JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים האדם 3D מטריקס-adipocyte מערכת תרבות מבחנה המאפשרת ניתוח של התפקידים של מטריקס ואדיפוציטים בתרומה לפנוטיפ רקמה מטבולית של רקמת השומן.

Abstract

מטריצת החילוץ (ECM) ממלאת תפקיד מרכזי בוויסות הומאוסטזיס רקמות, העוסקים בפיצול תאים ובוויסות היבטים מרובים של הפונקציה התאית. ה-ECM ממלאת תפקיד חשוב במיוחד בתפקוד רקמת השומן בהשמנה, ושינויים בתצהיר ECM של רקמת השומן ובקומפוזיציה משויכים למחלות מטבוליות בעכברים ובבני אדם. Tractable מודלים בעלי מבחנה המאפשרים ניתוח של התפקידים של ECM ותאים בתרומה לפנוטיפים הרקמה הגלובלית דליל. אנו מתארים רומן 3D במודל מתורבת של תרבות ECM-adipote האנושית המאפשרת ללמוד את התפקידים הספציפיים של ECM ו adipocytes בוויסות שומן השומן רקמות מטבולית. רקמת השומן האנושית היא decellularized כדי לבודד ECM, אשר לאחר מכן מאוכלס מחדש עם preadipocytes כי הם הבדיל אז בתוך ECM לתוך adipocytes בוגרת. שיטה זו יוצרת מבנים ECM-adipote כי הם metabolically פעילים ולשמור מאפיינים של הרקמות והמטופלים שמהם הם נגזרים. השתמשנו במערכת זו כדי להדגים את הוצלב הספציפי למחלות ECM-adipote ברקמת השומן האנושית. מודל תרבות זה מספק כלי לניתוח התפקידים של ECM ו אדיפוציטים בתרומה לפנוטיפ של רקמת השומן הגלובלית והיתרי הלימוד של התפקיד ECM בוויסות הומאוסטזיס של רקמת השומן.

Introduction

מטריצת החילוץ (ECM) לא רק מספקת פיגום מכני לרקמות, אלא גם עוסקת בוצלב מורכב עם תאים השוכנים בתוכו, ויסות תהליכים מגוונים הנחוצים למתן רקמות, כולל הפצת תאים, בידול, איתות, ומטבוליזם1. בעוד ECM בריא משחק תפקיד חיוני תחזוקה של תפקוד רקמות נורמלי, ECM תפקודית כבר מעורב מחלות מרובות2.

רקמת אדיפוז ממלאת תפקיד חשוב בפתוגנזה של מחלות מטבולית. השמנת יתר קשורה מוגזמת adipocyte יפרטרופיה והיפוקסיה הסלולר, פגמים בחילוף החומרים הסלולר adipocyte, ו האדיפוז רקמות רשתית פלזמית ומתח חמצוני ודלקת. בעוד מובן מאליו, תהליכים מורכבים אלה זוממים לפגוע ביכולת האגירה התזונתיים של רקמת השומן, המובילה לגלישה מזינים מרקמת אדיפוז, רעילות ברקמות מרובות ומחלות מטבולית מערכתית3,4 ,5. רצף האירועים והמנגנונים הספציפיים העומדים בפני כשל רקמות השומן אינם מובנים בצורה מובנת, אך שינויים ברקמת האדיפוז של ECM היו מעורבים. הרכב ה-ECM משתנה בתוך רקמת השומן בהשמנה אנושית ומורתית, עם היתר מוגבר של חלבון ECM, יחד עם הבדלים ביוכימיים ומבניים איכותיים ברקמת השומן של ECM המזוהה עם מחלת חילוף החומרים האנושית, כולל סוכרת מסוג 2 ו-היפרליפידמיה6,7,8,9,10,11.

למרות התצפיות הללו, תפקידה של ECM רקמת האדיפוז בתפקוד לקוי של רקמת השומן אינו מוגדר היטב. זה חלק בשל חוסר של מודלים ניסיוניים מעקב המאפשרים ניתוח של התפקידים הספציפיים של ECM ו adipocytes בוויסות תפקוד השומן האולטימטיבי הרקמה. תרבות ECM-אדיפוטה מדמה את הסביבה הvivo של רקמת השומן הטבעית לפחות בשתי כבוד. ראשית, תרבות ECM מספקת סביבה מולקולרית דומה לרקמת האדיפוז הטבעית, כולל קולגוניה מקורית, אלאסטנים וחלבונים מטריצות אחרים הנעדרים בתרבות דו-ממדית. שנית, התרבות על פלסטיק 2D הוכח לשנות את חילוף החומרים adipocyte באמצעות אפקטים מכניים בשל אלסטיות ירד של המצע פלסטיק12, אשר ecm-תרבות מבטלת.

שיטות למהנדס פיגומים ביולוגיים על ידי בידוד של ecm מ decellularized אדיפוז ורקמות אחרות נחקרו בהקשר של משובי ורפואת שיחזור והנדסת רקמות13,14, .15,16,17,18 פרסמנו בעבר מתודולוגיה שבה הותאמו שיטות אלה כדי לפתח בדגם תלת-ממד של האדם התלת-ממדי של החברה ECM-adipote האנושית, באמצעות ECM ו-adipocyte בתאי גזע (preadipocytes) נגזר רקמות הקרביים האדם שפוז11. במאמר הנוכחי, אנו מתארים את השיטות האלה בפרוטרוט. ההליך הdecellularization לרקמת השומן האנושית הוא תהליך בן ארבעה ימים הכרוך בטיפולים מכניים ואנזימטיים להסרת תאים ושומנים בדם, תוך השארת פיגום ביולוגי השומר על מאפייני הרקמה שממנה היא נגזרת. Decellularized ECM תומך בבידול adipogenic של האדם preadipocytes, וכאשר מחדש עם adipogenic, שומר מיקרוארכיטקטורה ביוכימיים ומאפיינים ספציפיים למחלות של רקמת אדיפוז שלמים ועוסקת מטבולית פונקציות האופייניות לרקמת השומן הטבעית. ניתן ללמוד מטריצה זו לבדה או להתחמש עם תאים, ולאפשר לימוד של אינטראקציות והצלבות בין הרכיבים הסלולריים והסלולאריים של רקמת האדיפוז.

Protocol

הרקמות של אדיפוז מושגו מנושאים אנושיים שעברו ניתוח בריאטרי באמצעות אישור מוסדי.

1. הכנה לבידוד ובידוד תרבות

  1. הכינו 2% מהסרום (BSA) בתמיסת מלח באגירה של 1 x פוספט (PBS). המסנן מעקר ומאחסן ב-4 ° c.
  2. הכנת קולגן סוג II: 2 מ"ג/mL ב 2% BSA ב-1x PBS. הכן מיד לפני השימוש.
  3. הכן תא דם אדום (rbc) לישיר פתרון: 1.5 M NH4Cl, 100 mm נחקו3, 10 מ"מ ניתרן edta במים מאוהים (DI/H2O). חנות ב -4 ° c. הכינו 1 x RBC פתרון למעלה מפתרון מניות 10x ב-DI/H2O מיד לפני השימוש.
  4. להכין מדיה צמיחה: 15% סרום של שור עוברי (FBS), 1% אנטיביוטי-antimycotic פתרון (ABAM) ב מדיום הנשר שונה ביותר של Dulbecco: תערובת מזינים F-12 (Dמאמ/F12). המסנן מעקר ומאחסן ב-4 ° c.
  5. הכנת פתרון הקפאה מראש: 10% Diמתיל סולפוקסיד, 15% FBS בתקשורת Dמאמ/F12. המסנן מעקר ומאחסן ב-4 ° c.
  6. להכין בידול מדיה: 10 מ"ג/L הטרנספרין, 33 μM biotin, 0.5 μM פתרון אינסולין אנושי, 17 μM D-פנטאונום חומצה hemicalcium מלח, 100 nM dexamethasone, 2 ננומטר 3, 3 ', 5-Triiodo-L-thyronine נתרן מלח (T3), 1 μM סיקילידיליזון, 540 μM 3- איזובוטיל-1-מתילקסאתה (IBMX), 1% ABAM ב-DMA/F12. המסנן מעקר ומאחסן ב-4 ° c.

2. הכנה מכימית של ECM

  1. הכנת מאגר הקפאה פתרון: 10 מ"מ בסיס טריס, 5 מילימטר EDTA, 1% ABAM, 1% פנילמתיל פלופקסיל (PMSF) ב-DI/H2O. מערבבים פתרון כדי לפזר edta. התאם את ה-pH ל 8.0 עם HCl או NaOH. Store ב-4 ° צ' עד 3 חודשים.
  2. הכנת פתרון אנזימטי #1:1% ABAM בשנת 0.25% טריפסין-EDTA. החנות ב -4 ° c עד שלושה חודשים.
  3. להכין את הפתרון מאגר שטיפה: 137 mM הנאקל, 2.68 mM KCl, 7 מ"מ Na2hpo4, 1.5 mm KH2PO4, 1% abam, 1% Pmsf ב מעוקר DI/H2O. מערבבים כדי לפזר מלחים. התאם את ה-pH ל 8.0 עם HCl או NaOH. החנות ב -4 ° c עד שלושה חודשים.
  4. הכנת פתרון אנזימטי #2:55 mM Na2hpo4, 17 מ"מ KH2PO4, 4.9 mm mgso 4 ∙ 7H2o, 1% ABAM, 1% Pmsf ב-DI/H2o. Store 4 ° צ' עד 3 חודשים. מערבבים כדי לפזר מלחים. מיד לפני השימוש, להוסיף 80 U/mL ליפאז מ חזירי לבלב, סוג VI-S; 160 U/mL deoxyribonuclease אני מלבלב שור, סוג II-S; ו 100 μg/mL ריבונוקלאז A מלבלב של שור, סוג III-A.
  5. הכנת פתרון חילוץ ממיסים קוטבי: 1% ABAM, 1% PMSF ב איזופנול.
    התראה: אלכוהול איזופנול הוא דליק; חנות בארון דליק ב -25 ° c ולהיפטר בפסולת דליקים.
  6. הכינו 70% אתנול, 1% ABAM, 1% PMSF ב-DI/H2O. הוסף abam ו-pmsf רק לפני השימוש.
    התראה: אתנול הוא דליק; חנות בארון דליק ב -25 ° c ולהיפטר בפסולת דליקים.
  7. הכנת פתרון אחסון: 1% ABAM, 1% PMSF ב-1x PBS. החנות ב -4 ° c עד שלושה חודשים.

3. פנוטיפים מטבולית הכנה מגיב

  1. ספיגת גלוקוז
    1. הכנת הרעב סרום מדיה: Dמאמ/F12, 1% ABAM. המסנן מעקר ומאחסן ב-4 ° c.
    2. הכינו את הפתרון האנושי 200 ננומטר לאינסולין ב-1x PBS מיד לפני השימוש.
    3. הכינו 200 של אינסולין אנושי nM, 0.1 מ"מ 2-Deoxy D-גלוקוז, 1 μCi/ובכן Deoxy-D-גלוקוז, 2-[1, 2-3H (N)]-, ב-1X PBS. הכן מיד לפני השימוש.
  2. Lipolysis
    1. מדולל בתמיסה האיזופרופיל ב-PBS: 3 מילימטר מניות. לדלל כדי לעבוד ריכוז של 3 μM לצורך שיטת העבודה.
  3. כצביעת שמן אדום-או
    1. הכן 4% פורמאלין ב-DI/H2O. חנות בטמפרטורת החדר.
    2. להכין את שמן אדום-O פתרון העבודה. לדלל את השמן אדום-O פתרון (ORO) עם DI/H2o ביחס 3:2 (ORO: Di/h2o). הכן מיד לפני השימוש. סינון באמצעות נייר סינון (טבלת חומרים).

4. הרכישה ברקמת אדיפוז

הערה: רקמת השומן בקרביים (מע מ) נאסף ממנטום הגדול בתחילת המבצע על ידי המנתח והועבר חזרה למעבדה על הקרח לעיבוד מיידי. יש להשתמש באמצעי זהירות אוניברסליים כאשר הם מטפלים בכל הרקמות האנושיות ובריאגנטים הקאוסטית, כולל ביצוע כל העבודה במכסה של זרם למינארי, תוך שימוש בלבוש מלא של בטיחות המעבדה, ואין מחסור במחטים.

  1. הוסף 5-10 גרם של מע מ שלם ל 15-25 mL של הקפאת פתרון מאגר בצינור ההקפאה של 50 mL לטבול את דגימת הרקמה. החנות מ80 עד השעה decellularization עד חודש.
  2. השתמש במדגם טרי נוסף של מע מ לבידוד מראש כמתואר בסעיף 5.

5. בידוד מראש

  1. במקום 2 גרם מע מ שלם ב 20 מ ל של הקולגנאז, סוג II, פתרון בשפופרת 50 mL. לאחר מכן הלווה ביסודיות על-ידי הכנסת מספריים סטריליים לתוך צינור החרוט ומכניס את הרקמה בתוך הצינור. פעם אחת לגמרי במלואו כדי שאיפה דק, מודטת את הרקמה בתמיסה הקולגן הפתרון על שייקר מסלולית ב 130 סל ד ו 37 ° צ' עבור 60 דקות.
  2. לסנן את המצב מעכל את התוצאה באמצעות רשת 100 יקרומטר ניילון לתוך צינור האוויר החדש 50 mL על ידי שפיכת המצב מעכל מצינור חרוט אחד דרך פיסת רשת מקופל מעל החלק העליון של צינור חרוט טרי. המצב מעכל בשלב זה צריך להיות נוזל צהוב כתום עם צמיגות מתונה, עם כמויות קטנות של קווצות שיורית של רקמה סיבי מתעכל. הרשת צריכה ללכוד חלקים גדולים יותר של רקמה לא מתעכלת, אשר מושלכים.
  3. צנטריפוגה את המדגם ב 270 x g עבור 10 דקות. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב -2 מ ל של 1X Rbc פתרון ליסינג עם פיפטה.
    1. מודקון עבור 1 דקות ב 25 ° c ולאחר מכן להוסיף 10 מ ל 15% FBS-Dמאמ/F12. צנטריפוגה ב 270 x g עבור 10 דקות.
  4. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב 10 מ ל של 15% FBS-DMEM F12 עם פיפטה. העבר את השעיית התא ל 100 מ"מ צלחת פטרי עם פיפטה ו דגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO2, עד התאים להגיע 80-100% המפגש, בדרך כלל 2-6 ימים. . להחליף את התקשורת כל 2-3 יום
  5. . לנתק ולשטוף תאים
    1. להסיר מדיה עם פיפטה ולהחיל 4 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA לתאים חסיד. מודרת ב 37 ° c עבור 10 דקות, מדי פעם מתערבל את הצלחת בעדינות כדי לנתק את התאים.
    2. הוסף 20 מ ל של 15% FBS-Dמאמ/F12 והשהה מחדש את התאים המנותקים במדיה זו עם פיפטה. לאחר מכן להעביר לצינור החדש 50 mL, צנטריפוגה 270 x g עבור 10 דקות.
    3. הסר את הסופרנטאנט והתעלם. שטוף את הגלולה הסלולרית פעם אחת ב-1x PBS, ולאחר מכן השהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב -20 מ ל של טריים 15% FBS-DMEM F12 עם פיפטה. העבר את ההשעיה התא לבקבוקון תרבות T-150.
  6. תאי תרבות ב37 ° c ו-5% CO2. לפצל ולהרחיב את התאים כל 2-3 ימים כפי שהם מגיעים 80-100% המפגש על ידי החלת 7 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA, הרחבה מבקבוקון אחד ל 8 מבחנות.
    הערה: זה בדרך כלל דורש 3-4 מעברים, אשר מתיר הרחבה מתאימה שומרת על פוטנציאל הטיפול ואת החולה-ואת דיפו ספציפי הסלולר פנוטיפים מטבולית. מעבר החוצה של 4-5 מעברים מוביל לאיבוד פוטנציאל אדיפוגני.
  7. ניתוק תאים ב 8 מבחנות עם 7 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA לכל בקבוקון כמתואר לעיל, ו דגירה ב 37 ° c עבור 10 דקות.
  8. הוסיפו 8 מ ל של 15% FBS-Dמאמ/F12 לבקבוקון והשהה מחדש את התאים המנותקים עם פיפטה. העברת ההשעיה התא כולו מחולק באופן שווה לתוך 3 50 מ"ל צינורות חרוט ו צנטריפוגה ב 270 x g עבור 10 דקות.
  9. השהה מחדש את כדוריות התאים התוצאות ב-5 מ ל של 15% FBS-Dמאמ/F12 בצינור 15 מ"ל וספירת תאים באמצעות מונה תאים וטרילון כחול.
  10. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 270 x g עבור 10 דקות. לאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה תא הקפאה Preadipocyte לריכוז התא הסופי של 1 x 106/mL, ו מגרסה 1 mL של ההשעיה התא לכל 1.5 mL שפופרת קריובקבוקון.
  11. אחסן תאים בהקפאה במשך 1 ימים ב-80 ° c. ולאחר מכן העברת קריובקבוקונים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך במשך 3-6 חודשים.
  12. כאשר מוכן לשימוש, הפשרת קריובקבוקון אחד באמבט מים ב37 ° c עבור 3-5 דקות. להשהות את התאים ב 20 מ ל של 15% FBS-DMEM וצנטריפוגה ב 270 x g עבור 10 דקות.
  13. השהה מחדש את הגלולה בתוך 20 מ"ל של 15% FBS-Dמאמ/F12, פיפטה לתוך הבקבוקון T-150 יחיד, ולאחר מכן לגדול ל 80% המפגש על 2-3 ימים ב 37 ° c ו-5% CO2.
  14. לנתק תאים עם 7 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA לכל בקבוקון כמתואר לעיל בשלב 5.6. השעיה מחדש ב 3,000,000 תאים לכל mL (כלומר, 6 x 104 תאים לכל 20 μl) בתוך 15% FBS-Dמאמ/F12, ולהשתמש כמתואר להלן (סעיף 7, שלב 7.4).

6. הכנה לרקמות ECM

  1. יום 1: הקפאת הפשרה והעיכול האנזימטי #1
    1. הקפאת ההקפאה שהוקפאה בעבר (שלב 4.2) דגימות מע מ שאוחסנו בתמיסה מאגר הקפאה ב 50 מ"ל צינורות חרוטי מ-80 ° צ' עד 37 ° c באמבט מים מחומם מראש, דגירה 20 דקות עם עצבנות באופן תקופתי עדין ידני. לאחר להפשיר, להעביר בחזרה-80 ° צ' ו דגירה 20 דקות. חזרה על הקפאת ההפשרה 3x, המסתיימת על ידי היפטרים דגימות באמבט מים 37 ° c.
    2. בעזרת מלקחיים סטריליים, העבירו את דגימות המע מ לצינורות ה50 הטריים המכילים 15-25 מ ל של תמיסה אנזימטית #1, והקפדה על כך שדגימות המע מ שקועים במלואו. ואז הדגירה לילה על שייקר מסלולית (130 rpm, 37 ° c).
  2. יום 2: מ#2 עיכול אנזימטי
    1. לשטוף דגימות 3x עם 15-25 mL של פתרון מאגר שטיפה על שייקר מסלולית (130 rpm, 37 ° c, 20 דקות כל לשטוף). יוצקים את הפתרון של מאגר שטיפה לאחר כל כביסה.
    2. דגימות העברה טרי 50 mL שפופרות חרוט המכיל 15-25 mL של פתרון אנזימטי #2 ו דגירה על שייקר מסלולית (130 rpm, 37 ° c, לילה).
  3. יום 3: מדליזציה
    1. לשטוף דגימות 3x עם 15-25 mL של פתרון מאגר שטיפה על שייקר מסלולית (130 rpm, 37 ° c, 20 דקות כל לשטוף). יוצקים את הפתרון של מאגר שטיפה לאחר כל כביסה.
    2. דגימות העברה טרי 50 mL שפופרות חרוט המכיל 15-25 mL של הפתרון החילוץ ממיסים הקוטב ו-דגירה על שייקר מסלולית (130 rpm, 25 ° c, לילה). לאחר שלב זה, רוב השומנים יש להסיר, ואת הדגימות צריך להיות לבן או שקוף בצבע.
      התראה: הפתרון לחילוץ הממס הקוטבי דליק ויש לאחסנו ולהשתמש בו ב -25 ° c.
  4. יום 4: לרחוץ ולאחסן
    1. דגימות העברה טרי 50 mL שפופרות חרוט המכיל 15-25 mL של פתרון מאגר שטיפה. לשטוף דגימות 3x על שייקר מסלולית (130 rpm, 37 ° צ', 20 דקות כל כביסה).
    2. לשטוף דגימות 3x עם 15-25 mL של 70% אתנול על שייקר מסלולית (130 rpm, 37 ° c, 20 דקות לשטוף כל) נשפך את הפתרון של 70% אתנול לאחר כל לשטוף.
    3. שטוף דגימות פעם אחת עם פתרון אחסון על שייקר מסלולית (130 rpm, 37 ° c, 20 דקות כל כביסה).
    4. באמצעות מלקחיים סטריליים, דגימות העברה כדי טריים 50 mL צינורות חרוט המכיל 15-25 mL של פתרון אחסון. ודא שפתרון אחסון מספיק משמש כדי לטבול דגימות במלואה. החנות ב-4 ° צ' עד חודש אחד.

7. הכנת ECM-אדיפוציט

  1. העבר מאוחסנים שברי ECM לבארות בודדות של צלחת 24-באר באמצעות מלקחיים סטרילי. הוסף כמה שברי ECM רבים לתוך בארות רבות ככל הנדרש עבור שיטת הזרם המתוכנן (למשל, ספיגת גלוקוז או lipolysis, ראה להלן), כולל כפילויות או טריליטים. לשטוף עם 500 μL של 70% אתנול 3x על שייקר מסלולית (130 rpm, 37 ° c, 20 דקות לשטוף כל).
  2. מייבשים את ECM על ידי כביסה 3x סטרילי 1 x PBS על שייקר מסלולית (130 rpm, 37 ° c, 20 דקות כל כביסה).
  3. באמצעות מספריים סטריליים, חותכים ושוקלים ECM לתוך שברי 100 מ ג. באמצעות מלקחיים סטריליים, מקום 1 100 מ ג מקטע בכל טוב של צלחת 24 הבאר. מודקון ב-25 ° c עבור 15 דקות כדי לאפשר את הבלטת הערוץ מרסיסים. הסר בזהירות את הערוץ העודף של PBS עם פיפטה.
  4. הזרע כל 100 מ ג מקטע ECM עם 20 μL של ההשעיה התא preadipote (3,000,000 תאים לכל mL, 6 x 104 תאים לכל 20 μl, ב 15% fbs-Dמאמ/F12, משלב 5.10). פיפטה את התאים ישירות לתוך ECM על ידי הצבת את הקצה של הפיפטה ב ECM ולסלק בעדינות את התא הבולם למרכז המטריצה, מטפלת כי ההשעיה התא אינו גולש ובסופו של דבר בתחתית הבאר.
    1. אם השעיית התא מוצפת ב-ECM שבו מוצב קצה הפיפטה, הסר את העצה ממיקום זה והוסף למקום אחר ב-ECM. הדגירה הנזרע ECM עבור 40 דקות ב 37 ° c.
      הערה: להפקת RNA עבור qrtPCR, הזרע כל 500 מ"ג ECM שברי עם 3 x 105 תאים ב 100 μl (3,000,000 תאים לכל mL, כלומר, 3 x 105 תאים לכל 100 μl, ב 15% FBS-Dמאמ/F12).
  5. למלא כל היטב את הצלחת 24-באר עם 500 μL של מדיית הצמיחה כדי לכסות את השברים ECM שנזרע. תרבות ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 72 h.
  6. לאחר 72 h, הטיה בזהירות של 15% FBS-Dמאמ/F12, הטיית הצלחת מעט כדי לאפשר מדיה לבריכה מתחת לרסיס, והצבת את הקצה של הפיפטה סמוך לרסיס ECM מבלי להפריע לו. לאחר הוספת שריר, להוסיף 500 μL של בידול מדיה, שינוי מדיה כל 2-3 ימים באמצעות טכניקה דומה, לתקופת תרבות כוללת של 14 ימים.
    1. בדיקת בידול באמצעות מיקרוסקופ אור: התאים לצבור שומנים, להפוך חום צהוב בצבע וכדורי יותר בצורה.
      הערה: מטריצות הנזרע ניתן להשתמש עבור בדיקות מטבולית (למשל, שיטת ספיגה של גלוקוז, שיטת lipolysis, ORO), היסטולוגיה או אימונוהיסטוכימיה (IHC), או הדמיה סטנדרטית רקמה. עבור רקמה קבועה ORO כתמים והדמיה, הקפאת ECM-adipote דגימות בחנקן נוזלי.

8. פנוטיפים מטבוליים

  1. סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני
    1. לתקן דגימות ב 2.5% גלוטאלדהיד במאגר הפוספט של סורנסן ב -25 ° c עבור 12 h. postfix ב 1% אוסמיום tetroxide במאגר הפוספט של סורנסן ב -4 ° c עבור 1 h.
    2. . באמת? . ולייבש את האוויר ואז לעלות על שארית מיקרוסקופ. אלקטרוני עם גרפיט . יבש ומעיל עם זהב
    3. לכידת תמונות עם מיקרוסקופ אלקטרון סריקה.
  2. כצביעת שמן אדום-או
    1. לחיות ברקמה: תמיסת שמן אדום-O
      1. מחצי בזהירות מדיה. מבארות עם פיפטה ואז לשטוף דגימות פעם עם 500 μL של ערוץ 1x לכל טוב.
      2. תקן דגימות עם 200 μl של 4% פורמלין ב-H2ו מעוקר מעוב ב -25 ° c במשך 15 מעלות צלזיוס. לשטוף את המילין עם הצנרת, לכבס דגימות שתי פעמים עם 1x PBS (500 μl כל כביסה).
      3. הוסף 200 μL של 60% איזופנול דגימות ב-25 ° c עבור 5 דקות 60. מרוב התוספות האיזופנול באמצעות פיפטה.
      4. דגימות כתם עם השמן אדום-O פתרון עובד ב 25 ° c עבור 5 דקות. מכתים שמן אדום-O עם פיפטה ולאחר מכן לשטוף דגימות 3x עם 1x PBS (500 μL כל לשטוף). ואז תמונה עם מיקרוסקופ אופטי.
    2. רקמה קבועה: שמן אדום-הו ערכת כתם
      1. Flash-הקפאת דגימות ECM-adipote בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) מתחם וסעיף (5 μm) על קריוסטט.
      2. מניחים את השקופית ב 85% פרופילן גליקול DI/H2O עבור 2 דקות. מניחים את השקופית בכתם ORO ב 60 ° צ' עבור 6 דקות. מניחים מרולידים ב 85% פרופילן גליקול ב-di/h 2 oעבור 1 דקות. לשטוף את השקופית פעמיים עם di/h2או.
      3. מניחים את השקופית ב המטאוקסילין של מאייר שונה מערכת שמנים אדום-O מכתים במשך 1 דקות. שטוף את השקופית פעמיים עם מי ברז. שטוף את השקופית פעמיים עם DI/H2O.
      4. הר הכיסויים באמצעות בינוני הרכבה מימית ותמונה על מיקרוסקופ.
    3. הוצאת רנ א מתוך ECM עבור qrtPCR
      הערה: כדי למקסם את התשואה RNA, השתמש 500 mg ECM רסיסים שנזרע עם 3 x 105 preadipocytes ב 100 μl ולהבדיל כמו לעיל 6-היטב צלחות ב 3 מ ל של הבידול מדיה לכל טוב.
      1. לאחר הבדיל, להעביר כל בודד ECM-adipote מדגם לתוך שפופרת חרוט 50 mL על הקרח באמצעות מלקחיים סטרילי.
      2. רוחצים היטב ריק עם 500 μL של מאגר RLT. הוסף מאגר RLT כדי 50 מ"ל צינור חרוט עם מדגם ECM-adipote התאמה.
      3. באמצעות מספריים סטרילי, היטב היטב כל מדגם ECM-adipote בתוך שפופרת חרוט 50 mL, תוך החזקת הצינור על הקרח, החדרת המספריים לתוך צינור החרוט כדי הרקמה.
      4. הקפאת לחלוטין והפשרת צינורות החרוט מ-80 ° צ' עד 37 ° צ' 3 x.
      5. צנטריפוגה צינורית חרוט ב 500 x g ו 4 ° צ' עבור 10 דקות.
      6. הסר בזהירות את supernatant עם פיפטה ולהשתמש עבור החילוץ RNA עם מערכת החילוץ של רקמות סיבי RNA (טבלת חומרים).
  3. שיטת ספיגה של גלוקוז
    1. להבדיל 6 x 104 preadipocytes ב 100 מ"ג ecm שברי ב 0.5 mL של בידול בינוני בצלחות 24-טוב כמתואר לעיל (סעיף 5).
    2. לאחר 14 ימים של בידול, להסיר את המדיום ולשטוף ECM-adipocytes פעם עם 1x PBS. הוסף 0.5 mL/היטב סרום רעב בינוני ותרבות ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 12 h.
    3. הסר את התאים הבינונית ושטוף פעמיים באמצעות 1x PBS. הוסף 0.5 mL/ובכן 2% BSA ב PBS ותרבות ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 2 h.
    4. לשטוף את התאים פעם אחת עם 1x PBS, להוסיף 0.5 mL/ובכן 1x PBS עם או ללא 200 אינסולין nM, ו דגירה ב 37 ° צ' עבור 40 min.
    5. , מנפח את הערוץ 1 x PBS להוסיף 0.5 mL/טוב 1x PBS עם 0.1 mM 2-deoxy d-גלוקוז, 2 μci/mL deאוקסי-d-גלוקוז, 2-[1, 2-3H (N)], עם או בלי 200 האינסולין ננומטר, ו הדגירה ב 37 ° c ו 5% CO2 עבור 40 min. השתמש באמצעי זהירות סטנדרטיים לטיפול ו ריאגנטים רדיואקטיבי ופסולת רדיואקטיבית, כפי שנקבע על ידי חוקים מוסדיים מקומיים רגולציה.
    6. להסיר בינוני עם פיפטה ולשטוף את התאים 3x עם 1x PBS. הוסף 420 μL של 1% SDS פתרון ב-DI/H2O, ו-lyse תאים עם ליטוף נמרץ. דגירה 25 ° c עבור 10 דקות.
    7. לאסוף 5 μL מכל באר עבור שיטת ברדפורד חלבון. העבר 400 μL של תא שנותר לאחר לפני 2 מ ל של נוזל של שדות בקבוקון במבחנה. ספירת 3מע. ניתוח נתונים כספירות לדקה הנורמלות לחלבונים, mg/mL.
  4. שיטת לימפוליזיס
    1. להבדיל 6 x 104 preadipocytes ב 100 מ"ג ecm שברי ב 0.5 מ ל של האדם בידול בינוני בצלחות 24-טוב כמתואר לעיל (סעיף 5).
    2. לאחר 14 ימים של בידול, להסיר בינוני ולשטוף את התאים פעמיים עם חם 1x PBS. הוסף 0.5 mL של הרעב סרום בינונית (ללא אינסולין) עם או בלי שלושה μM איזוטראנונול, והתרבות adipocytes ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 72 h.
    3. לאסוף סופר התרבות, אשר ניתן לאחסן ב--80 ° צ' עד מוכן לצורך שיטת. לאסוף את ECM בצינורות מיקרוצנטריפוגה עבור כימות ה-DNA עבור נרמול נתונים.
    4. Pipet 2 μL של כל supernatant לתוך מיקרוצלחת 96. מילואים בארות עבור כדורי סרק (H2O מזוקקים) ו גליצרול פתרון סטנדרטי שסופקו בערכת קביעת הטריגליצרידים.
    5. הוסף 270 μL של גליצרול חינם מגיב מערכת ההגדרה של טריגליצרידים לכל טוב, פיפטה לערבב. לוחית הדגירה ב 37 ° c עבור 5 דקות.
    6. ספיגת מידות ב 540 ננומטר על ספקטרוסקופיה מיקרופלטה.
    7. חישוב הריכוז של גליצרול ולנרמל עם דנ א מ ECM:

figure-protocol-16933

תוצאות

הכנת הרקמה האדיתית ECM, זריעת עם preadipocytes, ובידול מחוץ גופית לתוך adipocytes בוגרת התוצאה ברורים שינויים רציפים מורפולוגיים ברקמה המאפשרת הערכה חזותית של התקדמות לאורך הפרוטוקול (איור 1) . החומצה הפרפוציטים המשמשת לזריעה את ה-ECM מבודדת באמצעות העיכול מדגימות מע מ ...

Discussion

מודל התרבות ECM-אדיפוט מספק כלי רב ערך לניתוח התפקידים הבודדים של ECM ותאים בכתיב פנוטיפים האולטימטיבי של רקמה. פרוטוקול הבידוד של ECM אינו ניתן לעיבוד, אך ייתכן שניתן יהיה לצפות בשינויים בתהליך הdecellularization. הצעד הטוב ביותר של יום 3 הוא נקודה קריטית בפרוטוקול. בסיומו של החילוץ לילה, מדליזציה של ה...

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על אינטרסים סותרים.

Acknowledgements

אנו מודים לדניאל ברגר, מרילין וודרוף, סימון קורראה, ורית'ה גייס לסיוע בתיאום לימוד. SEM בוצע על ידי אוניברסיטת מישיגן מיקרוסקופ & ניתוח תמונה מעבדה במחקר ביו רפואי מתקן ליבה. פרויקט זה נתמך על ידי NIH מענקים R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), ותיקי הצטיינות מענק הוקרה I01CX001811 (RWO), מענק פיילוט והיתכנות ממרכז מחקר סוכרת מישיגן (NIH גרנט P30-DK020572) (RWO), מינהל ותיקי ומרק 10 הניצוץ פיילוט הגרנט (RWO). סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני בביצוע מיקרוסקופ אוניברסיטת מישיגן & ניתוח תמונה מעבדה במחקר ביו רפואי מתקן ליבה. איור 4 של כתב יד זה פורסם במקור ב בייקר ואח ', J Clin אנדו Metab 2017; 1 במרס, 102 (3), 1032-1043. דוי: 10.1210/jc. 2016-2915, והוא שוחזר על ידי רשות העיתונות של אוניברסיטת אוקספורד [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. כדי לקבל הרשאה לשימוש חוזר בחומר זה, בקר בhttp://global.oup.com/academic/rights.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTAGibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#25200056
1.5 mL cryovial tubeFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#02-682-557
10% Neutral Buffered FormalinVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#89370-094
100 µm nylon mesh filterCorning Inc., Corning, NY, USACat#352360
2-Deoxy-D-glucoseSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#D8375
2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#T6397
24-well tissue culture platesVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10861-700
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#I5879
96-well tissue culture platesVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10861-666
Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#15240062
BiotinSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#B4639
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#A8806
Buffer RLTQiagen, Hilden, GermanyCat#79216
CiglitizoneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#C3974
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USACat#NET328A250UC
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#D4513
DexamethasoneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#D4902
Dimethyl SulfoxideFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#BP231Flammable, caustic
Disodium EDTAFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#BP118
D-pantothenic acid hemicalcium saltSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#21210
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#11320033
EthanolDecon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USACat#DSP-MD.43Flammable
EVE Cell Counting Slides, NanoEnTekVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10027-446
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#10437028
GlutaraldehydeSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#G5882Caustic
HexamethyldisalizaneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#440191Flammable, caustic
Human insulin solutionSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#I9278
IsopropanolFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#A415Flammable
IsoproterenolSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#I5627Flammable
KClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S25484
KH2PO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#P5655
Lipase from porcine pancreas, type VI-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#L0382
MgSO4*7H2OSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#230391
Na2HPO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S5136
NaClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S3014
NaHCO3Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#S233
NH4ClFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#A661
Optimal cutting temperature (OCT) compoundAgar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UKCat# AGR1180
Oil Red-O Solution (ORO)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#O1391
Oil Red-O Stain KitAmerican Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USACat#KTORO-G
Osmium tetroxideSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#201030Caustic
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#93482Caustic
Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#SH3025601
Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-ASigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#R5125
RNAEasy Fibrous Tissue MiniKitQiagen, Hilden, GermanyCat#74704
Scintillation FluidFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#SX18
Scintillation Counter
Scissors, forceps, sterile
Sorensen's phosphate bufferThomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJCAS #: 10049-21-5
T-150 culture flaskVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10062-864
TaqMan Gene Expression Master MixThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#4369016
Temperature-controlled orbital shaker
Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube HomogenizerBenchmark ScientificCat#D1030
TransferrinSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#T3309
Triglyceride Determination KitSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#TR0100
Trypan blue stain, 0.4%VWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10027-446
Type II collagenaseGibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#17101015
Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mmSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#WHA5201150

References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
  2. Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
  3. Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
  4. O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
  5. Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
  6. Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
  7. Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
  8. Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
  9. Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
  10. Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
  11. Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
  12. Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
  13. Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
  14. Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
  15. Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
  16. Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
  17. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  18. Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
  19. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
  20. Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
  21. Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
  22. O'Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
  23. Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
  24. Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

153

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved