Sistema automatizzato di centrifuga controflusso per l'elaborazione di celle su piccola scala

Riepilogo

L'automazione è fondamentale per la scalabilità e la gestione dei costi nella produzione di celle. Questo manoscritto descrive l'uso di un dispositivo di elaborazione cellulare centrifuga controil flusso per automatizzare lo scambio di buffer e le fasi di concentrazione cellulare per il bioprocesso su piccola scala.

Abstract

Una commercializzazione efficace delle terapie geniche e basate sulle cellule richiede processi di produzione convenienti e scalabili. Lo scambio di buffer e la concentrazione dei prodotti sono componenti essenziali per la maggior parte dei processi di produzione. Tuttavia, nelle prime fasi dello sviluppo del prodotto, questi passaggi vengono spesso eseguiti manualmente. La centrifugazione manuale senza uscita senza uscita per lo scambio di buffer è laboriosa, costosa e non scalabile. Un sistema automatizzato chiuso può eliminare efficacemente questo laborioso passo, ma l'implementazione può essere difficile. Qui, descriviamo un dispositivo di elaborazione cellulare di recente sviluppo che è adatto per l'elaborazione di celle su piccola e media scala e mira a colmare il divario tra l'elaborazione manuale e l'automazione su larga scala. Questo protocollo può essere facilmente applicato a vari tipi di cellule e processi modificando la portata e la velocità di centrifugazione. Il nostro protocollo ha dimostrato un elevato recupero cellulare con tempi di elaborazione più brevi rispetto al processo manuale. Anche le cellule recuperate dal processo automatizzato hanno mantenuto i loro tassi di proliferazione. Il dispositivo può essere applicato come componente modulare in un processo di produzione chiuso per adattarsi a passaggi come lo scambio di buffer, la formulazione delle cellule e la crioconservazione.

Introduzione

Il panorama della medicina moderna si è rapidamente trasformato attraverso recenti sviluppi nelle terapie geniche e basate sulle cellule (GCT). Essendo uno dei settori in più rapida crescita nella ricerca traslazionale, anche il settore GCT si trova ad affrontare sfide uniche e senza precedenti. Oltre ai solidi risultati clinici, processi di produzione efficienti ed efficienti in termini di costi sono essenziali per il successo commerciale della GCT, che è particolarmente difficile da ottenere nella produzione su piccola scala¹. Il costo del tempo, del lavoro e delle garanzie di qualità sono amplificati quando ogni lotto di cellule produce solo poche dosi per un paziente invece di centinaia o migliaia. A differenza delle terapie alle cellule allogeniche in cui i processi di produzione sono più simili alla produzione di anticorpi e proteine ricombinanti, le terapie cellulari autologhe sono tipicamente prodotte come operazioni su piccola scala¹. Come fenomeno relativamente nuovo nella produzione biofarmaceutica², le opzioni per l'elaborazione cellulare su piccola scala sono attualmente piuttosto limitate.

Lo scambio di buffer è essenziale per la produzione di cellule. È uno dei processi a valle in cui le cellule vengono rimosse dai mezzi di coltura e concentrate per la crioconservazione o l'infusione. Attualmente, la produzione di cellule su piccola scala spesso applica processi simili a quelli dell'ambito di ricerca accademica e si basa su camere pulite specializzate per mantenere la sterilità³. I processi manuali a valle spesso utilizzano centrifughe da banco per pellet e resospendere le celle per la riduzione del volume e lo scambio di buffer. Questi processi aperti sono costosi (ad esempio, manodopera e manutenzione delle camere pulite) e hanno una capacità di produzione limitata, che non sono ideali per la produzione commerciale^2,3.

L'implementazione dell'automazione è stata proposta come soluzione per migliorare l'efficienza produttiva e realizzare produzioni su scala commerciale². La sterilità non può essere raggiunta nei prodotti a base di cellule attraverso metodi tradizionali utilizzati per i biologici, come l'irradiazione gamma o la filtrazione terminale. Viene invece implementato un sistema chiuso automatizzato per ridurre i rischi di contaminazione e gli operatori si affidano a camere pulite per mantenere la sterilità⁴. L'automazione dei processi risolve anche il problema della scalabilità con più sistemi in esecuzione in parallelo (scalabilità orizzontale) o aumentando la capacità di elaborazione di un singolo dispositivo (scalabilità verticale), che a sua volta riduce al minimo la variabilità tra gli operatori. Inoltre, l'analisi di modellazione dei costi delle terapie autologhe suggerisce che l'automazione può ridurre il costo della produzione^5,6. Tuttavia, nessun vantaggio in termini di costi è stato riscontrato in uno studio clinico sulle cellule staminali autologhe in cui è stata utilizzata una piattaforma di produzione automatizzata⁷, suggerendo che il vantaggio in termini di costi dell'automazione può dipendere dal singolo processo di produzione.

Esistono diverse strategie in cui l'automazione può essere introdotta in un processo di produzione esistente. Ciò può essere ottenuto implementando una piattaforma completamente integrata o una catena di elaborazione modulare. Ci sono diverse piattaforme completamente integrate disponibili in commercio per la produzione di cellule autologhe, come CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech) e Quantum (Terumo BCT). Queste piattaforme integrate, che sono spesso descritte come "GMP-in-a-box", hanno basse esigenze di infrastruttura e sono facili da usare. Tuttavia, la capacità di produzione di un setup completamente integrato può essere limitata dall'incubatore collegato al sistema. Ad esempio, la capacità di coltura di Prodigy è limitata alla sua camera⁸ da 400 mL e la cartuccia Quantum ha una superficie limitante impostata su 2,1 m² (equivalente a 120 flaconi T175)⁷, che potrebbe non essere sufficiente per i pazienti che richiedono dosi cellulari più elevate^9,10. Inoltre, Prodigy e Quantum hanno un attributo comune che ne limita l'uso: l'unità operativa è occupata da un singolo lotto di celle durante il periodo di espansione delle celle, limitando così il numero di lotti che possono essere prodotti da ogni unit๹. L'approccio modulare all'automazione è quello di creare una catena di produzione con più unità modulari che simula il processo di produzione commerciale^12,13. Questo approccio, che separa il dispositivo di coltura dal dispositivo di lavaggio cellulare, può quindi massimizzare l'efficienza di produzione. Un dispositivo di lavorazione ideale sarebbe uno che è adattabile e scalabile alle esigenze di produzione¹².

La tecnologia della centrifugazione antistante (CFC), che risale agli anni '70, ha avuto una lunga storia nell'elaborazione cellulare¹⁴. Raggiunge la concentrazione e la separazione delle cellule bilanciando la forza centrifuga con una forza di controflusso. In genere, una sospensione cellulare entra dall'estremità stretta di una camera cellulare sotto una portata costante mentre è soggetta a una forza centrifuga (Figura 1A). Il flusso del fluido viene esercitato nella direzione opposta alla forza centrifuga. Questa è indicata come forza di controflusso, che forma un gradiente all'interno della camera cellulare. La forza di controflusso diminuisce man mano che la camera cellulare si allarga dalla punta della camera cellulare a forma di cono. Le cellule con una maggiore densità e un diametro maggiore hanno un tasso di sedimentazione più elevato, e quindi raggiungono l'equilibrio della forza verso la punta della camera cellulare a forma di cono. Le particelle più piccole possono raggiungere l'equilibrio verso la base della camera o essere troppo piccole per essere mantenute nella camera e saranno lavate via. La tecnologia CFC è principalmente conosciuta per la sua applicazione nella lavorazione di prodotti di aferesi del sangue, come l'isolamento di monociti per terapie cellulari dendritiche^15,16. In termini di scambio di buffer, la tecnologia CFC è stata applicata solo nella produzione su larga scala¹⁷ e deve ancora essere utilizzata per la produzione su scala più piccola di terapie cellulari autologhe.

Per rispondere alla necessità di un dispositivo adatto per la produzione di celle su piccola scala, è stato recentemente sviluppato¹⁸un dispositivo CFC automatizzato (vedere Tabella dei materiali). Il dispositivo di elaborazione cellulare automatizzato utilizza la tecnologia di centrifugazione del controflusso per rimuovere i detriti cellulari e facilitare lo scambio di buffer. Il dispositivo esegue lo scambio di buffer con un kit monouso che può essere sterile a un sacchetto di trasferimento cellulare, che consente alle cellule di essere elaborate all'interno di un sistema sterile e chiuso. In questo caso, esaminiamo l'uso di un dispositivo centrifugo a controflusso per eseguire lo scambio di buffer nelle colture cellulari dei mammiferi in protocolli automatizzati. In questo studio, abbiamo testato il protocollo di scambio tampone utilizzando cellule Jurkat e cellule stromali mesenchymale (MSC) per modellare i tipi di cellule non aderenti e aderenti, rispettivamente. Le cellule giurate sono cellule T immortalate spesso utilizzate per lo studio della leucemia acuta delle cellule T^19,20. Le MSC sono cellule staminali adulte che sono state studiate negli studi clinici umani per una vasta gamma di malattie⁹.

Protocollo

1. Preparazione di reagenti e celle per lo scambio di buffer

1. Preparare i buffer (vedere Tabella dei materiali) in una cappa di flusso laminare di classe 2. Utilizzando un assemblaggio di siringhe e aghi, rimuovere 50 mL di soluzione salina da un sacchetto salina da 500 mL. Sostituirlo con 50 mL di 20% di albumina di siero umano (HSA) per fare 2% HSA in salina, che servirà come buffer di lavaggio.
2. Rimuovere le cellule dai vasi di coltura ed eseguire un conteggio delle cellule per determinare la quantità di celle iniziale e la vitalità dall'esclusione blu trypan. Caricare le celle in un sacchetto di trasferimento.
   NOTA: in questo protocollo le celle Jurkat sono state coltivate in RPMI e le MSC sono state coltivate in DMEM:F12. Entrambi i media sono stati integrati con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% soluzione antibiotico-antimicotico. Le cellule sono state coltivate a 37 gradi centigradi con il 5% di CO₂. Per le MSC o le cellule aderenti, aggiungere un enzima di digestione (ad esempio, trypsin) nei vasi di coltura al fine di staccare le cellule e dissetare con i mezzi di coltura una volta che le cellule sono staccate. Un sacchetto di trasferimento è stato utilizzato in questo protocollo perché le cellule sono state ampliate in vasi di coltura. Tuttavia, se le cellule sono coltivate in un sacchetto di coltura cellulare, può essere collegato direttamente al kit monouso tramite la saldatura sterile del tubo. In questo protocollo, sono state utilizzate 3 x 10⁷ celle Jurkat o 1 x 10⁷ MSC per ogni esecuzione, dove le celle sono state sospese in 40 mL di supporti di coltura.
   1. Caricare le celle in un sacchetto di trasferimento (vedere Tabella dei materiali)utilizzando una siringa e l'assemblaggio dell'ago se è disponibile un saldatore sterile per collegare il sacchetto di trasferimento al kit di lavorazione monouso.
   2. In alternativa, utilizzare un paio di forbici autoclaved per tagliare il tubo di collegamento con circa 10 cm di permanente attaccato al sacchetto di trasferimento e aggiungere un connettore Luer femminile all'estremità del tubo. Utilizzare una siringa per aspirare le celle e supporti, quindi collegare la siringa al connettore Luer e caricare le celle al sacchetto di trasferimento.
3. Collegare il sacchetto contenente le celle, lavare il sacchetto tampone contenente 500 mL di tampone di lavaggio preparato nel passaggio 1.1, sacchetto dei rifiuti e raccolta della siringa al kit monouso (Figura 1B).
   NOTA: la posizione di collegamento di ogni borsa dipende dalle impostazioni del programma. In questo protocollo, abbiamo collegato il sacchetto dei rifiuti nella posizione A, lavare il tampone alla posizione B, il sacchetto cellulare nelle posizioni D e F e la siringa di raccolta alla posizione H (Figura 1C).

2. Programma per il protocollo di scambio automatico del buffer

1. Aprire l'interfaccia utente grafica (GUI) del dispositivo e premere il pulsante "START" su un PC o tablet portatile. Poi "Apri" un protocollo esistente o premi "Nuovo" per crearne uno nuovo.
2. Utilizzare il pulsante "Avanti" e "Indietro" per navigare attraverso ogni passo, selezionare le valvole da aprire/chiudere, velocità centrifuga, velocità della pompa, direzione della pompa e trigger di azione. Le impostazioni per ogni passaggio sono riepilogate nella Tabella 1. Quindi salvare il protocollo.

3. Configurazione della macchina

1. Posizionare il kit di lavorazione monouso sulla macchina e appendere di conseguenza i sacchetti collegati. Premere il pulsante rosso "Stop/Reset" per ripristinare tutte le valvole nella posizione chiusa di default.
   NOTA: La macchina eseguirà un test quando la porta è chiusa per garantire che il kit sia stato posizionato correttamente e che tutte le valvole funzionino in modo appropriato.
2. Collegare la GUI al dispositivo di elaborazione e premere il pulsante "Connetti". Quindi scaricare il programma salvato. Quando il pulsante verde "Riproduci" si illumina, indica che il protocollo è pronto per l'avvio.
3. Aprire i morsetti manuali per il tubo del sacchetto di trasferimento.
   NOTA: Se l'operatore dimentica di aprire i morsetti, il dispositivo si fermerà e apparirà l'avviso del sensore di pressione. Premere il pulsante "Stop" per reimpostare il dispositivo e aprire i morsetti per ricominciare.

4. Scambio automatico di buffer

1. Premere "Start" per avviare il programma di scambio di buffer.
   NOTA: per modificare manualmente il processo automatizzato, premere il pulsante "Avanti" per passare al passaggio successivo prima di raggiungere il "Trigger" o premere "Pausa" per mettere il processo in attesa. Questo ricircolerà le cellule attraverso il kit mantenendo aperte solo le valvole J e K(Figura 1C).
2. Al termine dell'automazione passo 6(Tabella 1), il processo si fermerà quando l'aria nel sacchetto ora svuotato attiva il sensore a bolle. Premere "Avanti" per spostare il processo al passaggio successivo se il sacchetto è effettivamente vuoto, o premere "Pausa" per riprendere l'elaborazione se il sensore è stato attivato da una bolla nella linea.

5. Raccolta e campionamento delle cellule

1. Quando il processo automatizzato è finito, chiudere tutti i morsetti tubo. Aprire lo sportello e togliere il kit monouso dal dispositivo. Scollegare la siringa per raccogliere le cellule per i processi successivi. Prendere un campione delle cellule raccolte per un conteggio delle cellule e un controllo di fattibilità (vedere il passaggio 6.2).

6. Convalida del processo

1. Eseguire esperimenti di controllo utilizzando un protocollo di scambio manuale del buffer.
   1. Centrifuga sospensione cellulare a 200 x g per 5 min. Scartare il supernatante e rimettere in sospensione le cellule con 30 mL di buffer di lavaggio cellulare. Centrifugare nuovamente la sospensione cellulare a 200 x g per 5 min. Scartare il supernatante e rimettere in sospensione le cellule con 10 mL di buffer di lavaggio cellulare.
2. Eseguire il conteggio delle celle tramite il test di esclusione blu trypan per valutare la vitalità delle cellule utilizzando un contatore cellulare automatizzato.
3. Eseguire un saggio MTS per quantificare la proliferazione cellulare a 2, 24 e 48 h.
   NOTA: Il saggio MTS è stato eseguito su una piastra di coltura dei tessuti da 96 pozzi secondo le istruzioni del produttore. Un'aliquota di 100 - Laliquot di coltura cellulare (contenente 10.000 celle Jurkat o 1.500) per pozzo sono stati placcati dopo il processo di scambio del buffer. Ad ogni momento, 20 l di reagenti MTS sono stati aggiunti in ogni pozzo e incubati per 2 h a 37 gradi centigradi. L'assorbimento è stato valutato a 490 nm utilizzando un lettore di lastre.
4. Esegui analisi funzionali per confrontare l'impatto del processo automatizzato rispetto al processo manuale sulle celle Jurkat e sulla funzione MSC.
   1. Coltura cellule Jurkat in una piastra di 96 pozze ad una densità di 1 x 10⁶ cellule /mL stimolate con 50 ng/mL phorbol 12-myristate 13 acetati (PMA) e 1 g/mL ionomycin (cocktail di stimolazione cellulare) in supporti DMEM:F12 contenenti 10% siero bovino fetale (FBS) per 24 h. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO₂.
   2. Misurare la produzione di interleuquiin-2 da coltura supernatant utilizzando il saggio ELISA basato su perline (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
   3. Colture MSC in una piastra di 12 pozzi alla densità di 10.000 cellule/cm² in 1 mL di supporti DMEM:F12 contenenti 10% FBS integrati con l'interferone-z 50 unità/mL per 48 h. Raccogliere il solatto per il saggio di concentrazione di chinonuro per misurare l'indoleamina 2,3-diossigenasi (IDO) attività enzimatica delle MSS come descritto in precedenza²¹.

Risultati

In questo protocollo, abbiamo usato le celle Jurkat e MSC come esempi rappresentativi per dimostrare il processo di scambio automatico del buffer. Durante il processo, le cellule Jurkat e le MSC condividevano le stesse fasi di lavorazione con differenze di forza centrifuga e velocità di pompaggio che controllano la portata (Tabella 1). La figura 2 mostra le immagini rappresentative catturate dalla fotocamera di come può apparire il letto cellulare fluido durante il process...

Discussione

Il protocollo di scambio automatico del buffer descritto è semplice e facile da usare. Tuttavia, ci sono alcuni passaggi chiave in questo protocollo che sono critici e richiedono particolare attenzione. Nella nostra esperienza, durante l'elaborazione di celle più grandi come MSC (diametro medio 10-15 m) ogni esecuzione dovrebbe includere almeno 1 x 10⁷ celle per ottenere un recupero ottimale delle cellule (Figura 4B). L'elaborazione di celle più piccole, come l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 ml Luer lock syringes	BD	302830
20% Human serum albumin (HSA)	CSL Behring	AUST R 46283
4-(Dimethylamino)benzaldehyde	Sigma-Aldrich	156477-25g
500ml IV saline bag	Fresenius Kabi	K690521
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240112
Automated cell counter (Countess)	Thermo Fisher Scientific	N/A
Cell counting chamber slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Cell stimulation cocktail (500x)	Thermo Fisher Scientific	00-4970-93
Cell transfer bags	Terumo	T1BBT060CBB
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G3582
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM: F12 media	Thermo Fisher Scientific	11320082
EnVision plate Reader	Perkin Elmer	N/A
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10099141
Human Interleukin 2 (IL2) Kit	Perkin Elmer	Al221C
Luer (female) fittings	CPC	LF41
PC laptop or PC tablet device	ASUS	N/A
Plate reader (SpectraMax i3)	Molecular Device	N/A
Recombinant Human IFN-γ	PeproTech	300-02
Rotea counterflow centrifuge cell processing device	Scinogy	N/A
Rotea single-use processing kit	Scinogy	N/A
RPMI media	Thermo Fisher Scientific	11875119
Surgical scissors	ProSciTech	420SS
Trichloroacetic acide	Sigma-Aldrich	T6399-250g
Trypan Blue stain	Thermo Fisher Scientific	T10282
Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme)	Thermo Fisher Scientific	12604013