מערכת הזרמה אוטומטית לעיבוד תאים בקנה מידה קטן

Summary

אוטומציה היא המפתח לשינוי קנה מידה וניהול עלויות בייצור תאים. כתב יד זה מתאר את השימוש בהתקן זרימת תאים צנטריפוגליים לאוטומציה של החלפת מאגר ושלבי הריכוז של התא לצורך ביוביוטינג בקנה מידה קטן.

Abstract

מסחור מוצלח של גנים וטיפולים מבוססי תאים דורש תהליכי ייצור יעילים ומדרגיים. המרת מאגר וריכוז המוצר הם רכיבים חיוניים עבור רוב תהליכי הייצור. עם זאת, בשלבים המוקדמים של פיתוח המוצר, שלבים אלה מבוצעים לעתים קרובות באופן ידני. צנטריפוגה מבוי סתום ידני עבור חילופי מאגרים היא אינטנסיבית לעבודה, יקרה ולא מדרגית. מערכת אוטומטית סגורה יכולה לבטל ביעילות את שלב העמל הזה, אך ההטמעה יכולה להיות מאתגרת. כאן, אנו מתארים מכשיר חדש לעיבוד תאים מפותח המתאים לעיבוד תאים קטנים עד בינונית בקנה מידה ומטרתו לגשר על הפער בין עיבוד ידני ואוטומציה בקנה מידה גדול. פרוטוקול זה ניתן להחיל בקלות על סוגי תאים שונים ותהליכים על ידי שינוי קצב הזרימה ומהירות צנטריפוגה. הפרוטוקול שלנו הפגין שחזור תאים גבוה עם זמני עיבוד קצרים בהשוואה לתהליך הידני. תאים ששוחזרו מהתהליך האוטומטי שמרו גם על שיעורי ההתפשטות שלהם. ניתן להחיל את ההתקן כרכיב מודולרי בתהליך ייצור סגור כדי להתאים לשלבים כגון חילופי מאגרים, ניסוח תאים והקפאה קריוגנית.

Introduction

הנוף של הרפואה המודרנית השתנה במהירות באמצעות ההתפתחויות האחרונות בגנים ובטיפולים מבוססי תא (GCT). כאחד התחומים הגדלים המהיר ביותר במחקר הטרנסלטיטי, המגזר GCT גם מתמודד עם אתגרים ייחודיים וחסרי תקדים. בנוסף התוצאות הקליניות חזקים, יעיל וחסכוני תהליכי הייצור חיוניים הצלחה מסחרית של GCT, אשר קשה במיוחד להשיג בקנה מידה קטן של ייצור¹. עלות הזמן, העבודה, הבטחות איכות מוגדלים כאשר כל קבוצה של תאים מייצרת רק כמה מינונים עבור מטופל אחד במקום מאות או אלפים. בניגוד לטיפולים בתאי האלוגנאית בהם תהליכי הייצור הם יותר דומה לייצור של נוגדנים וחלבונים רקומביננטי, הטיפולים בתאי האוטוולוגי מיוצרים בדרך כלל כפעולות בקנה מידה קטן¹. כתופעה חדשה יחסית בייצור ביופרמקולוגיה², אפשרויות עיבוד תא בקנה מידה קטן מוגבלות כיום.

החלפת מאגר חיונית לייצור תאים. זהו אחד התהליכים במורד הזרם שבו התאים מוסרים ממדיית התרבות ומרוכז עבור קריוגנית או אינפוזיה. כיום, ייצור תאים בקנה מידה קטן מחיל לעתים קרובות תהליכים דומים לאלה בהגדרת המחקר האקדמי ומסתמך על חדרים נקיים מיוחדים כדי לשמור על עקרות³. תהליכי במורד הזרם ידני להשתמש בצנטריפוגות שחקן הראש כדי גלולה להשעות את התאים להפחתת נפח והחלפת מאגר. התהליכים הפתוחים הללו יקרים (כלומר, עבודה ותחזוקה בחדר נקי) ויש להם יכולת ייצור מוגבלת, שאינם אידיאליים לייצור מסחרי^2,3.

יישום האוטומציה הוצע כפתרון לשיפור יעילות הייצור והשגת הפקות בקנה מידה מסחרי². אין אפשרות להשיג עקרות במוצרים מבוססי-תא באמצעות שיטות מסורתיות המשמשות למוצרי ביולוגי, כגון הקרנה גאמה או סינון קצה מסוף. במקום זאת, מערכת סגורה אוטומטית נפרס כדי להפחית את הסיכונים של זיהום ואופרטורים המתבססים על חדרים נקיים כדי לשמור על עקרות⁴. אוטומציה של תהליך גם מטפלת בנושא המדרגיות על-ידי הפעלת מערכות מרובות הפועלות במקביל (היקף) או הגדלת קיבולת העיבוד של התקן בודד (היקף), אשר בתורו ממזער את השונות בין אופרטורים. יתרה מזאת, ניתוח מודל העלות של טיפולים עצמיים עולה כי אוטומציה עשויה להפחית את העלות של ייצור^5,6. עם זאת, אין תועלת בעלות נמצא בתא גזע אוטוולוגי בניסוי קליני שבו פלטפורמת ייצור אוטומטית שימש⁷, רומז כי העלות היתרון של האוטומציה עשויה להיות תלויה בתהליך הייצור הפרטני.

קיימות אסטרטגיות שונות שבהן ניתן להציג אוטומציה בתהליך ייצור קיים. ניתן להשיג זאת גם על ידי יישום פלטפורמה משולבת מלאה או שרשרת עיבוד מודולרית מודולרי. קיימות מספר פלטפורמות משולבות באופן מלא הזמינות מסחרית עבור ייצור תאים אוטוולוגי, כגון הפלא של הדיג (Miltenyi Biotec), קוקון (ביוטכנולוגיה), ו קוונטום (טרמו BCT). פלטפורמות משולבות אלה, המתוארות לעתים קרובות כ-GMP-in-box, הן בעלי דרישות נמוכות לגבי תשתיות והן קלות לתפעול. עם זאת, יכולת הייצור של התקנה משולבת מלאה עשויה להיות מוגבלת על-ידי החממה המצורפת למערכת. לדוגמה, יכולת ה-culturing של הפרודיג'י מוגבלת לחדר 400 mL שלו⁸ ולמחסנית הקוונטית יש שטח מוגבל למשטח שהוגדר ל-2.1 m² (שווה ערך ל 120 T175 מבחנות)⁷, שייתכן שלא יספיק למטופלים המחייבים מינונים גבוהים יותר של תאים^9,10. בנוסף, הפלא והקוונטים יש תכונה נפוצה המגבילה את השימוש בהם: היחידה המבצעית מאוכלס על ידי קבוצה אחת של תאים לאורך תקופת התרחבות התא, ובכך להגביל את מספר הקבוצות שניתן לייצר על ידי כל יחידה¹¹. הגישה המודולארית לאוטומציה היא יצירת שרשרת ייצור עם יחידות מודולריות מרובות המדמה את תהליך הייצור המסחרי^12,13. גישה זו, אשר מפרידה את מכשיר התרבות ממכשיר הכביסה התא, יכול ובכך למקסם את יעילות הייצור. התקן עיבוד אידיאלי יהיה אחד כי הוא הסתגלות ומדרגי לייצור צרכים¹².

הטכנולוגיה הצנטריפוגה (CFC), שתחילתה בשנות ה-70, היתה היסטוריה ארוכה בעיבוד תאים¹⁴. היא משיגה ריכוז והפרדה של תאים על-ידי איזון כוח צנטריפוגלי עם כוח זרימה נגדית. בדרך כלל, השעיית תא נכנס מהקצה הצר של תא התא תחת קצב זרימה קבוע תוך נתון לכוח צנטריפוגלי (איור 1א). זרימת הנוזל מופעל בכיוון ההפוך אל הכוח הצנטריפוגלי. הדבר נקרא כוח הזרימה הנגדית, היוצר מעבר צבע בתוך תא התא. כוח הזרימה הנגדית פוחת כאשר תא התא מתרחב מקצה תא התא המעוצב בצורת חרוט. תאים עם צפיפות גבוהה יותר קוטר גדול יותר יש קצב משקעי גבוה יותר, ולכן הם מגיעים כוח שיווי משקל לכיוון קצה של תא בצורת חרוט. חלקיקים קטנים יותר עלולים להגיע לשיווי האיזון כלפי בסיס החדר, או להיות קטנים מדי כדי להישמר בחדר והוא יישטף. הטכנולוגיה CFC ידועה בעיקר היישום שלה בעיבוד מוצרי apheresis כגון בידוד מונוציטים עבור טיפולים סלולריים הדנדריטים^15,16. במונחים של חילופי מאגר, הטכנולוגיה CFC הוחלה רק בייצור בקנה מידה גדול¹⁷ ועדיין לשמש לייצור בקנה מידה קטן יותר של טיפולים אוטוולוגיים.

כדי לטפל בצורך בהתקן מתאים לייצור תאים בקנה מידה קטן, התקן CFC אוטומטי (ראה טבלת חומרים), פותח לאחרונה¹⁸. מכשיר העיבוד האוטומטי של התא משתמש בטכנולוגיה צנטריפוגה של זרימה נגדית כדי להסיר פסולת תאים ולהקל על החלפת מאגר. המכשיר מבצע חילופי מאגר עם ערכת שימוש יחיד שניתן לתקן באמצעות שקית העברת תאים, דבר המאפשר עיבוד תאים בתוך מערכת סטרילית ותחומה. כאן, אנו חוקרים את השימוש במכשיר מתקן צנטריפוגלי לבצע חילופי מאגרים בתרביות תאים של מיונקים בפרוטוקולים אוטומטיים. במחקר זה, בדקנו את פרוטוקול חילופי מאגר באמצעות תאים ויוקאט ותאי סטרומה mesenchymal (MSCs) כדי לדגמן סוגים שאינם מחסיד ותאי תאים, בהתאמה. התאים של ג'ורקאט הם תאים מונצח לעתים קרובות משמש למחקר של לוקמיה תא T חריפה^19,20. MSCs הם תאי גזע למבוגרים אשר נחקרו בניסויים קליניים אנושיים עבור מגוון רחב של מחלות⁹.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים ותאים להחלפת מאגר

1. הכן מאגרים (ראה טבלת חומרים) במכסה זרימה למינארי בדרגה 2. באמצעות מזרק מחט הרכבה, להסיר 50 mL של פתרון מלוחים משקית מלוחים 500 mL. להחליף את זה עם 50 mL של 20% סרום האדם (HSA) לעשות 2% HSA ב מלוחים, אשר ישמש את המאגר לשטוף.
2. הסר את התאים מכלי התרבות ובצע ספירת תאים כדי לקבוע את כמות התאים והכדאיות ההתחלתית על-ידי החרגת כחול מטריפי. טען את התאים לשקית העברה.
   הערה: בפרוטוקול זה התאים של ג'ורקאט היו מתורבתים ב-RPMI ו-MSCs היו מתורבתים ב-Dמאמ: F12. שני התקשורת התבצעה בתוספת של 10% סרום בפרה עוברית (FBS) ו 1% אנטיביוטי-Antimycotic פתרון. תאים היו מתורבתים ב 37 ° c עם 5% CO₂. עבור תאים MSCs או מחסיד, הוסף אנזים עיכול (למשל, טריפסין) לכלי התרבות כדי לנתק את התאים, וכיבוי מדיית התרבות ברגע שהתאים מנותקים. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בשקית העברה כי התאים הורחבו בכלי התרבות. עם זאת, אם התאים הם מתורבתים בשקית של תרבות התא, זה יכול להיות מחובר ישירות לקיט לשימוש יחיד באמצעות ריתוך צינור סטרילי. בפרוטוקול זה, או 3 x 10⁷ כיוקט תאים או 1 x 10⁷ MSCs שימשו עבור כל לרוץ, שבו תאים הושעו ב 40 mL של מדיית התרבות.
   1. לטעון תאים לתוך שק העברה (ראה טבלת חומרים) באמצעות מזרק הרכבה מחט אם רתך צינור סטרילי זמין לחבר את שק העברת לערכת עיבוד השימוש היחיד.
   2. לחלופין, השתמש בזוג מספריים אוטוקלשים כדי לחתוך את הצינור המחבר עם בערך 10 ס מ שנשאר מחובר לשקית העברת ולהוסיף מחבר Luer נקבה לסוף אבובים. השתמש במזרק לניקוי תאים ומדיה, ולאחר מכן חבר את המזרק למחבר Luer וטען תאים לשקית ההעברה.
3. לחבר את התיק המכיל את התאים, לשטוף את התיק מאגר המכיל 500 mL של מאגר לשטוף הכין בשלב 1.1, שקית פסולת, ואיסוף מזרק אל הערכה לשימוש יחיד (איור 1B).
   הערה: המיקום המחבר של כל תיק תלוי בהגדרות בתוכנית. בפרוטוקול זה, חיברתי את שקית הפסולת בתנוחה א', שטוף מאגר במיקום B, שקית תא במיקום D ו-F, ומזרק לאוסף במיקום H (איור 1ג).

2. תוכנית לפרוטוקול חילופי מאגרים אוטומטיים

1. פתח את ממשק המשתמש הגרפי (GUI) של המכשיר ולחץ על כפתור "כוכבT" במחשב נייד או מחשב לוח. לאחר מכן "פתח" פרוטוקול קיים או לחץ על "חדש" כדי ליצור אחד חדש.
2. השתמש בלחצן "קדימה" ו-"לאחור" כדי לנווט בכל שלב, בחר את השסתומים שייפתחו/נסגרו, מהירות צנטריפוגליים, מהירות המשאבה, כיוון המשאבה וגורמי פעולה. ההגדרות עבור כל שלב מסוכמות בטבלה 1. . אז שמור את הפרוטוקול

3. התקנת המכונה

1. הציבו את ערכת העיבוד החד במחשב ותלו את השקיות המחוברות בהתאם. לחץ על כפתור "עצור/איפוס" האדום כדי לאפס את כל השסתומים לתוך המיקום הסגור המוגדר כברירת מחדל.
   הערה: המכונה תבצע מבחן כאשר הדלת סגורה כדי להבטיח את הקיט הוצב כראוי וכי כל השסתומים פועלים כראוי.
2. חבר את GUI למכשיר עיבוד ולחץ על "חיבור" כפתור. לאחר מכן הורד את התוכנית שנשמרה. כאשר הכפתור "Play" הירוק נדלק, הוא מצביע על כך שהפרוטוקול מוכן להתחיל.
3. פתח את התפסים ידנית עבור אבובים שק העברה.
   הערה: אם המפעיל שוכח לפתוח את התפסים, ההתקן יפסיק והאזהרה לחיישני הלחץ תופיע. לחץ על כפתור "לעצור" כדי לאפס את המכשיר ולפתוח את התפסים כדי להתחיל מחדש.

4. החלפת מאגר אוטומטית

1. לחץ על 'התחל' כדי ליזום את תוכנית חילופי המאגרים.
   הערה: כדי לשנות באופן ידני את התהליך האוטומטי, לחץ על כפתור "הבא" כדי לעבור לשלב הבא לפני שהגיע "ההדק" או לחץ על "השהה" כדי לשים את התהליך בהמתנה. פעולה זו תאחד את התאים באמצעות הערכה תוך שמירה על שסתומים בלבד J ו-K פתוח (איור 1ג).
2. בסוף שלב אוטומציה 6 (טבלה 1), התהליך יהיה להשהות כאשר האוויר בשקית רוקנה עכשיו מפעיל את חיישן הבועה. לחץ על "הבא" כדי להעביר את התהליך לשלב הבא אם התיק הוא אכן ריק, או ללחוץ על "השהה" כדי לחדש את העיבוד אם החיישן הופעל על ידי בועה בשורה.

5. איסוף ודיגום התאים

1. כאשר התהליך האוטומטי הוא סיים, לסגור את כל התפסים אבובים. פתח את הדלת ולקח את הערכה לשימוש יחיד מתוך המכשיר. נתק את המזרק כדי לאסוף את התאים לתהליכים הבאים. קח דגימה של התאים שנאספו עבור ספירת תאים ובדיקת הכדאיות (ראה שלב 6.2).

6. אימות תהליך

1. בצע ניסויים בבקרת באמצעות פרוטוקול חילופי מאגרים ידני.
   1. תא צנטריפוגה מושעה ב 200 x g עבור 5 דקות. לבטל את supernatant ולהשעות את התאים עם 30 מ ל של מאגר שטיפת תאים. צנטריפוגה את ההשעיה התא שוב ב 200 x g עבור 5 דקות. למחוק את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש את התאים עם 10 מ ל של מאגר שטיפת תאים.
2. בצעו ספירת תאים באמצעות מחלת ההדרה הכחולה כדי להעריך את הכדאיות בתאים באמצעות מונה תאים אוטומטי.
3. בצע שיטת MTS כדי לכמת את התפשטות התא ב 2, 24, ו 48 h.
   הערה: השימוש ב-MTS בוצע על צלחת תרבות הרקמה 96 בהתאם להוראות היצרן. A 100 μl סדרת מחלקים של מדיית תרבות התא (המכיל 10,000 בתאים או 1,500) לבאר היו מצופים לאחר תהליך החלפת המאגר. בכל פעם, 20 μL של MTS מריאגנטים נוספו לתוך כל היטב מודבטים עבור 2 h ב 37 ° c. הספיגה הוערך ב 490 ננומטר באמצעות קורא לוחית.
4. לבצע מאמר פונקציונלי להשוות את ההשפעה של התהליך האוטומטי לעומת התהליך הידני על התאים והפונקציה MSC.
   1. התרבות בתאים ב96-צלחת בצפיפות של 1 x 10⁶ תאים/mL מגורה עם 50 Ng/ml פורבול 12-myristate 13-אצטט (pma) ו-1 μg/ml איקונמיצין (קוקטייל גירוי התא) ב-dmem: מדיה F12 המכיל 10% סרום בפרה עוברית (fbs) עבור 24 h. מודדת התאים ב 37 ° c עם 5% CO₂.
   2. מדידת הייצור interleukin-2 מן התרבות supernatant באמצעות מבוסס חרוז מבוססי אליסה (ראה טבלת חומרים) על פי הוראות היצרן.
   3. תרבות MSCs בצלחת 12 היטב בצפיפות של 10,000 תאים/cm² ב 1 מ ל של Dמאמ: מדיה F12 המכיל 10% fbs שיושלם עם אינטרפרון-γ 50 יחידות/mL עבור 48 h. לאסוף supernatant על היכולת ריכוז kynurenine למדוד האינאמין 2, 3-diחמצון (עידו) פעילות אנזים של MSCs כפי שתוארה בעבר²¹.

תוצאות

בפרוטוקול זה, השתמשנו בתאים של ג'ורקאט ובMSCs כדוגמאות מייצגות כדי להדגים את תהליך החלפת המאגר האוטומטי. במהלך התהליך, שיתפו התאים של ג'ורקאט ו-MSCs את אותם שלבי עיבוד עם הבדלים בכוח צנטריפוגלי ובמהירות המשאבה השולטים בקצב הזרימה (שולחן 1). איור 2 מראה תמונות הנציגה שנת?...

Discussion

פרוטוקול חילופי המאגרים האוטומטיים המתואר הוא פשוט וידידותי למשתמש. עם זאת, קיימים מספר צעדי מפתח בפרוטוקול זה הקריטיים ודורשים תשומת לב מיוחדת. בניסיון שלנו, בעת עיבוד תאים גדולים כגון MSCs (קוטר ממוצע 10 – 15 μm) כל הפעלה צריכה לכלול לפחות 1 x 10⁷ תאים כדי להשיג שחזור תאים אופטימלי (

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 ml Luer lock syringes	BD	302830
20% Human serum albumin (HSA)	CSL Behring	AUST R 46283
4-(Dimethylamino)benzaldehyde	Sigma-Aldrich	156477-25g
500ml IV saline bag	Fresenius Kabi	K690521
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240112
Automated cell counter (Countess)	Thermo Fisher Scientific	N/A
Cell counting chamber slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Cell stimulation cocktail (500x)	Thermo Fisher Scientific	00-4970-93
Cell transfer bags	Terumo	T1BBT060CBB
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G3582
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM: F12 media	Thermo Fisher Scientific	11320082
EnVision plate Reader	Perkin Elmer	N/A
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10099141
Human Interleukin 2 (IL2) Kit	Perkin Elmer	Al221C
Luer (female) fittings	CPC	LF41
PC laptop or PC tablet device	ASUS	N/A
Plate reader (SpectraMax i3)	Molecular Device	N/A
Recombinant Human IFN-γ	PeproTech	300-02
Rotea counterflow centrifuge cell processing device	Scinogy	N/A
Rotea single-use processing kit	Scinogy	N/A
RPMI media	Thermo Fisher Scientific	11875119
Surgical scissors	ProSciTech	420SS
Trichloroacetic acide	Sigma-Aldrich	T6399-250g
Trypan Blue stain	Thermo Fisher Scientific	T10282
Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme)	Thermo Fisher Scientific	12604013