Questo articolo descrive un metodo per coltivare e analizzare le escrescenze glomeriane delle cellule epiteliali glomeriali di glomeruli incapsulati isolati dal rene del topo. Questo metodo può essere utilizzato per studiare i percorsi coinvolti nella proliferazione e migrazione delle cellule epiteliali parietali.

Abstract

L'attivazione delle cellule epiteliali parietali (PEC) è uno dei fattori chiave coinvolti nello sviluppo e nella progressione della glorulosclerosi. L'inibizione delle vie coinvolte nell'attivazione delle cellule epiteliali parietali potrebbe quindi essere uno strumento per attenuare la progressione delle malattie glomerari. Questo articolo descrive un metodo per coltura e analizzare la crescita delle cellule epiteliali parietali di glomeruli incapsulati isolati dal rene del topo. Dopo aver sezionato i reni di topo isolati, il tessuto viene macinato e i glomeruli vengono isolati dalla setacciatura. I glomeruli incapsulati vengono raccolti e i glomeruli singoli vengono coltivati per 6 giorni per ottenere la crescita glomerare delle cellule epiteliali parietali. Durante questo periodo, la proliferazione e la migrazione delle cellule epiteliali parietali possono essere analizzate determinando il numero di cellule o la superficie delle cellule in crescita in emigrazione. Questo saggio può quindi essere utilizzato come strumento per studiare gli effetti di un'espressione genica alterata nei topi transgenici o knockout o gli effetti delle condizioni di coltura sulle caratteristiche e la segnalazione della crescita delle cellule epiteliali parietali. Utilizzando questo metodo, è possibile studiare importanti vie coinvolte nel processo di attivazione delle cellule epiteliali parietali e, di conseguenza, nella glomerulosclerosi.

Introduzione

Le malattie glomeriari sono un importante gruppo di disturbi renali e rappresentano una delle principali cause della malattia renale allo stadio finale (ESRD). Sfortunatamente, le opzioni di trattamento specifiche sono limitate e la progressione verso l'ESRD è inevitabile. Le malattie glomerari sono definite dalla presenza di lesioni glomeriule e possono essere raggruppate in malattie infiammatorie e non infiammatorie. Anche se l'insulto iniziale è diverso, studi recenti hanno dimostrato che un meccanismo cellulare comune porta a iperplasia delle cellule epiteliali glomerale e, infine, alla glomerulosclerosi in tutte le malattie glomerari, indipendentemente dalla causa sottostante^1,2,3,4.

In particolare, è stato dimostrato che le lesioni glomerulosclerotice sono composte principalmente da cellule epiteliali parietali attivate^5,6. In condizioni fisiologiche, le cellule epiteliali parietali sono cellule epiteliali quiescenti piatte che riallineano la capsula del Bowman del glomerulus. Tuttavia, qualsiasi lesione glomerare dovuta a mutazioni genetiche (ad esempio, citopatie specifiche di podociti o mitocondriali), infiammazione o iperfiltrazione (ad esempio, causata da ridotta massa renale, ipertensione, obesità o mellito diabetico) può innescare l'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Le cellule epiteliali parietali attive proliferano e depositano matrice extracellulare che si traduce nella formazione di mezzalune cellulari o lesioni sclerotiche^5,7,8. La progressione di questi processi comporta la perdita della funzione renale⁹. Pertanto, l'attivazione delle cellule epiteliali parietali è un fattore chiave nello sviluppo e nella progressione della glomerulosclerosi nelle malattie glomerari sia infiammatorie che non infiammatorie^1,2,3,4,10.

I processi molecolari che mediano l'attivazione delle cellule epiteliali parietali sono ancora in gran parte sconosciuti. Recenti studi dimostrano che le cellule epiteliali parietali attivate de novo esprimono CD44, un recettore importante per l'attivazione di diversi percorsi coinvolti nella proliferazione cellulare e nella migrazione. Inoltre, l'inibizione del CD44 ha dimostrato di inibire l'attivazione delle cellule epiteliali parietali e attenuare la progressione della formazione della mezzaluna e della glomerulosclerosi nei modelli animali di malattie glomerari e infiammatorie^11,12.

Poiché l'attivazione delle cellule epiteliali parietali è un attore chiave per lo sviluppo della glomerulsclerosi e della formazione della mezzaluna, l'inibizione di queste cellule potrebbe rallentare la progressione delle malattie glomerari. La chiarificazione delle vie molecolari che determinano l'attivazione delle cellule epiteliali parietali può portare allo sviluppo di interventi terapeutici specifici che attenuano la formazione delle lesioni iperplastiche e glomerulosclerotice nella malattia glomerare.

Nei modelli animali sperimentali, è spesso difficile fornire prove di un effetto diretto di un'espressione genica alterata (modelli di eliminazione o modelli murini transgenici) o di un trattamento farmacologico sulle cellule epiteliali parietali. In un topo knock-out convenzionale i cambiamenti osservati in vivo potrebbero essere spiegati da cambiamenti diretti nelle cellule epiteliali parietali. Tuttavia, poiché l'espressione genica è alterata anche in altri tipi di cellule all'interno del mouse, non si possono escludere gli effetti indiretti mediati da altri tipi di cellule. Lo sviluppo di topi condizionati cre-lox guidati da promotori attivi principalmente in cellule epiteliali parietali ha fornito una soluzione in alcuni casi¹³. Tuttavia, i modelli transgenici condizionali sono complessi e, anche se diventano disponibili linee più condizionali, per molte delle linee di topo convenzionali knock-out o transgeniche non esiste ancora un sostituto condizionale.

Per studiare gli effetti diretti sulle cellule epiteliali parietali, il nostro gruppo ha sviluppato un saggio ex vivo utilizzando glomeruli singoli incapsulati isolati dai reni dei topi per misurare e analizzare la proliferazione e la migrazione delle cellule epiteliali parietali. Questo metodo ci permetterà di determinare gli effetti specifici delle cellule epiteliali parietali e di trovare vie responsabili per l'attivazione delle cellule epiteliali parietali e testare le opzioni di trattamento per inibire questa attivazione.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida del Comitato Etico Animale della Radboud University Nijmegen.

NOTA: i topi di tipo selvaggio non trattati (WT) (n - 4) e i topi cd44-/- (n - 4) sono stati sacrificati all'età di 12-16 settimane. Sono stati usati sia topi maschi che femmine. Tutti i topi erano sullo sfondo C57Bl/6.

1. Dissezione renale del topo

1. Sacrifica topi WT sani o topi geneticamente alterati dalla lussazione cervicale.
2. Dissect interi reni di topo direttamente dopo aver sacrificato i topi. Per questo, eseguire una laparotomia mediana utilizzando forbici addominali, tagliando la pelle e poi i muscoli addominali. Rimuovere l'intestino e posizionarlo accanto al mouse.
3. Liberare i reni dal tessuto di collegamento e tirare fuori il rene con pinze chirurgiche, tagliando l'arteria renale, vena renale e ureter con le forbici.
4. Rimuovere le capsule renali dai reni tenendo il rene con pinze chirurgiche ed estrarre la capsula utilizzando un altro paio di pinze.
5. Mettere i reni in una piastra di coltura a 6 cellule (2 reni/bene) preparata con 2 mL di soluzione di sale equilibrato di Hanks (HBSS) per pozzo e posto su ghiaccio.

2. Isolamento del glomeruli dal rene di topo

1. Trasferire i reni in un piatto Petri da 100 mm e tritare i reni in piccoli pezzi di 1/2 mm usando due bisturi. Mantenere i pezzi di rene macinati bagnati usando 1-2 mL di HBSS.
2. Posizionare i pezzi di rene macinati sopra un setaccio di metallo di 300 m e premere il rene attraverso il setaccio utilizzando uno stantuffo di una siringa da 20 mL. Sciacquare ripetutamente il setaccio con HBSS in mezzo e raccogliere il flusso attraverso in una piastra Petri pulita utilizzando un pipet sierologico. Raccogliere anche tutto ciò che rimane / si attacca al lato inferiore del setaccio raschiando via con il bisturi e trasferirlo al flusso-attraverso raccolto (omogeneo renale).
3. Sciacquare l'omogenea renale attraverso un setaccio di 75 m con HBSS. Raccogliere il flusso attraverso e successivamente sciacquare questo flusso attraverso un setaccio di 53 m. Lavare entrambi i setacci utilizzando HBSS per rimuovere tutte le strutture più piccole.
   NOTA: In questa fase il flusso, ma non viene sciacquato solo attraverso il setaccio di 75 m e 53 m. Lavaggio con HBSS è necessario rimuovere detriti e strutture più piccole sui setacci. Pertanto normalmente vengono utilizzati in totale 200-300 mL di HBSS.
4. Raccogliere le strutture/materiali renali che rimangono sul setaccio 75 m e 53 m lavando la superficie superiore dei setacci con il mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 20% di siero di vitello fetale (FCS) e trasferire il materiale in una micropiastra di fissaggio ultra-basso a 6 bassissimi.
   NOTA: Per lavare la superficie superiore del setaccio, sciacquare il setaccio in posizione inclinata (>45) e raccogliere il materiale renale sul bordo del setaccio. Il materiale raccolto è arricchito per glomeruli incapsulati e incapsulati, mostrando solo pochi frammenti tubolari. I glomeruli incapsulati sono molto appiccicosi. Per raccogliere singoli glomeruli, è quindi importante evitare che i glomeruli aderiscano alla superficie di un piatto Petri o di un piatto di pozzo. Per evitare l'aderenza, utilizzare il supporto con 20% FCS e utilizzare piastre di fissaggio ultra-basse per questo passaggio.

3. Coltura di escrescenza glomerare

1. Portare la microplacca di fissaggio ultra-bassa in un microscopio luminoso invertito e raccogliere singoli glomeruli incapsulati e/o incapsulati con una pipetta da 20 l. Evitare di pipettare altre strutture e detriti. Dopo aver raccolto un singolo glomerulus nella punta della pipetta, aggiungere il nuovo supporto DMEM senza materiale renale raccolto nella stessa punta di pipetta per un volume di 20 .
2. Trasferire il singolo glomerulus con il mezzo DMEM da 20 gradi al centro di un pozzo di una piastra di coltura cellulare a 24 pozze e incubare per 3 h a 37 oC e 5% (v/v) CO₂ per consentire l'attaccamento del glomerulus al centro del pozzo. Spostare con attenzione la piastra per evitare di galleggiare del glomerulus ai bordodel.
3. Dopo 3 h incubazione, il glomerulus è attaccato al centro del pozzo. Aggiungere con attenzione 500 l di mezzo basale endoteliale (EBM) integrato con un kit per il fattore di crescita contenente idrocortisone, fattore di crescita endoteliale umano, estratto cerebrale bovino e anfido-amphotericina b di gentamicin B (Tabella dei materiali) e ulteriore 5% (v/v) FBS e 1% (v/v) penicillina / s ptomicina (pentre) ogni beh.
4. Cultura il singolo glomeruli per 6 giorni a 37 gradi centigradi, 5% (v/v) CO₂.
   NOTA: Entro 6 giorni si forma la crescita costituita da cellule epiteliali parietali. Se si mira a testare gli effetti di composti specifici o farmaci sulle cellule epiteliali parietali dovrebbe essere aggiunto al mezzo entro questo periodo di sei giorni.

4. Analisi della proliferazione delle cellule epiteliali parietali

1. Analizzare l'escrescenza glomerare dopo 6 giorni. Scatta immagini microscopiche utilizzando un microscopio digitale a luce rovesciata.
2. Utilizzare un software di analisi delle immagini (ad esempio, ImageJ/FIJI) per determinare la superficie e il diametro della crescita glomerare e il numero di cellule in crescita o glomeruli in crescita.
   1. Per determinare la superficie di escrescenza glomerare, aprire il tif. file della crescita glomerare con barra della scala in ImageJ. Disegnare una linea retta sulla barra della scala e determinare la distanza in pixel facendo clic su analizza e misura (ad esempio, 1 mm e 460 pixel).
   2. Determinare la scala facendo clic su Analizza, impostare la scala e digitare la distanza nota in pixel (ad esempio, 460), digitare anche la distanza nota (ad esempio, 1) e l'unità di lunghezza (ad esempio, 1 mm). Fare clic su OK.
   3. Determinare quali risultati verranno visualizzati nella tabella dei risultati facendo clic su Analizza e quindi impostare le misurazioni. Per determinare la superficie della crescita glomerare, attivare l'area delle opzioni e l'etichetta di visualizzazione. Fare clic su OK.
   4. Per determinare la superficie della crescita glomerare, disegnare una selezione a mano libera intorno alla crescita glomerare. Fare clic su analizza e quindi misurare, verrà visualizzata una tabella dei risultati in ImageJ che mostra la superficie di crescita della superficie nella scala determinata in precedenza (vedere il passaggio 4.4, ad esempio, mm²).

5. Caratterizzazione della crescita della cellula glomerare

NOTA: Per valutare la composizione cellulare della escrescenza, la colorazione dell'immunofluorescenza per i marcatori specifici delle cellule viene eseguita sulle escrescenze glomeriule a t e 6 giorni.

1. Rimuovere con attenzione il mezzo e lavare delicatamente la glomeruli due volte utilizzando la salina con buffer fosfato (PBS).
2. Fissare per 10 min a temperatura ambiente utilizzando 2% (w/v) paraformaldeide (PFA) integrato con 4% (w/v) di saccarosio in PBS e lavare con attenzione 2x utilizzando PBS.
3. Incubare con l'anticorpo primario con adeguata concentrazione (Tabella dei materiali) diluito nell'albumina del siero PBS-ovine (BSA) 1% (v/v) per 1 h a temperatura ambiente.
4. Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare con cura 3x con PBS.
5. Incubazione con anticorpo secondario (Tabella dei materiali) diluito in PBS-BSA 1% (v/v) al buio per 45 min a temperatura ambiente.
6. Lavare con cura 3x con PBS e montare utilizzando 1o2 gocce di supporto di montaggio acquoso con 4,6-diamidino-2-fenilondoma (DAPI) per visualizzare i nuclei e coprire il pozzo con uno slittamento di copertura rotondo.
7. Scatta immagini microscopiche usando un microscopio fluorescente.

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Risultati

Un diagramma sistematico del metodo per eseguire l'escrescenza glomerare è illustrato nella Figura 1. Figura 2A-D mostra escrescenze glomeriul di glomeruli incapsulati in diversi punti temporali come osservato utilizzando microscopia leggera. Le escrescenze sono mostrate al giorno 2, 4 e 6 ( Figura 2B-D) nellacolturadopo l'isolamento glomerulus dal rene di topo. Al ...

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Discussione

Utilizzando il protocollo descritto in questo articolo, è possibile utilizzare glomeruli singoli incapsulati per valutare la proliferazione delle cellule epiteliali parietali che è una conseguenza dell'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Questo modello ex vivo ci permetterà di studiare in dettaglio i percorsi molecolari, che sono coinvolti nell'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Il metodo descritto si basa sul semplice concetto di dissezione renale e setacciatura per isolare e coltura incapsul...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well cell culture plate	Corning Costar
anti-CD31	BD Pharmingen	Endothelial cell marker (used concentration 1:200)
chicken-anti-rat Alexa 647	Thermo Fisher	(used concentration 1:200)
DAPI-Fluoromount G	Southern Biotech	Mounting medium containing DAPI
Digital inverted light microscope	Westburg, EVOS fl microscope
donkey-anti-goat Alexa 568	Thermo Fisher	(used concentration 1:200)
donkey-anti-rabbit Alexa 568	Thermo Fisher	(used concentration 1:200)
Dulbecco's Modified Eagle's medium	Lonza
EBM Medium	Lonza
EBM-MV Single Quots kit	Lonza	containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE
Fetal Bovine Serum	Lonza
Fetal Calf Serum	Lonza
Fluorescent microscope	Leica Microsystems GmbH
goat-anti-synaptopodin	Santa Cruz	Podocyte marker (used concentration 1:200)
Hanks'Balanced Salt Solution	Gibco
ImageJ software	FIJI 1.51n
petri dish	Sarstedt	size 100
rabbit-anti-claudin1	Abcam	Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100)
rabbit-anti-SSeCKS	Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA	kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker
rat-anti-CD44	BD Pharmingen	Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200)
scalpel	Dahlhausen	size 10
Sieves	Endecotts Ltd	size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel
syringe	BD Plastipak	size: 20 ml
Ultra-Low Attachment Microplates	Corning Costar	6-well plates