JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Автоматизация является ключом к наращиванию масштабов и управлению затратами в производстве ячеек. Данная рукопись описывает использование устройства обработки центробежных клеток против потока для автоматизации буферного обмена и шагов концентрации клеток для мелкомасштабной биообработки.

Аннотация

Успешная коммерциализация генной и клеточной терапии требует производственных процессов, которые являются экономически эффективными и масштабируемыми. Обмен буферами и концентрация продукта являются важными компонентами для большинства производственных процессов. Однако на ранних стадиях разработки продукта эти шаги часто выполняются вручную. Ручная тупиковая центробежка для буферного обмена является трудоемкой, дорогостоящей и не масштабируемой. Закрытая автоматизированная система может эффективно устранить этот трудоемкий шаг, но реализация может быть сложной задачей. Здесь мы описываем недавно разработанное устройство обработки ячеек, которое подходит для обработки ячеек малого и среднего масштаба и направлено на преодоление разрыва между ручной обработкой и крупномасштабной автоматизацией. Этот протокол может быть легко применен к различным типам и процессам клеток путем изменения скорости потока и скорости центрифугирования. Наш протокол продемонстрировал высокое восстановление клеток с более коротким временем обработки по сравнению с ручным процессом. Клетки, извлеченные из автоматизированного процесса, также поддерживали скорость распространения. Устройство может быть применено в качестве модульного компонента в закрытом производственном процессе для размещения таких этапов, как буферный обмен, формулировка ячейки и криоконсервация.

Введение

Ландшафт современной медицины быстро преобразился благодаря последним разработкам в области генной и клеточной терапии (GCT). Будучи одной из наиболее быстро растущих областей в области трансляционных исследований, сектор GCT также сталкивается с уникальными и беспрецедентными проблемами. В дополнение к надежным клиническим результатам, эффективные и экономически эффективные производственные процессы имеют важное значение для коммерческого успеха GCT, который особенно трудно достичь в мелкомасштабной обрабатывающей промышленности1. Стоимость времени, труда и гарантий качества увеличивается, когда каждая партия клеток производит только несколько доз на одного пациента, а не сотни или тысячи. В отличие от аллогенной клеточной терапии, в которой производственные процессы больше похожи на производство антител и рекомбинантных белков, аутологичные клеточные методы лечения, как правило, производятся как мелкомасштабные операции1. Как относительно новое явление в биофармацевтическом производстве2, варианты мелкомасштабной обработки клеток в настоящее время весьма ограничены.

Буферный обмен имеет важное значение для производства клеток. Это один из процессов, происходящих вниз по течению, где клетки удаляются из культурных носителей и концентрируются для криоконсервации или инфузии. В настоящее время мелкомасштабное производство клеток часто применяется процессы, аналогичные тем, которые в академических исследований настройки и опирается на специализированные чистые комнаты для поддержания бесплодия3. Ручные процессы вниз по течению часто используют центрифуги скамейки для гранул и повторной работы ячеек для уменьшения объема и буферного обмена. Эти открытые процессы являются дорогостоящими (т.е. обслуживание рабочей силы и чистой комнаты) и имеют ограниченные производственные мощности, которые не являются идеальными для коммерческого производства2,3.

Внедрение автоматизации было предложено в качестве решения для повышения эффективности производства и достижения коммерческих производств2. Стерильность не может быть достигнута в клеточных продуктах с помощью традиционных методов, используемых для биопрепаратов, таких как гамма-облучение или терминальная фильтрация конца. Вместо этого, автоматизированная закрытая система развернута для снижения риска загрязнения и операторов, полагающих на чистые помещения для поддержания стерильности4. Автоматизация процессов также решает проблему масштабируемости, либо имея несколько систем, работающих параллельно (масштабирование), либо увеличивая вычислительную мощность отдельного устройства (масштабирование), что, в свою очередь, сводит к минимуму изменчивость между операторами. Кроме того, анализ затрат моделирования аутологичных методов лечения позволяет предположить, что автоматизация может снизить затраты на производство5,6. Тем не менее, никакой выгоды не было найдено в аутологичном клиническом испытании стволовых клеток, где автоматизированная производственная платформа была использована7, предполагая, что рентабельность автоматизации может зависеть от индивидуального производственного процесса.

Существуют различные стратегии, в которых автоматизация может быть введена в существующий производственный процесс. Этого можно достичь либо путем внедрения полностью интегрированной платформы, либо модульной цепочки обработки. Есть несколько полностью интегрированных платформ, коммерчески доступных для аутологического производства клеток, таких как CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Кокон (Octane Biotech) и Квантовая (Terumo BCT). Эти интегрированные платформы, которые часто называют «GMP-in-a-box», имеют низкие требования к инфраструктуре и просты в эксплуатации. Однако производственные мощности полностью интегрированной установки могут быть ограничены инкубатором, подключенным к системе. Например, культивирование мощности Prodigy ограничено его 400 мл камеры8 и квантовый картридж имеет предельную площадь поверхности установлен 2,1 м2 (эквивалент 120 T175 колбы)7, которые не могут быть достаточными для пациентов, нуждающихся в более высоких дозах клеток9,10. Кроме того, Prodigy и Квантовая имеют общий атрибут, который ограничивает их использование: операционная единица занята одной партии ячеек на протяжении всего периода расширения ячейки, тем самым ограничивая количество партий, которые могут быть изготовлены каждой единицей11. Модульный подход к автоматизации заключается в создании производственной цепочки с несколькими модульными агрегатами, которая имитирует коммерческий производственный процесс12,13. Этот подход, который отделяет прибор культуры от прибора мытья клетки, может таким образом увеличить эффективность изготавливания. Идеальным устройством обработки будет устройство, адаптируемое и масштабируемое для производственных потребностей12.

Технология Counterflow centrifugation (CFC), которая восходит к 1970-м годы, имеет долгую историю в обработке клеток14. Он достигает концентрации клеток и разделения, балансируя центробежную силу с силой контрпотока. Как правило, суспензия ячейки входит из узкого конца камеры клетки при постоянной скорости потока при условии центробежной силы(рисунок 1А). Поток жидкости оказывается в противоположном направлении к центробежной силе. Это называется силой встречного потока, которая образует градиент в ячейке. Сила контрпотока затем уменьшается по мере того как камера клетки расширяет далеко от кончика конус-образной камеры клетки. Клетки с более высокой плотностью и большим диаметром имеют более высокую скорость осадка, и таким образом они достигают силового равновесия к кончику конусообразной клеточной камеры. Меньшие частицы могут достичь равновесия к основанию камеры или быть слишком малы, чтобы быть сохранены в камере и будут смыты. Технология CFC в основном известна своим применением в обработке продуктов афересеза крови, таких как изолирующие моноциты для дендритной клеточной терапии15,16. С точки зрения буферного обмена, технология ХФУ применяется только в крупномасштабном производстве17 и до сих пор не используется для меньшего масштаба производства аутологичной клеточной терапии.

Для удовлетворения потребности в подходящем устройстве для мелкомасштабного производства ячеек, автоматизированное устройство ХФУ (см. Таблица материалов), был недавно разработан18. Автоматизированное устройство обработки клеток использует технологию центрифугирования контрпотока для удаления мусора и облегчения буферного обмена. Устройство выполняет буферный обмен с одноразовым набором, который может быть стерильным подключен к сумке для передачи ячейки, что позволяет обрабатывать ячейки в стерильной, закрытой системе. Здесь мы исследуем использование центробежного устройства противпотока для выполнения буферного обмена в культурах клеток млекопитающих в автоматизированных протоколах. В этом исследовании мы протестировали протокол буферного обмена с использованием ячеек Jurkat и мезенхимальных стромальных ячеек (MSC) для моделирования типов неприверженных и придерживающихся клеток, соответственно. Клетки jurkat увековечены Т-клетки часто используются для изучения острого Т-клеточного лейкоза19,20. MSCs взрослые стволовые клетки, которые были изучены в клинических испытаниях на людях для широкого спектра заболеваний9.

протокол

1. Подготовка реагентов и ячеек для буферного обмена

  1. Подготовка буферов (см. Таблица материалов) в классе 2 ламинарный капот потока. Используя шприц и игольную сборку, удалите 50 мл соблюй раствора из солен-мешка 500 мл. Замените это с 50 мл 20% человеческого сыворотки альбумина (HSA), чтобы сделать 2% HSA в сольном, который будет служить в качестве буфера стирки.
  2. Удалите клетки из сосудов культуры и выполнить количество клеток, чтобы определить количество исходных клеток и жизнеспособность путем трипан синий исключение. Загрузите клетки в сумку для передачи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе юркатные клетки культивировались в RPMI, а МСК культивировались в DMEM:F12. Оба носителя были дополнены 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 1% антибиотико-антимикотический раствор. Клетки были культивированы при 37 градусах Цельсия с 5% CO2. Для MSCs или адептов клеток, добавить фермент пищеварения (например, трипсин) в культуре сосудов для того, чтобы отделить клетки, и утолить культуры средств массовой информации, как только клетки отделены. В этом протоколе использовалась сумка для передачи, поскольку ячейки были расширены в сосудах культуры. Однако, если клетки культивируются в мешке культуры клеток, он может быть непосредственно подключен к одноразовому набору через стерильную сварку трубки. В этом протоколе для каждого запуска использовались 3 х 107 юркатных ячеек или 1 x 107 МСК, где ячейки были приостановлены в 40 мл культурных носителей.
    1. Загрузите клетки в мешок передачи (см. Таблица материалов)с помощью шприца и иглы сборки, если стерильная трубка сварщика доступна для подключения передачи мешок для одного использования комплект обработки.
    2. Кроме того, используйте пару автоматических ножниц, чтобы сократить соединительной трубки с около 10 см оставаясь прилагается к передаче мешок и добавить женский разъем Luer в конце трубки. Используйте шприц, чтобы аспирировать клетки и носители, а затем подключить шприц к разъему Luer и загрузить ячейки в сумку передачи.
  3. Подключите мешок, содержащий клетки, мыть буфер мешок, содержащий 500 мл мыть явки буферподготовлен в шаге 1.1, мешок отходов, и сбор шприца для одноразовых комплект(Рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соединительное положение каждой сумки зависит от настроек в программе. В этом протоколе мы подключили мешок отходов в положении А, вымойте буфер в положении B, сотовый мешок в позициях D и F, и сбор шприца в положении H(Рисунок 1C).

2. Программа автоматизированного протокола обмена буферами

  1. Откройте графический пользовательский интерфейс (GUI) устройства и нажмите кнопку"START"на ноутбуке или планшете. Затем "Открыть" существующий протокол или нажмите "Новый", чтобы создать новый.
  2. Используйте кнопку«Вперед»и«Назад»,чтобы перемещаться по каждому шагу, выберите клапаны, которые будут открыты/закрыты, центробежная скорость, скорость насоса, направление насоса и триггеры действий. Параметры для каждого шага суммируются в таблице 1. Затем сохраните протокол.

3. Настройка машины

  1. Поместите одноразовый набор обработки на машине и повесить подключенные сумки соответственно. Нажмите на красную кнопку"Стоп/Перезагрузка",чтобы сбросить все клапаны в закрытое положение по умолчанию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Машина будет выполнять тест, когда дверь закрыта, чтобы убедиться, что комплект был помещен правильно и что все клапаны функционируют надлежащим образом.
  2. Подключите графический интерфейс к процессору и нажмите кнопку"Подключите". Затем загрузите сохраненную программу. Когда загорается зеленая кнопка«Игра»,это указывает на то, что протокол готов к запуску.
  3. Откройте ручные зажимы для трубки сумки для передачи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если оператор забудет открыть зажимы, устройство остановится и появится предупреждение датчика давления. Нажмите кнопку«Стоп»,чтобы сбросить устройство и открыть зажимы, чтобы начать снова.

4. Автоматизированный буферный обмен

  1. Пресса"Начало",чтобы инициировать программу буферного обмена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы вручную изменить автоматизированный процесс, нажмите кнопку«Следующая»,чтобы перейти к следующему шагу, прежде чем достичь«Триггера»или нажмите«Пауза»,чтобы приостановить процесс. Это позволит рециркулировать клетки через комплект, сохраняя при этом только клапаны J и K открытыми(рисунок 1C).
  2. В конце шага автоматизации 6(таблица 1),процесс будет приостанавливаться, когда воздух в ныне опустевом мешке вызывает датчик пузыря. Нажмите "Далее", чтобы переместить процесс на следующий шаг, если мешок действительно пуст, или нажмите "Пауза ",чтобы возобновить обработку, если датчик был вызван пузырь в линии.

5. Сбор и отбор проб клеток

  1. Когда автоматизированный процесс закончен, закройте все зажимы труб. Откройте дверь и выняйте одноразовый комплект из устройства. Отключите шприц для сбора ячеек для последующих процессов. Возьмите образец собранных ячеек для подсчета клеток и проверки жизнеспособности (см. шаг 6.2).

6. Проверка процесса

  1. Выполняйте эксперименты управления с помощью ручного протокола обмена буфером.
    1. Центрифуги подвески клеток на 200 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и resuspend клетки с 30 мл буфера мытья клеток. Centrifuge подвески ячейки снова на 200 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и resuspend клетки с 10 мл буфера мытья клеток.
  2. Выполняйте подсчет клеток с помощью промо-экспресса синий вывод о том, чтобы оценить жизнеспособность клеток с помощью автоматизированного счетчика клеток.
  3. Выполните оценку МТС для количественной оценки пролиферации клеток на 2, 24 и 48 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ МТС был выполнен на 96 хорошо ткани культуры пластины в соответствии с инструкциями производителя. После процесса обмена буфером было покрыто 100 букв ел-ликот средств массовой информации клеточной культуры (содержащее 10 000 ячеек джурката или 1500) на одну скважину. В каждый момент времени в каждую скважину добавляли 20 реагентов МТС и инкубировали по 2 ч при 37 градусах Цельсия. Абсорбция оценивалась в 490 нм с помощью считывателя пластин.
  4. Выполните функциональные анализы, чтобы сравнить влияние автоматизированного процесса по сравнению с ручным процессом на ячейки Jurkat и функцию MSC.
    1. Культура юркатных клеток в 96-колодчатой пластине при плотности 1 х 106 клеток/мл стимулируется 50 нг/мЛ форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA) и 1 мкг/мл иономицина (коктейль для клеточной стимуляции) в DMEM:F12 СМИ, содержащие 10% плодовой сыворотки (FBS) для 24 h. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
    2. Измерьте производство интерлейкина-2 из культуры супернатанта с помощью анализа ELISA на основе бисера (см. Таблица материалов)в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Культура MSCs в 12 хорошо пластины при плотности 10000 клеток / см2 в 1 мл DMEM: F12 сми, содержащие 10% FBS дополнены интерферон-50 единиц / мл для 48 ч. Соберите супернатант для цинюренина концентрации анализ для измерения индолеамина 2,3-диоксигена (IDO) ферментной активности MSCs .

Результаты

В этом протоколе мы использовали ячейки Jurkat и MSC в качестве репрезентативных примеров для демонстрации автоматизированного процесса обмена буферами. В ходе процесса, jurkat клетки и MSCs разделяют те же шаги обработки с различиями в центробежной силы и скорости насоса, которые контролируют...

Обсуждение

Описанный автоматизированный протокол обмена буфером прост и удобен для пользователя. Тем не менее, есть несколько ключевых шагов в этом протоколе, которые имеют решающее значение и требуют особого внимания. По нашему опыту, при обработке более крупных клеток, таких как MSC (средний диам...

Раскрытие информации

SW, IF и DJ являются coO, cTO и генеральным директором Scinogy Pty. Ltd. Доступ к устройству ХФУ также предоставила компания Scinogy.

Благодарности

Эта работа поддерживается Викторианской правительством оперативной программы поддержки инфраструктуры, а также викторианской правительства технологии ваучер, предоставляемый Департаментом экономического развития, рабочих мест, транспорта и ресурсов. RL является получателем Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям Карьера развития стипендий. AL является лауреатом Австралийской премии последипломного образования.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
20 ml Luer lock syringesBD302830
20% Human serum albumin (HSA)CSL BehringAUST R 46283
4-(Dimethylamino)benzaldehydeSigma-Aldrich156477-25g
500ml IV saline bagFresenius KabiK690521
Antibiotic-AntimycoticThermo Fisher Scientific15240112
Automated cell counter (Countess)Thermo Fisher ScientificN/A
Cell counting chamber slidesThermo Fisher ScientificC10228
Cell stimulation cocktail (500x)Thermo Fisher Scientific00-4970-93
Cell transfer bagsTerumoT1BBT060CBB
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)PromegaG3582
CentrifugeEppendorf5810R
DMEM: F12 mediaThermo Fisher Scientific11320082
EnVision plate ReaderPerkin ElmerN/A
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific10099141
Human Interleukin 2 (IL2) KitPerkin ElmerAl221C
Luer (female) fittingsCPCLF41
PC laptop or PC tablet deviceASUSN/A
Plate reader (SpectraMax i3)Molecular DeviceN/A
Recombinant Human IFN-γPeproTech300-02
Rotea counterflow centrifuge cell processing deviceScinogyN/A
Rotea single-use processing kitScinogyN/A
RPMI mediaThermo Fisher Scientific11875119
Surgical scissorsProSciTech420SS
Trichloroacetic acideSigma-AldrichT6399-250g
Trypan Blue stainThermo Fisher ScientificT10282
Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme)Thermo Fisher Scientific12604013

Ссылки

  1. Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1. BioProcess International. 16 (3), (2018).
  2. Hampson, B., Ceccarelli, J. Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here?. BioProcess International. 14 (4), (2016).
  3. Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. Mapping success for commercial cell therapy manufacturing. BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).
  4. Heathman, T. R., et al. The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges. Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).
  5. Lipsitz, Y. Y., et al. A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products. Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).
  6. Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2. BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).
  7. Hanley, P. J., et al. Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System. Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).
  8. Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like?. Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).
  9. Galipeau, J., Sensebe, L. Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities. Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).
  10. Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry?. Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).
  11. James, D. How short-term gain can lead to long-term pain. Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).
  12. Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies. Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).
  13. Rafiq, Q. A. Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture. Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).
  14. Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE). Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).
  15. Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra™) for clinical-scale generation of dendritic cells. Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).
  16. Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study. Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).
  17. Whitford, W. G., Subramanian, G. . Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. , (2014).
  18. . SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH & CONCENTRATION Available from: https://www.scinogy.com/projects (2019)
  19. Yu, D., et al. Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule. Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).
  20. Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways. Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).
  21. Ling, W., et al. Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment. Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).
  22. Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).
  23. Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
  24. Zhu, F., et al. Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products. Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).
  25. Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch. Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).
  26. Stroncek, D. F., et al. Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies. Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).
  27. Mfarrej, B., et al. Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts. Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).
  28. Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation. Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).
  29. Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).
  30. Lim, R., et al. First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study. Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

154

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены