Glomeruläres Outgrowth als Ex-Vivo-Assay zur Analyse von Pfaden, die an der Parietalepithel Cell Activation beteiligt sind

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Kultivierung und Analyse glomerulären parietalen Epithelzellauswüchsen von verkapselten Glomeruli, die aus der Mausniere isoliert sind. Diese Methode kann verwendet werden, um Wege zu untersuchen, die an der Proliferation und Migration von parietalen Epithelzellen beteiligt sind.

Zusammenfassung

Die Aktivierung der Parietalepithelzelle (PEC) ist einer der Schlüsselfaktoren, die an der Entwicklung und Progression der Glomerulosklerose beteiligt sind. Die Hemmung von Wegen, die an der Aktivierung parietaler Epithelzellen beteiligt sind, könnte daher ein Werkzeug sein, um das Fortschreiten glomerulärer Erkrankungen abzumildern. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Kultur und Analyse parietaler Epithelzellauswüchse von verkapselten Glomeruli, die aus der Mausniere isoliert wurden. Nach der Sezieren isolierter Mausnieren wird das Gewebe gehackt, und Glomeruli werden durch Sieben isoliert. Verkapselte Glomeruli werden gesammelt, und einzelne Glomeruli werden für 6 Tage kultiviert, um ein glomeruläres Auswachsen von parietalen Epithelzellen zu erhalten. Während dieser Zeit kann die Verbreitung und Migration von parietalen Epithelzellen analysiert werden, indem die Zellzahl oder die Oberfläche der auswachsenden Zellen bestimmt wird. Dieser Assay kann daher als Werkzeug verwendet werden, um die Auswirkungen einer veränderten Genexpression bei transgenen oder Knockout-Mäusen oder die Auswirkungen von Kulturbedingungen auf parietale Epithelzellwachstumseigenschaften und Signalisierung zu untersuchen. Mit dieser Methode können wichtige Wege untersucht werden, die am Prozess der parietalen Epithelzellaktivierung und damit bei Glomerulosklerose beteiligt sind.

Einleitung

Glomeruläre Erkrankungen sind eine wichtige Gruppe von Nierenerkrankungen und stellen eine Hauptursache für Nierenerkrankungen im Endstadium (ESRD) dar. Leider sind spezifische Behandlungsmöglichkeiten begrenzt, und der Übergang zum ESRD ist unvermeidlich. Glomeruläre Erkrankungen werden durch das Vorhandensein von glomerulären Verletzungen definiert und können in entzündlichen und nicht-entzündlichen Erkrankungen gruppiert werden. Obwohl die anfängliche Beleidigung anders ist, haben neuere Studien gezeigt, dass ein gemeinsamer zellulärer Mechanismus zu glomerulärer Epithelzellhyperplasie und letztlich zu Glomerulosklerose bei allen glomerulären Erkrankungen führt, unabhängig von der zugrunde liegenden Ursache^1,2,3,4.

Insbesondere wurde gezeigt, dass glomerulosklerotische Läsionen hauptsächlich aus aktivierten parietalen Epithelzellen^5,6bestehen. Unter physiologischen Bedingungen sind parietale Epithelzellen flache, ruhende Epithelzellen, die die Bowman-Kapsel des Glomerulus säumen. Jedoch kann jede glomeruläre Verletzung, die entweder auf genetische Mutationen (z. B. Podozytenspezifische oder mitochondriale Zytopathien), Entzündungen oder Hyperfiltrationen (z. B. verursacht durch verminderte Nierenmasse, Bluthochdruck, Fettleibigkeit oder diabetischen Mellitus) zurückzuführen sind, die Aktivierung parietaler Epithelzellen auslösen. Aktivierte parietale Epithelzellen vermehren sich und deponieren extrazelluläre Matrix, was zur Bildung von zellulären Halbmonken oder sklerotischen Läsionen^5,7,8führt. Das Fortschreiten dieser Prozesse führt zum Verlust der Nierenfunktion⁹. Daher ist die Aktivierung der parietalen Epithelzellaktivierung ein Schlüsselfaktor für die Entwicklung und das Fortschreiten der Glomerulosklerose bei entzündlichen und nicht-entzündlichen glomerulären Erkrankungen^1,2,3,4,10.

Die molekularen Prozesse, die die Aktivierung parietaler Epithelzellen vermitteln, sind noch weitgehend unbekannt. Jüngste Studien zeigen, dass aktivierte parietale Epithelzellen de novo EXPRESS CD44, ein Rezeptor, der für die Aktivierung verschiedener Wege an der Zellproliferation und Migration beteiligt ist. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Hemmung von CD44 die aktivierung der parietalen Epithelzellaktivierung hemmt und das Fortschreiten der Halbmondbildung und Glomerulosklerose in Tiermodellen entzündlicher sowie nichtentzündlicher glomerulärer Erkrankungen^11,12abmildert.

Da die Aktivierung der parietalen Epithelzellen ein wichtiger Akteur für die Entwicklung von Glomerulosklerose und Halbmondbildung ist, könnte die Hemmung dieser Zellen das Fortschreiten glomerulärer Erkrankungen verlangsamen. Die Aufklärung der molekularen Bahnen, die die Aktivierung parietaler Epithelzellen vorantreiben, kann zur Entwicklung spezifischer therapeutischer Interventionen führen, die die Bildung der hyperplastischen und glomeruloklerotischen Läsionen bei glomerulären Erkrankungen dämpfen.

In experimentellen Tiermodellen ist es häufig schwierig, Beweise für eine direkte Wirkung einer veränderten Genexpression (Knock-out-Modelle oder transgene Mausmodelle) oder einer medikamentösen Behandlung auf die parietalen Epithelzellen zu liefern. Bei einer herkömmlichen Knock-out-Maus können die beobachteten In-vivo-Veränderungen durch direkte Veränderungen in parietalen Epithelzellen erklärt werden. Da die Genexpression jedoch auch in anderen Zelltypen innerhalb der Maus verändert wird, kann man indirekte Effekte, die von anderen Zelltypen vermittelt werden, nicht ausschließen. Die Entwicklung von bedingten Cre-Lox-Mäusen, die von Promotoren angetrieben werden, die hauptsächlich in parietalen Epithelzellen aktiv sind, hat in einigen Fällen eine Lösung für¹³geliefert. Dennoch sind bedingte transgene Modelle komplex, und obwohl mehr bedingte Linien verfügbar werden, gibt es für viele der herkömmlichen Knock-out- oder transgenen Mauslinien noch keinen bedingten Ersatz.

Um die direkten Auswirkungen auf parietale Epithelzellen zu untersuchen, hat unsere Gruppe einen Ex-vivo-Assay mit einzelnen verkapselten Glomeruli entwickelt, die aus Mausnieren isoliert wurden, um die Proliferation und Migration parietaler Epithelzellen zu messen und zu analysieren. Diese Methode wird es uns ermöglichen, parietale epitheliale zellspezifische Effekte zu bestimmen und verantwortliche Wege für die Aktivierung parietaler Epithelzellen zu finden und Behandlungsoptionen zu testen, um diese Aktivierung zu hemmen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien der Tierethikkommission der Radboud Universität Nijmegen durchgeführt.

HINWEIS: Unbehandelte, gesunde Wildtyp-Mäuse (n = 4) und cd44-/- (n = 4) Mäuse wurden im Alter von 12 bis 16 Wochen geopfert. Es wurden sowohl männliche als auch weibliche Mäuse verwendet. Alle Mäuse waren auf dem C57Bl/6 Hintergrund.

1. Maus-Nieren-Sektion

1. Opfern Sie gesunde WT-Mäuse oder genetisch veränderte Mäuse durch zervikale Dislokation.
2. Sezieren Sie ganze Mausnieren direkt nach dem Opfern der Mäuse. Führen Sie dazu eine mediane Laparotomie mit einer Bauchschere durch, schneiden Sie die Haut und dann die Bauchmuskeln. Entfernen Sie den Darm und legen Sie ihn neben die Maus.
3. Befreien Sie die Nieren vom Verbinden des Gewebes und ziehen Sie die Niere mit chirurgischen Zangen heraus, schneiden Sie die Nierenarterie, Nierenvene und Harnleiter mit einer Schere.
4. Entfernen Sie die Nierenkapseln von den Nieren, indem Sie die Niere mit chirurgischen Zangen halten und ziehen Sie die Kapsel mit einem anderen Paar Zangen ab.
5. Die Nieren in eine 6-Well-Zellkulturplatte (2 Nieren/gut) mit 2 ml Von Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS) pro Brunnen aufbereiten und auf Eis legen.

2. Isolierung von Glomeruli von der Mausniere

1. Die Nieren in eine 100 mm Petrischale geben und die Nieren mit zwei Skalpellen in kleine Stücke von 1 x 2 mm zerkleinern. Halten Sie die gehackten Nierenstücke nass mit 1 x 2 ml HBSS.
2. Legen Sie die gehackten Nierenstücke auf ein 300 m großes Metallsieb und drücken Sie die Niere mit einem Kolben einer 20 ml Spritze durch das Sieb. Spülen Sie das Sieb mit HBSS dazwischen wiederholt ab und sammeln Sie den Durchfluss in einer sauberen Petrischale mit einer serologischen Pipte. Sammeln Sie auch alles, was an der Unterseite des Siebes bleibt/klebt, indem Sie es mit dem Skalpell abkratzen und auf den gesammelten Durchfluss (Nierenhomogenat) übertragen.
3. Spülen Sie die Niere durch ein 75-m-Sieb mit HBSS. Sammeln Sie den Durchfluss und spülen Sie diesen Durchfluss anschließend durch ein 53 m Sieb. Waschen Sie beide Siebe mit HBSS, um alle kleineren Strukturen zu entfernen.
   ANMERKUNG: In diesem Schritt wird der Durchfluss nur durch das 75-m- und 53-m-Sieb gepresst, aber nicht gedrückt. Das Waschen mit HBSS ist notwendig, um Schmutz und kleinere Strukturen auf den Sieben zu entfernen. Daher werden in der Regel insgesamt 200 bis 300 ml HBSS verwendet.
4. Sammeln Sie die Nierenstrukturen/-materialien, die auf dem 75'm- und 53-m-Sieb verbleiben, indem Sie die Oberseite der Siebe mit dem modifizierten Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco mit 20% fetalem Kalbsserum (FCS) waschen und das Material in eine 6-Well ultra-low Attachment Mikroplatte übertragen.
   HINWEIS: Um die Oberseite des Siebes zu waschen, spülen Sie das Sieb in einer gekippten Position (>45°) ab und sammeln Sie das Nierenmaterial am Rand des Siebs. Das gesammelte Material ist für gekapselte sowie entkapselte Glomeruli angereichert und zeigt nur wenige röhrenförmige Fragmente. Verkapselte Glomeruli sind sehr klebrig. Um einzelne Glomeruli zu sammeln, ist es daher wichtig, zu verhindern, dass Glomeruli an der Oberfläche einer Petrischale oder einer Brunnenplatte haften. Um die Haftung zu vermeiden, verwenden Sie Medium mit 20% FCS und verwenden Sie ultra-niedrige Befestigungsplatten für diesen Schritt.

3. Kultivierung des glomerulären Auswuchses

1. Bringen Sie die ultra-niedrige Befestigungsmikroplatte zu einem invertierten Lichtmikroskop und sammeln Sie einzelne gekapselte und/oder gekapselte Glomeruli mit einer 20-L-Pipette. Vermeiden Sie Pipettierung anderer Strukturen und Trümmer. Nach dem Sammeln eines einzelnen Glomerulus in der Pipettenspitze, fügen Sie frisches DMEM-Medium ohne gesammeltes Nierenmaterial in die gleiche Pipettenspitze zu einem Volumen von 20 l.
2. Übertragen Sie den einzelnen Glomerulus mit dem 20-L-DMEM-Medium in die Mitte eines Brunnens einer 24-Well-Zellkulturplatte und brüten für 3 h bei 37 °C und 5% (v/v)_CO2, um die Befestigung des Glomerulus an der Mitte des Brunnens zu ermöglichen. Bewegen Sie die Platte vorsichtig, um das Schweben des Glomerulus zu den Boardern des Brunnens zu vermeiden.
3. Nach 3 h Inkubation ist der Glomerulus an der Mitte des Brunnens befestigt. Fügen Sie sorgfältig 500 l Endothel-Basalmedium (EBM) hinzu, ergänzt durch ein Wachstumsfaktor-Kit, das Hydrocortison, humanen endothelialen Wachstumsfaktor, Rinderhirnextrakt und Gentamicinsulfat-Amphotericin B (Materialtabelle)und zusätzliche 5% (v/v) FBS und 1% (v/v) Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) enthält.
4. Kultur die einzelnen Glomeruli für 6 Tage bei 37 °C, 5% (v/v) CO₂.
   HINWEIS: Innerhalb von 6 Tagen bildet sich das Auswuchs, das aus parietalen Epithelzellen besteht. Wenn man die Auswirkungen bestimmter Verbindungen oder Medikamente auf die parietalen Epithelzellen testen will, sollte es innerhalb dieses Sechs-Tage-Zeitraums dem Medium zugesetzt werden.

4. Analyse der parietalen Epithelzellproliferation

1. Analysieren Sie das glomeruläre Auswuchs nach 6 Tagen. Nehmen Sie mikroskopische Bilder mit einem digitalen invertierten Lichtmikroskop auf.
2. Verwenden Sie eine Bildanalyse-Software (z. B. ImageJ/FIJI), um die Oberfläche und den Durchmesser des glomerulären Auswuchses und die Anzahl der auswachsenden Zellen oder überwachsenden Glomeruli zu bestimmen.
   1. Um die Oberfläche des glomerulären Auswuchses zu bestimmen, öffnen Sie das tif. Datei des glomerulären Auswuchses mit Skalenbalken in ImageJ. Zeichnen Sie eine gerade Linie auf der Maßstabsleiste und bestimmen Sie den Abstand in Pixeln, indem Sie auf Analysieren und Messen klicken (z. B. 1 mm = 460 Pixel).
   2. Bestimmen Sie die Skala, indem Sie auf analysierenklicken, die Skala festlegen und den bekannten Abstand in Pixel (z. B. 460) eingeben, geben Sie auch den bekannten Abstand (z. B. 1) und die Längeneinheit (z. B. 1 mm) ein. Klicken Sie auf OK.
   3. Bestimmen Sie, welche Ergebnisse in der Ergebnistabelle angezeigt werden, indem Sie auf Analysieren klicken und dann Messungen festlegen. Um die Oberfläche des glomerulären Auswachsens zu bestimmen, aktivieren Sie den Optionsbereich und die Anzeigebeschriftung. Klicken Sie auf OK.
   4. Um die Oberfläche des glomerulären Auswuchses zu bestimmen, ziehen Sie eine Freihandauswahl um das glomeruläre Auswachsen. Klicken Sie auf Analysieren und dann messen, eine Ergebnistabelle erscheint in ImageJ, die die Fläche des Auswachsens in der zuvor ermittelten Skala anzeigt (siehe Schritt 4.4, z. B. mm²).

5. Charakterisierung des glomerulären Zellwachstums

HINWEIS: Um die zelluläre Zusammensetzung des Auswuchses zu beurteilen, werden Immunfluoreszenzfärbungen für zellspezifische Marker an den glomerulären Auswüchsen bei t = 6 Tagen durchgeführt.

1. Entfernen Sie das Medium vorsichtig und waschen Sie die Glomeruli vorsichtig zweimal mit phosphatgepufferter Saline (PBS).
2. Fixieren Sie für 10 min bei Raumtemperatur mit 2% (w/v) Paraformaldehyd (PFA) ergänzt mit 4% (w/v) Saccharose in PBS und sorgfältig 2x mit PBS waschen.
3. Mit dem primärantikörper mit entsprechender Konzentration (Materialtabelle) in PBS-Ovine Serumalbumin (BSA) 1% (v/v) für 1 h bei Raumtemperatur verdünnt inkubieren.
4. Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie 3x sorgfältig mit PBS.
5. Inkubieren mit sekundärem Antikörper (Materialtabelle) in PBS-BSA 1% (v/v) im Dunkeln für 45 min bei Raumtemperatur verdünnt.
6. 3x mit PBS sorgfältig waschen und mit 1-2 Tropfen wässrigem Montagemedium mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) montieren, um Kerne zu visualisieren und den Brunnen mit einem runden Deckelschlupf zu bedecken.
7. Nehmen Sie mikroskopische Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop auf.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Abbildung 1zeigt ein systematisches Diagramm der Methode zur Durchführung des glomerulären Auswuchs-Assays. Abbildung 2A-D zeigt glomeruläre Auswüchse von gekapselten Glomeruli zu verschiedenen Zeitpunkten, wie sie mit der Lichtmikroskopie beobachtet wurden. Auswüchse werden an Tag 2, 4 und 6 (Abbildung 2B-D) in der Kultur nach Glomerulus-Isolierung von der Maus...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Mit dem in diesem Artikel beschriebenen Protokoll kann man einzelne gekapselte Glomeruli verwenden, um die parietale Epithelzellproliferation zu bewerten, die eine Folge der parietalen Epithelzellaktivierung ist. Dieses Ex-vivo-Modell wird es uns ermöglichen, die molekularen Bahnen, die an der parietalen Epithelzellaktivierung beteiligt sind, im Detail zu untersuchen. Die beschriebene Methode beruht auf dem einfachen Konzept der Nierensektion und Siebung, um verkapselte Glomeruli zu isolieren und zu kulturieren und die ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well cell culture plate	Corning Costar
anti-CD31	BD Pharmingen	Endothelial cell marker (used concentration 1:200)
chicken-anti-rat Alexa 647	Thermo Fisher	(used concentration 1:200)
DAPI-Fluoromount G	Southern Biotech	Mounting medium containing DAPI
Digital inverted light microscope	Westburg, EVOS fl microscope
donkey-anti-goat Alexa 568	Thermo Fisher	(used concentration 1:200)
donkey-anti-rabbit Alexa 568	Thermo Fisher	(used concentration 1:200)
Dulbecco's Modified Eagle's medium	Lonza
EBM Medium	Lonza
EBM-MV Single Quots kit	Lonza	containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE
Fetal Bovine Serum	Lonza
Fetal Calf Serum	Lonza
Fluorescent microscope	Leica Microsystems GmbH
goat-anti-synaptopodin	Santa Cruz	Podocyte marker (used concentration 1:200)
Hanks'Balanced Salt Solution	Gibco
ImageJ software	FIJI 1.51n
petri dish	Sarstedt	size 100
rabbit-anti-claudin1	Abcam	Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100)
rabbit-anti-SSeCKS	Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA	kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker
rat-anti-CD44	BD Pharmingen	Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200)
scalpel	Dahlhausen	size 10
Sieves	Endecotts Ltd	size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel
syringe	BD Plastipak	size: 20 ml
Ultra-Low Attachment Microplates	Corning Costar	6-well plates