Гломерулярный рост, как Ex Vivo Assay для анализа путей, участвующих в пареталальной активации клеток

Резюме

В этой статье описывается метод культивирования и анализа гломерулярных темеальных эпителиальных клеточных заростов инкапсулированных гломерули, изолированных от мышиных почек. Этот метод может быть использован для изучения путей, участвующих в теменной эпителиальной пролиферации клеток и миграции.

Аннотация

Активация париетальных эпителиальных клеток (УИК) является одним из ключевых факторов, влияющих на развитие и прогрессирование гломерулокслероза. Ингибирование путей, участвующих в теменной активации эпителиальных клеток, может быть инструментом для ослабления прогрессирования гломерулярных заболеваний. В этой статье описывается метод культуры и анализа теменной эпителиальной клетки нарост инкапсулированных гломерули, изолированных от мышиных почек. После вскрытия изолированных почек мыши, ткань измельчается, а гломерули изолированы сито. Инкапсулированные гломерули собираются, и одиночные гломерули культивируются в течение 6 дней, чтобы получить гломерулярные нарост темеетальных эпителиальных клеток. В течение этого периода, теменной эпителиальной пролиферации клеток и миграции могут быть проанализированы путем определения числа клеток или площади поверхности перерастающей клетки. Этот анализ может поэтому использоваться в качестве инструмента для изучения последствий измененного экспрессии генов у трансгенных или нокаут-мышей или влияние условий культуры на теменные характеристики эпителиального роста клеток и сигнализации. Используя этот метод, важные пути, участвующие в процессе активации теменной эпителиальной клетки и, следовательно, при гломерулокслерозе могут быть изучены.

Введение

Гломерулярные заболевания являются важной группой заболеваний почек и представляют собой основную причину заболевания почек на конечной стадии (ESRD). К сожалению, конкретные варианты лечения ограничены и прогрессирование в ESRD неизбежна. Гломерулярные заболевания определяются наличием гломерулярных травм и могут быть сгруппированы в воспалительных и невоспалительных заболеваниях. Хотя первоначальное оскорбление отличается, последние исследования показали, что общий клеточный механизм приводит к гломерулярной гиперплазии клеток и в конечном итоге гломерулосклероз во всех гломерулярных заболеваний, независимо от основной причины^1,2,3,4.

В частности, было показано, что гломерулоклеротические поражения в основном состоят из активированных темеальных эпителиальных клеток^5,,6. В физиологических условиях, теменные эпителиальные клетки плоские тихие эпителиальные клетки, которые выстиляют капсулу Боумана из гломерула. Однако любая гломерулярная травма, вызванная генетическими мутациями (например, специфическими подоцитами или митохондриальными цитопатиями), воспалением или гиперфильтрацией (например, вызванной снижением почечной массы, гипертонией, ожирением или диабетическим меллитом), может вызвать активацию темных эпителиальных клеток. Активированные теметальные эпителиальные клетки размножаются и откладывают внеклеточную матрицу, что приводит к образованию клеточных полумесяцев или склеротических поражений^5,,7,,8. Прогрессирование этих процессов приводит к потере функции почек⁹. Поэтому активация теменной эпителиальной клетки является ключевым фактором в развитии и прогрессировании гломерулосклероза как при воспалительных, так и при невоспалительных гломерулярных заболеваниях^{1,,2,,3,,4,,10.}

Молекулярные процессы, посреднительные темиетальной активации эпителиальных клеток, до сих пор в значительной степени неизвестны. Недавние исследования показывают, что активированные теметальные эпителиальные клетки de novo экспресс CD44, рецептор, который имеет важное значение для активации различных путей, участвующих в клеточной пролиферации и миграции. Кроме того, было показано, что ингибирование CD44 ингибирует активацию теменных эпителиальных клеток и опутывает прогрессирование образования полумесяца и гломерулезплероза у животных моделей воспалительных, а также невоспалительных гломерулярных заболеваний^11,,12.

Поскольку активация теменной эпителиальной клетки является ключевым игроком для развития гломерулосклероза и формирования полумесяца, ингибирование этих клеток может замедлить прогрессирование гломерулярных заболеваний. Выяснение молекулярных путей активации теменной эпителиальной клетки может привести к развитию специфических терапевтических вмешательств, которые смягчат образование гиперпластических и гломеруклеротических поражений при гломерулярных заболеваниях.

В экспериментальных моделях животных часто трудно представить доказательства прямого влияния измененного экспрессии генов (модели нокаутирования или трансгенные мышиные модели) или медикаментозного лечения теменных эпителиальных клеток. В обычной выдаваемой мыши наблюдаемые изменения in vivo могут быть объяснены прямыми изменениями в теменных эпителиальных клетках. Однако, поскольку экспрессия генов также изменяется в других типах клеток в мыши, нельзя исключать косвенных эффектов, опосредованных другими типами клеток. Развитие условных кре-локс мышей, управляемых промоутерами, в основном активными в теменных эпителиальных клетках, обеспечило решение в некоторых случаях^13. Тем не менее, условные трансгенные модели являются сложными и, хотя более условные линии становятся доступными, для многих обычных нокаут-аут или трансгенных линий мыши еще не условный заменитель.

Для изучения прямого воздействия на теменной эпителиальной клетки, наша группа разработала ex vivo анализ с использованием одного инкапсулированных гломерули изолированы от мышиных почек для измерения и анализа теменной эпителиальной пролиферации клеток и миграции. Этот метод позволит нам определить теменной эпителиальной клетки конкретные эффекты и найти ответственные пути для теменной активации эпителиальных клеток и варианты лечения теста, чтобы ингибировать эту активацию.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике животных Университета Радбуда Неймегена.

ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанные, здоровые дикие мыши типа (N No 4) и cd44-/- (n q 4) мыши были принесены в жертву в возрасте от 12 до 16 недель. Использовались как самцы, так и самки мышей. Все мыши были на фоне C57Bl/6.

1. Вскрытие почки мыши

1. Пожертвование здоровых мышей WT или генетически измененных мышей путем вывиха шейки матки.
2. Вскрывайте целые мышиные почки сразу после того, как пожертвуют мышами. Для этого выполните медианную лапаротомию с помощью брюшных ножниц, разрезая кожу, а затем мышцы живота. Удалить кишечник и поместите его рядом с мышью.
3. Освободите почки от соединительной ткани и вытащите почку с помощью хирургических щипцов, разрезая почечную артерию, почечную вену и мочеточника ножницами.
4. Удалите почечные капсулы из почек, удерживая почки с хирургическими щипцами и снять капсулу с помощью другой пары щипцов.
5. Поместите почки в 6-ну клеточной культуры пластины (2 почки / хорошо), подготовленные с 2 мл сбалансированного раствора соли Хэнкса (HBSS) в колодец и место на льду.

2. Изоляция гломерули из мышиной почки

1. Перенесите почки в 100 мм чашку Петри и фарш почки в мелкие кусочки 1-2 мм с помощью двух скальпелей. Держите измельченные кусочки почки влажными, используя 1-2 мл HBSS.
2. Поместите фарш куски почки на вершине 300 мкм металлического сито и нажмите почки через сито с помощью поршеня 20 мл шприца. Повторно промыть сито с HBSS между ними и собирать поток через в чистой чашке Петри с помощью серологических пипет. Соберите также все, что остается / палочки в нижней стороне сито, соскоб его с скальпелем и передать его в собранный поток через (гомогенат почек).
3. Промыть гомогенат почек через 75-м сито с HBSS. Соберите поток через и затем промыть этот поток через 53 мкм сито. Вымойте оба сито с помощью HBSS для удаления всех небольших структур.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе поток, хотя только промыть, но не нажата через 75 мкм и 53 мкм сито. Мытье с HBSS необходимо для удаления мусора и небольших структур на сито. Поэтому обычно в общей сложности используется 200–300 мл HBSS.
4. Соберите структуры почки/материал, которые остаются на 75 мкм и 53 мкм сито, промывая верхнюю поверхность сито с модифицированной средой Орла Dulbecco (DMEM) дополнены 20% фетальной сыворотки икры (FCS) и передачи материала в 6-хорошо ультра-низкой микропластечной привязанности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для мытья верхней поверхности сито, промыть сито в наклонном положении ()gt;45 ") и собрать материал почек на краю сито. Собранный материал обогащается как для инкапсулированного, так и для декапсулированного гломерули, показывая лишь несколько трубчатых фрагментов. Инкапсулированные гломерули очень липкие. Поэтому для сбора одногломерули важно предотвратить то, чтобы гломерули прилип к поверхности чашки Петри или хорошо пластины. Чтобы избежать присоединения, используйте среды с 20% FCS и использовать ультра-низкие пластины крепления для этого шага.

3. Культивирование гломерулярных наростов

1. Принесите ультра-низкое вложение микроплиты к перевернутому световому микроскопу и соберите одиночный инкапсулированный и/или декапсулированный гломерули с пипеткой 20 МЛ. Избегайте трубирования других конструкций и мусора. После сбора одного glomerulus в наконечник пипетки, добавить свежие DMEM среды без собранного материала почек в тот же наконечник пипетки на объем 20 МЛ.
2. Передача одного glomerulus с 20-Л DMEM среды к центру колодца 24-ну клеточной культуры пластины и инкубировать в течение 3 ч при 37 градусов по Цельсию и 5% (v/v) CO_2, чтобы позволить крепление glomerulus к центру колодца. Тщательно переместите пластину, чтобы избежать плавания glomerulus к бордеры скважины.
3. После 3 ч инкубации, glomerulus прилагается к центру колодца. Тщательно добавьте 500 мл эндотелиальной базальной среды (EBM) дополнены набор фактора роста, содержащий гидрокортизон, человеческий эндотелиальный фактор роста, экстракт бычьего мозга и гентамицин сульфат-амфотерицин B(Таблица материалов)и дополнительные 5% (v/v) FBS и 1% (v/v) пенициллин/стрептмицин (пен/ стрептомицин)
4. Культура одного гломерули в течение 6 дней при 37 градусов по Цельсию, 5% (v/v) CO₂.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В течение 6 дней образуются нарост, состоящий из теменной эпителиальных клеток. Если кто-то стремится проверить влияние конкретных соединений или препаратов на теменной эпителиальных клеток она должна быть добавлена в среду в течение этого шестидневного периода.

4. Анализ пролиферации теменной эпителиальной клетки

1. Проанализируйте гломерулярный нарост через 6 дней. Возьмите микроскопические изображения с помощью цифрового перевернутого светового микроскопа.
2. Используйте программное обеспечение для анализа изображений (например, ImageJ/FIJI) для определения площади поверхности и диаметра гломерулярного нароста, а также количества переросевых клеток или вырастающие гломерули.
   1. Чтобы определить площадь поверхности гломерулярного нароста, откройте tif. файл гломерулярного нароста с масштабом бар в ImageJ. Нарисуйте прямую линию на строке шкалы и определите расстояние в пикселях, нажав на анализ и измерение (например, 1 мм и 460 пикселей).
   2. Определите шкалу, нажав на анализ,установите шкалу и введите известное расстояние в пикселе (например, 460), а также введите известное расстояние (например, 1) и единицу длины (например, 1 мм). Нажмите ОК.
   3. Определите, какие результаты будут отображаться в таблице результатов, нажав на анализ, а затем установите измерения. Чтобы определить площадь поверхности гломерулярного нароста, активируйте область параметров и этикетку дисплея. Нажмите ОК.
   4. Чтобы определить площадь поверхности гломерулярного нароста, нарисуйте выбор от руки вокруг гломерулярного нароста. Нажмите на анализ, а затем измерьте, таблица результатов появится в ImageJ, показывающей область поверхности нароста в ранее определенной шкале (см. шаг 4.4, например, мм^2).

5. Характеристика гломерулярных наростов клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки клеточного состава нарост, иммунофлуоресценция окрашивания для клеточной конкретных маркеров выполняются на гломерулярных наростов на т 6 дней.

1. Аккуратно удалите средний и аккуратно промойте гломерули дважды, используя фосфат-буферизированный солевой раствор (PBS).
2. Фиксировать в течение 10 минут при комнатной температуре с использованием 2% (w/v) параформальдегид (PFA) дополняется 4% (w/v) сахарозой в PBS и тщательно мыть 2x с помощью PBS.
3. Инкубировать первичным антителом с соответствующей концентрацией(Таблица материалов),разбавленной в PBS-овинной сыворотке альбумин (BSA) 1% (v/v) на 1 ч при комнатной температуре.
4. Удалите раствор антитела и тщательно вымыть 3x с PBS.
5. Инкубировать вторичным антителом(Таблица материалов),разбавленным в PBS-BSA 1% (v/v) в темноте в течение 45 мин при комнатной температуре.
6. Тщательно мыть 3x с PBS и смонтировать с помощью 1'2 капель aqueous монтажа среды с 4 ,6-diamidino-2-фенилиндол (DAPI), чтобы визуализировать ядра и покрыть хорошо с круглой крышкой скольжения.
7. С помощью флуоресцентного микроскопа возьмите микроскопические снимки.

Результаты

На рисунке 1показана систематическая диаграмма метода выполнения гломерулярного анализа наростов. Рисунок 2A-D показывает гломерулярные наросты инкапсулированного гломерули в разных точках времени, как это наблюдается с помо...

Обсуждение

Используя протокол, описанный в этой статье, можно использовать одиночные инкапсулированные гломерули для оценки тейетальной эпителиальной пролиферации клеток, которая является следствием тейетальной активации клеток. Эта модель ex vivo позволит нам детально изучить молекулярные пути...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well cell culture plate	Corning Costar
anti-CD31	BD Pharmingen	Endothelial cell marker (used concentration 1:200)
chicken-anti-rat Alexa 647	Thermo Fisher	(used concentration 1:200)
DAPI-Fluoromount G	Southern Biotech	Mounting medium containing DAPI
Digital inverted light microscope	Westburg, EVOS fl microscope
donkey-anti-goat Alexa 568	Thermo Fisher	(used concentration 1:200)
donkey-anti-rabbit Alexa 568	Thermo Fisher	(used concentration 1:200)
Dulbecco's Modified Eagle's medium	Lonza
EBM Medium	Lonza
EBM-MV Single Quots kit	Lonza	containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE
Fetal Bovine Serum	Lonza
Fetal Calf Serum	Lonza
Fluorescent microscope	Leica Microsystems GmbH
goat-anti-synaptopodin	Santa Cruz	Podocyte marker (used concentration 1:200)
Hanks'Balanced Salt Solution	Gibco
ImageJ software	FIJI 1.51n
petri dish	Sarstedt	size 100
rabbit-anti-claudin1	Abcam	Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100)
rabbit-anti-SSeCKS	Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA	kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker
rat-anti-CD44	BD Pharmingen	Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200)
scalpel	Dahlhausen	size 10
Sieves	Endecotts Ltd	size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel
syringe	BD Plastipak	size: 20 ml
Ultra-Low Attachment Microplates	Corning Costar	6-well plates