Sistema centrífuga de contrafluxo automatizado para processamento de células em pequena escala

Resumo

A automação é fundamental para aumentar o dimensionamento e o gerenciamento de custos na fabricação de células. Este manuscrito descreve o uso de um dispositivo de processamento de células centrífugas de contrafluxo para automatizar as etapas de troca de buffer e concentração de células para o bioprocessamento em pequena escala.

Resumo

A comercialização bem-sucedida de terapias gênicas e celulares requer processos de fabricação que sejam econômicos e escaláveis. A troca de buffers e a concentração de produtos são componentes essenciais para a maioria dos processos de fabricação. No entanto, nos estágios iniciais do desenvolvimento do produto, essas etapas são muitas vezes executadas manualmente. A centrífuga manual sem saída para a troca de buffers é trabalhosa, cara e não escalável. Um sistema automatizado fechado pode efetivamente eliminar essa etapa trabalhosa, mas a implementação pode ser desafiadora. Aqui, descrevemos um dispositivo de processamento de células recém-desenvolvido que é adequado para processamento de células de pequena a média escala e visa preencher a lacuna entre processamento manual e automação em larga escala. Este protocolo pode ser facilmente aplicado a vários tipos e processos celulares, modificando a taxa de fluxo e a velocidade de centrífuga. Nosso protocolo demonstrou a recuperação elevada da pilha com uns tempos de processamento mais curtos em comparação ao processo manual. As células recuperadas do processo automatizado também mantiveram suas taxas de proliferação. O dispositivo pode ser aplicado como um componente modular em um processo de fabricação fechado para acomodar etapas tais como a troca do amortecedor, a formulação da pilha, e a criopreservação.

Introdução

A paisagem da medicina moderna transformou-se rapidamente através de desenvolvimentos recentes em terapias genéticas e celulares (GCT). Como um dos campos que mais cresce na pesquisa translacional, o setor gct também enfrenta desafios únicos e sem precedentes. Além de resultados clínicos robustos, processos de fabricação eficientes e econômicos são essenciais para o sucesso comercial da GCT, que é particularmente difícil de alcançar na fabricação de pequena escala^1. O custo do tempo, do trabalho e das garantias de qualidade são ampliados quando cada lote de células produz apenas algumas doses para um paciente em vez de centenas ou milhares. Ao contrário das terapias de células alogênicas em que os processos de fabricação são mais semelhantes à produção de anticorpos e proteínas recombinantes, as terapias de células autólogas são tipicamente produzidas como operações de pequena escala^1. Como um fenômeno relativamente novo na fabricação biofarmacêutica^2,as opções para o processamento de células de pequena escala são atualmente bastante limitadas.

A troca de buffers é essencial para a fabricação de células. É um dos processos a jusante onde as células são removidas da mídia cultural e concentradas para criopreservação ou infusão. Atualmente, a fabricação de células de pequena escala muitas vezes aplica processos semelhantes aos do ambiente de pesquisa acadêmica e depende de salas limpas especializadas para manter a esterilidade³. Processos manuais a jusante costumam usar centrífugas bancadas para pelotas e resuspender as células para redução de volume e troca de buffer. Estes processos abertos são caros (ou seja, trabalho e manutenção de quartos limpos) e têm capacidade de fabricação limitada, que não são ideais para a produção comercial^2,3.

A implementação da automação tem sido proposta como uma solução para melhorar a eficiência de fabricação e alcançar produções em escala comercial^2. A esterilidade não pode ser alcançada em produtos à base de células através de métodos tradicionais utilizados para produtos biológicos, como irradiação gama ou filtragem terminal. Em vez disso, um sistema fechado automatizado é implantado para reduzir os riscos de contaminação e os operadores que dependem de salas limpas para manter a esterilidade⁴. A automação de processos também aborda a questão da escalabilidade por ter vários sistemas funcionando em paralelo (escala) ou aumentando a capacidade de processamento de um dispositivo individual (escala-up), o que, por sua vez, minimiza a variabilidade entre os operadores. Além disso, a análise de modelagem de custos de terapias autólogas sugere que a automação pode reduzir o custo de fabricação^5,6. No entanto, nenhum benefício de custo foi encontrado em um ensaio clínico de células-tronco autólogas, onde uma plataforma de fabricação automatizada foi usada^7,sugerindo que o benefício de custo da automação pode depender do processo de fabricação individual.

Existem diferentes estratégias nas quais a automação pode ser introduzida em um processo de fabricação existente. Isso pode ser alcançado através da implementação de uma plataforma totalmente integrada ou de uma cadeia de processamento modular. Existem várias plataformas totalmente integradas comercialmente disponíveis para fabricação de células autólogas, como CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech) e Quantum (Terumo BCT). Essas plataformas integradas, que muitas vezes são descritas como "GMP-in-a-box", têm baixas demandas em infraestrutura e são fáceis de operar. No entanto, a capacidade de fabricação de uma configuração totalmente integrada pode ser restringida pela incubadora anexada ao sistema. Por exemplo, a capacidade de cultivo do Prodigy é limitada à sua câmara⁸ de 400 mL e o cartucho Quantum tem uma área de superfície limitante definida para 2,1 m² (equivalente a 120 frascos T175)⁷, o que pode não ser suficiente para pacientes que necessitam de doses celulares mais altas^9,10. Além disso, A Prodigy e a Quantum têm um atributo comum que limita seu uso: a unidade operacional é ocupada por um único lote de células durante todo o período de expansão celular, limitando assim o número de lotes que podem ser fabricados por cada unidade¹¹. A abordagem modular para a automação é criar uma cadeia de fabricação com várias unidades modulares que simula o processo de fabricação comercial^12,13. Esta aproximação, que separa o dispositivo da cultura do dispositivo de lavagem da pilha, pode desse modo maximizar a eficiência de fabricação. Um dispositivo de processamento ideal seria aquele que é adaptável e escalável às necessidades de fabricação^12.

A tecnologia de centrífuga de contrafluxo (CFC), que remonta à década de 1970, teve uma longa história no processamento de células^14. Ele atinge a concentração celular e separação, equilibrando a força centrífuga com uma força de contrafluxo. Normalmente, uma suspensão celular entra a partir da extremidade estreita de uma câmara celular uma taxa de fluxo constante, enquanto submetido a uma força centrífuga(Figura 1A). O fluxo do fluido é exercido na direção oposta à força centrífuga. Isto é referido como a força de contrafluxo, que forma um gradiente dentro da câmara celular. A força de contrafluxo diminui então à medida que a câmara celular se alarga para longe da ponta da câmara celular em forma de cone. Células com maior densidade e maior diâmetro têm uma maior taxa de sedimentação e, portanto, atingem o equilíbrio de força em direção à ponta da câmara celular em forma de cone. Partículas menores podem alcançar equilíbrio em direção à base da câmara ou ser pequenas demais para serem mantidas na câmara e serão lavadas. A tecnologia CFC é mais conhecida por sua aplicação no processamento de produtos de apherese sanguínea, como isolar monócitos para terapias de células dendríticas^15,16. Em termos de troca de buffer, a tecnologia CFC só foi aplicada na fabricação em larga escala¹⁷ e ainda não foi usada para a fabricação de menor escala de terapias de células autólogas.

Para atender à necessidade de um dispositivo adequado para fabricação de células de pequena escala, um dispositivo CFC automatizado (Ver Tabela de Materiais),foi recentemente desenvolvido¹⁸. O dispositivo automatizado de processamento de células usa tecnologia de centrífuga de contrafluxo para remover detritos celulares e facilitar a troca de buffers. O dispositivo executa a troca do amortecedor com um jogo single-use que possa ser estéril-conectado a um saco de transferência da pilha, que permita que as pilhas sejam processadas dentro de um sistema estéril, incluido. Aqui, investigamos o uso de um dispositivo centrífuga de contrafluxo para realizar a troca de buffers em culturas celulares de mamíferos em protocolos automatizados. Neste estudo, testamos o protocolo de troca de buffer usando células Jurkat e células estromais mesenchymal (MSCs) para modelar tipos de células não aderentes e aderentes, respectivamente. As células Jurkat são células T imortalizadas frequentemente usadas para o estudo da leucemia aguda de células T^19,20. Os MSCs são células-tronco adultas que têm sido estudadas em ensaios clínicos em humanos para uma ampla gama de doenças^9.

Protocolo

1. Preparação de reagentes e células para troca de buffer

1. Prepare amortecedores (ver Tabela de Materiais)em uma capa de fluxo laminar classe 2. Usando uma seringa e montagem de agulhas, retire 50 mL de solução saline de um saco shinhol de 500 mL. Substitua isso por 50 mL de 20% albumina soro humano (HSA) para fazer 2% HSA em soro fisiológico, que servirá como o tampão de lavagem.
2. Retire as células dos vasos de cultura e realizar uma contagem celular para determinar a quantidade de células iniciais e viabilidade por exclusão trypan azul. Carregue as células em um saco de transferência.
   NOTA: Neste protocolo as células Jurkat foram cultivadas em RPMI e MSCs foram cultivadas em DMEM:F12. Ambos os meios foram suplementados com soro bovino fetal de 10% (FBS) e solução antibiótico-antimicotic de 1%. As células foram cultivadas a 37 °C com 5% de CO_2. Para MSCs ou células aderentes, adicione uma enzima de digestão (por exemplo, trippsina) nos vasos de cultura, a fim de separar as células, e saciar com a mídia cultural uma vez que as células são destacadas. Um saco de transferência foi usado neste protocolo porque as pilhas foram expandidas em embarcações da cultura. No entanto, se as células são cultivadas em um saco de cultura celular, ele pode ser diretamente conectado ao kit de uso único através de soldagem tubo estéril. Neste protocolo, foram utilizadas células 3 x 10⁷ Jurkat ou 1 x 10⁷ MSCs para cada corrida, onde as células foram suspensas em 40 mL de meios de comunicação culturais.
   1. Carregue as células em um saco de transferência (ver Mesa de Materiais)usando uma seringa e montagem de agulhas se um soldador de tubo estéril estiver disponível para conectar o saco de transferência ao kit de processamento de uso único.
   2. Alternativamente, use um par de tesouras autoclaved para cortar o tubo de conexão com ao redor 10 cm restantes unido ao saco de transferência e adicione um conector fêmea de Luer à extremidade da tubulação. Use uma seringa para aspirar células e mídia, em seguida, conectar a seringa para o conector Luer e células de carga para o saco de transferência.
3. Conecte o saco contendo as células, lave saco tampão contendo 500 mL de tampão de lavagem preparado na etapa 1.1, saco de resíduos e coleta de seringa para o kit de uso único(Figura 1B).
   NOTA: A posição de conexão de cada saco depende das configurações do programa. Neste protocolo, conectamos o saco de resíduos na posição A, lavar tampão na posição B, saco de celular nas posições D e F, e seringa de coleta na posição H (Figura 1C).

2. Programa para protocolo automatizado de troca de buffer

1. Abra a interface gráfica do usuário (GUI) do dispositivo e pressione o botão"START"em um PC ou tablet de laptop. Então "Abra" um protocolo existente ou pressione "Novo" para criar um novo.
2. Use o botão"Forward"e"Backward"para navegar por cada etapa, selecione as válvulas para serem abertas/fechadas, velocidade centrífuga, velocidade da bomba, direção da bomba e gatilhos de ação. As configurações para cada etapa são resumidas na Tabela 1. Em seguida, salvar o protocolo.

3. Configuração da máquina

1. Coloque o kit de processamento de uso único na máquina e pendure os sacos conectados em conformidade. Pressione o botão vermelho"Stop/Reset"para redefinir todas as válvulas na posição fechada padrão.
   NOTA: A máquina realizará um teste quando a porta estiver fechada para garantir que o kit tenha sido colocado corretamente e que todas as válvulas estejam funcionando adequadamente.
2. Conecte o GUI ao dispositivo de processamento e pressione o botão"Connect". Em seguida, baixe o programa salvo. Quando o botão verde"Play"se ilumina, isso indica que o protocolo está pronto para começar.
3. Abra os grampos manuais para a tubulação do saco de transferência.
   NOTA: Se o operador se esquece de abrir os grampos, o dispositivo vai parar e o aviso do sensor de pressão aparecerá. Pressione o botão"Pare"para redefinir o dispositivo e abra os grampos para começar de novo.

4. Troca de buffer automatizada

1. Press "Comece" a iniciar o programa de troca de buffer.
   NOTA: Para alterar manualmente o processo automatizado, pressione o botão"Next"para passar para o próximo passo antes de chegar ao "Trigger" oupressione" Pausa " para colocar o processo em espera. Isso vai recircular as células através do kit, mantendo apenas válvulas J e K aberto (Figura 1C).
2. No final da automação passo 6(Tabela 1), o processo vai parar quando o ar no saco agora esvaziado desencadeia o sensor de bolha. Press "Next" para mover o processo para o próximo passo, se o saco está de fato vazio, oupressione" Pausa " para retomar o processamento, se o sensor foi acionado por uma bolha na linha.

5. Coletae e amostragem das células

1. Quando o processo automatizado estiver concluído, feche todos os grampos de tubos. Abra a porta e tire o kit de uso único do dispositivo. Desligue a seringa para coletar as células para processos subsequentes. Tome uma amostra das células coletadas para uma contagem celular e verificação de viabilidade (ver passo 6.2).

6. Validação do processo

1. Realize experimentos de controle usando um protocolo manual de troca de buffer.
   1. Suspensão celular centrífuga a 200 x g por 5 min. Descarte o supernatant e resuspenda as células com 30 mL de tampão de lavagem celular. Centrífuga a suspensão celular novamente a 200 x g por 5 min. Descarte o supernatant e resuspender as células com 10 mL de tampão de lavagem celular.
2. Realizar a contagem celular através do ensaio de exclusão azul trypan para avaliar a viabilidade celular usando um contador de células automatizado.
3. Realize um ensaio mts para quantificar a proliferação celular às 2, 24 e 48 h.
   NOTA: O ensaio MTS foi realizado em uma placa de cultura de tecido de 96 poços de acordo com as instruções do fabricante. Um alibamento de 100 μL de meios da cultura da pilha (que contêm 10.000 pilhas de Jurkat ou 1.500) por o poço foi chapeado após o processo da troca do amortecedor. A cada ponto de tempo, 20 μL de reagentes MTS foram adicionados em cada poço e incubados por 2 h a 37 °C. A absorção foi avaliada em 490 nm usando um leitor de placa.
4. Realize ensaios funcionais para comparar o impacto do processo automatizado versus o processo manual nas células Jurkat e na função MSC.
   1. Células Culture Jurkat em uma placa de 96 poços a uma densidade de 1 x 10⁶ células/mL estimuladas com 50 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) e 1 μg/mL ionomicina (coquetel de estimulação celular) na mídia DMEM:F12 contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) por 24 h. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂.
   2. Medir a produção de interleucina-2 a partir de cultura supernatant usando bead-based ensaio ELISA (ver Tabela de Materiais)de acordo com as instruções do fabricante.
   3. MSCs cultura em uma placa de 12 poços na densidade de 10.000 células / cm² em 1 mL de DMEM: F12 mídia contendo 10% FBS complementada com interferon-γ 50 unidades/mL para 48 h. Coletar supernatant para o ensaio de concentração de kynurenine para medir a atividade enzimática de indoleamina 2,3 dioxygenase (IDO) de MSCs como descrito anteriormente²¹.

Resultados

Neste protocolo, usamos células Jurkat e MSCs como exemplos representativos para demonstrar o processo automatizado de troca de buffers. Durante o processo, as células Jurkat e os MSCs compartilharam as mesmas etapas de processamento com diferenças na força centrífuga e na velocidade da bomba que controlam a taxa de fluxo(Tabela 1). A Figura 2 mostra imagens representativas capturadas pela câmera de como o leito celular fluido pode aparecer durante o processo de troca ...

Discussão

O protocolo automatizado de troca de buffer descrito é simples e amigável. No entanto, existem alguns passos-chave neste protocolo que são críticos e exigem especial atenção. Em nossa experiência, ao processar células maiores, como MSCs (diâmetro médio de 10 a 15 μm), cada corrida deve incluir pelo menos 1 x 10⁷ células para alcançar a recuperação ideal de células(Figura 4B). O processamento de células menores, como as células Jurkat (média de ~...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 ml Luer lock syringes	BD	302830
20% Human serum albumin (HSA)	CSL Behring	AUST R 46283
4-(Dimethylamino)benzaldehyde	Sigma-Aldrich	156477-25g
500ml IV saline bag	Fresenius Kabi	K690521
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240112
Automated cell counter (Countess)	Thermo Fisher Scientific	N/A
Cell counting chamber slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Cell stimulation cocktail (500x)	Thermo Fisher Scientific	00-4970-93
Cell transfer bags	Terumo	T1BBT060CBB
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G3582
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM: F12 media	Thermo Fisher Scientific	11320082
EnVision plate Reader	Perkin Elmer	N/A
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10099141
Human Interleukin 2 (IL2) Kit	Perkin Elmer	Al221C
Luer (female) fittings	CPC	LF41
PC laptop or PC tablet device	ASUS	N/A
Plate reader (SpectraMax i3)	Molecular Device	N/A
Recombinant Human IFN-γ	PeproTech	300-02
Rotea counterflow centrifuge cell processing device	Scinogy	N/A
Rotea single-use processing kit	Scinogy	N/A
RPMI media	Thermo Fisher Scientific	11875119
Surgical scissors	ProSciTech	420SS
Trichloroacetic acide	Sigma-Aldrich	T6399-250g
Trypan Blue stain	Thermo Fisher Scientific	T10282
Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme)	Thermo Fisher Scientific	12604013