マトリックス細胞代謝クロストークを研究するためのヒト3D細胞外マトリックス-脂肪細胞培養モデル

要約

我々は、脂肪組織代謝表現型に寄与するマトリックスおよび脂肪細胞の役割の解剖を可能にする3Dヒト細胞外マトリックス脂肪細胞in vitro培養システムを記述する。

要約

細胞外マトリックス(ECM)は、組織恒常性を調節し、細胞とのクロストークに従事し、細胞機能の複数の側面を調節する上で中心的な役割を果たします。ECMは、肥満における脂肪組織機能において特に重要な役割を果たし、脂肪組織ECM堆積および組成物の変化は、マウスおよびヒトにおける代謝疾患と関連している。グローバル組織表現型に寄与するECMおよび細胞の役割の解剖を可能にするトラクティン可能なインビトロモデルはまばらである。我々は、脂肪組織代謝表現型を調節するECMおよび脂肪細胞の特定の役割の研究を可能にするヒトECM-脂肪細胞培養の新しい3D体外モデルを記述する。ヒト脂肪組織は、ECMを単離するために脱細胞化され、その後、ECM内で成熟脂肪細胞に分化するプレディポサイトで再設定される。この方法は、代謝活性であり、それらが由来する組織および患者の特性を保持するECM-脂肪細胞構築物を作成する。このシステムを用いて、ヒト脂肪組織における疾患特異的なECM-脂肪細胞クロストークを実証した。この培養モデルは、世界的な脂肪組織代謝表現型に寄与するECMおよび脂肪細胞の役割を解剖するためのツールを提供し、脂肪組織恒常性を調節するECMの役割の研究を可能にする。

概要

細胞外マトリックス(ECM)は、組織の機械的足場を提供するだけでなく、その中に存在する細胞との複雑なクロストークにも従事し、細胞増殖を含む組織恒常性に必要な多様なプロセスを調節し、分化、シグナル伝達、代謝¹.健康なECMは正常組織機能の維持に不可欠な役割を果たしているが、機能不全ECMは多重^疾患2に関与している。

脂肪組織は、代謝性疾患の病因において重要な役割を果たす。肥満は、過剰な脂肪細胞肥大および細胞低酸素症、脂肪細胞細胞代謝の欠陥、および脂肪組織小胞体および酸化ストレスおよび炎症に関連している。十分に理解されていないが、これらの複雑なプロセスは、脂肪組織の栄養緩衝能を損なう陰謀を引き起こし、脂肪組織からの栄養オーバーフロー、複数の組織における毒性、および全身代謝^疾患3、4を引き起こす^、5.脂肪組織の不全の根底にある一連の事象および特定のメカニズムは十分に理解されていないが、脂肪組織ECMの改変は関与している。ECM組成物は、ヒトおよびマウス肥満における脂肪組織内で改変され、ECMタンパク質の堆積と、ヒト代謝疾患に関連する脂肪組織ECMの定性的生化学的および構造的差異が増加した。2型糖尿病および高脂血症6、7、8、9、10、11.

これらの観察にもかかわらず、脂肪組織機能障害を媒媒を媒取する脂肪組織ECMの役割は十分に定義されていない。これは、ECMおよび脂肪細胞の特異的役割の解剖を可能にする、究極の脂肪組織機能の調節を可能にするトラクタブル実験モデルの欠如によるものである。ECM-脂肪細胞培養は、少なくとも2つの点において在来脂肪組織の生体内環境をより良くシミュレートする。まず、ECM培養は、天然のコラーゲン、エラスチン、および標準的な2D培養に存在しない他のマトリックスタンパク質を含む天然脂肪組織と同様の分子環境を提供する。第二に、2Dプラスチック上の培養は、ECM培養が排除するプラスチック^基板12の弾性低下による機械的効果を介して脂肪細胞代謝を変化させることが示されている。

脱細胞化脂肪体および他の組織からのECMの単離によって生物学的足場を設計する方法は、再生・再建医学及び組織^{工学13、14}の文脈で検討^{されている。 15、16、17、18}.我々は、ヒト内臓脂肪^組織11に由来するECMおよび脂肪細胞幹細胞(プレディポサイト)を用いて、ヒトECM-脂肪細胞培養のインビトロ3Dモデルを開発するためにこれらの方法を適応させた方法論をこれまでに公表した。本稿では、これらの方法について詳しく説明する。ヒト脂肪組織の脱細胞化手順は、細胞および脂質を除去するための機械的および酵素的処置を伴う4日間のプロセスであり、由来する組織の特性を維持する生物学的足場を残す。脱細胞化ECMは、ヒトのプレジポサイトの脂肪族分化をサポートし、脂肪細胞で再構成されると、マイクロアーキテクチャと生化学的および無傷の脂肪組織の疾患特異的特性を維持し、代謝に従事するネイティブ脂肪組織の特徴的な機能。このマトリックスは、単独で研究したり、細胞で再播種することができ、脂肪組織の細胞および細胞外の成分との間の相互作用およびクロストークの研究を可能にする。

プロトコル

脂肪組織は、制度的審査委員会の承認の下で選択的なバリヤード手術を受けているヒト被験者から調達される。

1. プレディポサイト単離と培養試薬調製

1. 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2%ウシ血清アルブミン(BSA)を調製する。フィルターは殺菌し、4 °Cで保管してください。
2. II型コラゲラーゼを調製する: 2% BSA で 2 mg/mL 1x PBS.使用直前に準備してください。
3. 赤血球(RBC)溶解液を調製する: 1.5 M NH₄Cl, 100 mM NaHCO₃, 10 mM 二ナトリウム EDTA 脱イオン水中 (DI/H₂O).4°Cで保管してください。使用直前にDI/H2 Oで10xストック溶液から1xRBCライジングソリューションを準備します。
4. 成長培地を調製する: 15% 胎児ウシ血清 (FBS), 1% 抗生物質抗粘液 (ABAM) ダルベッココの修飾イーグル培地:栄養混合 F-12 (DMEM/F12).フィルターは殺菌し、4 °Cで保管してください。
5. プレディポサイト凍結溶液を調製する:10%ジメチルスルホキシド、DMEM/F12媒体中の15%FBS。フィルターは殺菌し、4 °Cで保管してください。
6. 分化媒体を準備する: 10 mg/L トランスフェリン, 33 μM ビオチン, 0.5 μM ヒトインスリン溶液, 17 μM D-パントテン酸ヘミカルシウム塩, 100 nM デキサメタゾン, 2 nM 3,3',5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩 (T3), 1 μM シチチゾン, 540- 30-30-30-30-30-30-30-30-30-30Mイソブチル-1-メチルキサンチン (IBMX),DMEM/F12 における 1% ABAM.フィルターは殺菌し、4 °Cで保管してください。

2. ECM試薬の調製

1. 凍結緩衝液を調製する:10mMトリスベース、5mM EDTA、1%ABAM、1%フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)をDI/H2O.攪拌溶液に溶解させ、EDTAを溶解させた。HCl または NaOH.Store を 4 °C で最大 3 か月間保存して、pH を 8.0 に調整します。
2. 酵素溶液#1を準備する: 0.25% トリプシンEDTAで1%ABAM.4 °Cで最大3ヶ月間保管してください。
3. リンシングバッファー溶液を調製する: 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 7 mM Na₂HPO₄, 1.5 mM KH₂PO_4,1% ABAM, 1% PMSF を殺菌された DI/H₂O. 攪拌して塩を溶解します。HCl または NaOH を使用して pH を 8.0 に調整します。4 °Cで最大3ヶ月間保管してください。
4. 酵素溶液#2を準備する: 55 mM Na₂HPO₄, 17 mM KH₂PO₄, 4.9 mM MgSO₄∙7H₂O, 1% ABAM, DI/H₂O. ストア 4 °C で最大 3 ヶ月間.かき混ぜて塩を溶かします。使用直前に、ブタ膵臓から80 U/mLリパーゼを追加し、VI-Sタイプ。ウシ膵臓から160 U/mLデオキシリボヌクレアーゼI,II-S;ウシ膵臓から100μg/mLリボヌクレアーゼA、III-A型。
5. 調製極性溶媒抽出溶液:イソプロパノール中の1%ABAM、1%PMSF。
   注意: イソプロパノールは可燃性です;25°Cの可燃性キャビネットに保管し、可燃性廃棄物に処分します。
6. 使用直前に、70%エタノール、1%ABAM、1%PMSF をDI/H₂O. ABAM および PMSF を追加してご用意ください。
   注意: エタノールは可燃性です。25°Cの可燃性キャビネットに保管し、可燃性廃棄物に処分します。
7. ストレージ ソリューションの準備: 1% ABAM、1% PMSF 1x PBS。4 °Cで最大3ヶ月間保管してください。

3. 代謝フェノタイピング試薬の調製

1. ブドウ糖の取り込み
   1. 血清飢餓媒体を準備する:DMEM/F12、1%ABAM。フィルターを殺菌し、4°Cで保管する
   2. 使用直前に1x PBSで200nMヒトインスリン溶液を調製する。
   3. 200 nMヒトインスリン、0.1mM 2-デオキシ-D-グルコース、1μCi/ウェルデオキシD-グルコース、2-[1,2-3 H(N)]、1x PBSで調製する。使用直前に準備してください。
2. 脂肪分解
   1. PBSで希釈したイソプロテレノールを調製する:3mMの原液。アッセイ用3μMの作動濃度に希釈する。
3. オイルレッドオー染色
   1. DI/H₂O. 室温で保存中に4%ホルマリンを調製します。
   2. オイルレッドオーワーキングソリューションを準備します。3:2の比率でDI/H₂Oを有する希釈油赤O溶液(ORO)(ORO)。使用直前に準備してください。濾紙でろ過する (材料表)。

4. 脂肪組織調達

注:内臓脂肪組織(VAT)は、外科医によって手術の開始時に大きな軟骨から収集され、即時処理のために氷上の実験室に戻って輸送される。すべての人間の組織および腐食性試薬を扱う際には、完全な実験室の安全摩耗を使用し、針をリッピングしないなど、すべての人間の組織および腐食性試薬を扱う際には、普遍的な予防措置を使用する必要があります。

1. 50 mL円錐形チューブに凍結緩衝液の15-25 mLに5-10 gの無傷の付加価値税を加え、組織サンプルを浸漬します。サンプルは脱細胞化まで-80°Cで保存し、最大1ヶ月間保存します。
2. セクション 5 で説明されているように、脂肪細胞分離には VAT の別の新鮮なサンプルを使用します。

5. プレディポサイト単離

1. コラゲラーゼの20 mLに無傷の付加価値税(VAT)を2g入れ、II型、50mL円錐管内の溶液を入れます。その後、滅菌はさみを円錐管に挿入し、チューブ内の組織をミンチすることによって十分にミンチします。細かいスラリーに完全にミンチしたら、130rpmでオービタルシェーカーでコラゲナーゼ溶液中の組織をインキュベートし、60分間37°Cでインキュベートします。
2. 得られた掘削物を100μmのナイロンメッシュを通して、新鮮な円錐形チューブの上に折りたたまれたメッシュを通して1つの円錐管から掘り出し物を注ぎ込む、新鮮な50 mL円錐形チューブにフィルター処理します。この時点での掘削は、未消化線維組織の残留鎖の少量で、適度な粘度を有する黄色オレンジ色の液体でなければなりません。メッシュは、廃棄される未消化組織のより大きな部分をキャプチャする必要があります。
3. 270 x gでサンプルを10分間遠心分離し、上清を取り除き、ピペットで1x RBCライジング溶液の2 mLで細胞ペレットを再サスペンドします。
   1. 25°Cで1分間インキュベートし、15%FBS-DMEM/F12の10 mLを加えます。270 x gで10分間遠心分離。
4. 上清を取り外し、15%FBS-DMEM/F12の10 mLでピペットでセルペレットを再サスペンドします。細胞懸濁液をピペットで100mmペトリ皿に移し、37°Cと5%CO2でインキュベートし、細胞が80〜100%の合流、典型的には2〜6日に達するまでインキュベートする。2~3日ごとにメディアを変更します。
5. 細胞を取り外して洗浄します。
   1. ピペットでメディアを取り出し、4 mLのトリプシンEDTAを接着細胞に塗布します。37°Cで10分間インキュベートし、定期的にプレートをゆっくりと旋回して細胞を剥離します。
   2. 15% FBS-DMEM/F12 の 20 mL を追加し、このメディア内のデタッチされたセルをピペットで再サスペンドします。その後、新鮮な50 mL円錐形チューブに移し、遠心分離機270 x gを10分間行います。
   3. 上清を取り除き、廃棄します。細胞ペレットを1x PBSで1回洗浄し、新鮮な15%FBS-DMEM/F12の20 mLでピペットで細胞ペレットを再サスペンドします。細胞懸濁液をT-150培養フラスコに移す。
6. 培養細胞を37°Cおよび5%CO2で0.25%トリプシンEDTAの7 mLを適用し、1つのフラスコから8フラスコに拡大することにより、80-100%の合流に達すると、2〜3日ごとに細胞を分割し、拡張します。
   注:これは通常、適切な膨張を可能にし、脂肪発生電位および患者およびデポ特異的細胞代謝表現型を保持する3〜4の通路を必要とする。4-5通路を超えるプレジポサイトを通過すると、脂肪族電位の喪失につながります。
7. 上記のようにフラスコあたり7mLの8フラスコで細胞を取り外し、37°Cで10分間インキュベートします。
8. フラスコごとに15%FBS-DMEM/F12の8 mLを追加し、ピペットで取り外したセルを再サスペンドします。3つの50 mL円錐管に均等に分割された細胞懸濁液全体を移し、270 x gで10分間遠心分離機を移す。
9. 得られた細胞ペレットを15mLの円錐管に15%FBS-DMEM/F12の5mLで再スレドし、セルカウンターとトリパンブルーを使用して細胞をカウントします。
10. 270 x gで細胞懸濁液を10分間遠心分離する。次に、Preadipocyte凍結溶液中の細胞ペレットを1x 10⁶/mLの最終細胞濃度に再懸濁し、1.5mL凍結管当たりの細胞懸濁液のアリコート1mLを再懸濁する。
11. 細胞を-80°Cで1日間凍結保存する。その後、3〜6ヶ月間の長期保存のために液体窒素に凍結膜を移します。
12. 使用準備ができたら、37°Cの水浴で1つの凍結を3〜5分間解凍し、15%FBS-DMEM/F12の20 mLで細胞を再サスペンドし、270 x gで10分間遠心分離します。
13. 15%FBS-DMEM/F12の20 mLで細胞ペレットを再懸濁し、ピペットを単一のT-150フラスコに入れ、37°Cと5%CO2で2〜3日間で80%の合流に成長します。
14. ステップ 5.6 で前述したように、フラスコあたり 0.25% トリプシン EDTA の 7 mL のセルをデタッチします。15% FBS-DMEM/F12 で mL あたり 300 万個のセル (つまり、20 μL あたり 6 x 10⁴セル) で再サスペンドし、以下の概説として使用します (セクション 7、ステップ 7.4)。

6. 脂肪組織ECM調製

1. 1日目:凍結解凍と酵素消化#1
   1. 凍結前に凍結した凍結(ステップ4.2)凍結緩衝液に貯蔵されたVATサンプルは、予熱水浴中の-80°Cから37°Cまでの50mL円錐形チューブで、穏やかな周期的な手動攪拌で20分間インキュベートする。解凍したら、-80°Cに戻し、20分間インキュベートします。
   2. 滅菌鉗子を使用して、酵素溶液#1の15-25 mLを含む新鮮な50 mL円錐形チューブにVATサンプルを移し、VATサンプルが完全に浸漬されていることを確認します。その後、軌道シェーカー(130 rpm、37°)で一晩インキュベートします。
2. 2日目:酵素消化#2
   1. 軌道シェーカー(130 rpm、37°、各洗浄)でリンス緩衝液の15〜25 mLでサンプルを3x洗浄します。各洗浄後にリンシングバッファー溶液を注ぎます。
   2. 15-25 mL の酵素溶液 #2を含む新鮮な50 mL円錐形チューブにサンプルを移し、軌道シェーカー(130 rpm、37°C、一晩)でインキュベートします。
3. 3日目:脂質化
   1. 軌道シェーカー(130 rpm、37°、各洗浄)でリンス緩衝液の15〜25 mLでサンプルを3x洗浄します。各洗浄後にリンシングバッファー溶液を注ぎます。
   2. 極性溶媒抽出液の15-25 mLを含む新鮮な50 mL円錐形チューブにサンプルを移し、軌道シェーカー(130 rpm、25°C、一晩)でインキュベートします。このステップの後、脂質の大部分を除去し、サンプルは白色または半透明である必要があります。
      注意:極性溶媒抽出溶液は可燃性であり、25°Cで保存して使用する必要があります。
4. 4日目:洗浄と保管
   1. リンシングバッファー溶液の15-25 mLを含む新鮮な50 mL円錐形チューブにサンプルを転送します。眼窩シェーカーでサンプルを3x洗浄する(130 rpm、37°、各洗浄20分)。
   2. 眼窩シェーカー(130rpm、37°、各洗浄20分)に15-25 mLのエタノールでサンプルを3x洗浄し、各洗浄後に70%エタノール溶液を流し込みます。
   3. 眼窩シェーカー(130 rpm、37°、各洗浄で20分)の貯蔵液でサンプルを1回洗浄します。
   4. 滅菌鉗子を使用して、貯蔵溶液の15-25 mLを含む新鮮な50 mL円錐形管にサンプルを移す。サンプルを完全に没入するのに十分なストレージ・ソリューションが使用されていることを確認します。4 °Cで最大1ヶ月間保管してください。

7. ECM脂肪細胞調製

1. 保存されたECM断片を滅菌鉗子を使用して24ウェルプレートの個々のウェルに移します。重複または三重を含む計画された下流アッセイに必要な数のECM断片(例えば、グルコース取り込みまたは脂肪分解、下記参照)に追加します。軌道シェーカー(130rpm、37°、各洗浄で20分)で500μLのエタノール3xで洗浄します。
2. 軌道シェーカー(130rpm、37°、各洗浄で20分)で滅菌1x PBSで3x洗浄することによりECMを補温する。
3. 滅菌ハサミを使用して、100 mgの断片にECMをカットし、重量を量る。滅菌鉗子を使用して、24ウェルプレートの各ウェルに1つの100 mgの断片を置きます。25°Cで15分間インキュベートし、余分なPBSが断片から押し出せるようにする。ピペットで余分なPBSを慎重に取り除きます。
4. 各100mg ECM断片を20μLのプレディポサイト細胞懸濁液で播種する(mLあたり300万細胞、20μLあたり6 x¹⁰⁴細胞、15%FBS-DMEM/F12、ステップ5.10から)。ECMにピペットの先端を置き、細胞懸濁液をマトリックスの中心にそっと排出することで、細胞を直接ECMにピペットし、細胞懸濁液がオーバーフローせず、井戸の底に終わるのを注意してください。
   1. ピペットチップが配置されているECMからセルサスペンションがオーバーフローしている場合は、その位置から先端を取り外し、ECM内の別の場所に挿入します。37°Cで40分間播種したECMをインキュベートする。
      注: qrtPCR の RNA 抽出の場合、100 μL で 3 x 10 5 個^のセルを持つ各 500 mg ECM フラグメントをシードします (mL あたり 300 万セル、つまり、100 μL あたり 3 x 10⁵セル、15% FBS-DMEM/F12)。
5. 24ウェルプレートの各ウェルに500μLの成長媒体を充填し、播種されたECM断片をカバーします。培養は37°Cで、5%CO2で72時間。
6. 72時間後、15%FBS-DMEM/F12を注意深く吸引し、プレートをわずかに傾けてメディアが断片の下にプールできるようにし、ピペットチップをECMフラグメントに隣接させて邪魔することなく配置します。吸引後、分化媒体の500°Lを追加し、同様の技術を使用して2〜3日ごとにメディアを交換し、合計14日間培養します。
   1. 光顕微鏡を使用して分化をチェックする:細胞は脂質を蓄積し、色が茶色に変わり、より球状になります。
      注:種子マトリックスは、代謝試験(例えば、グルコース取り込みアッセイ、脂肪分解アッセイ、ORO)、組織学または免疫組織化学(IHC)、または標準組織イメージングに使用することができる。固定組織ORO染色およびイメージングの場合、液体窒素中のECM脂肪細胞サンプルを凍結する。

8. 代謝フェノタイピング

1. 走査電顕
   1. ソレンセンのリン酸緩衝液中の2.5%グルタルアルデヒド中のサンプルを25°Cで12時間固定し、ソレンセンのリン酸緩衝液中の1%の四酸化オスミウム中の四酸化オスミウムを1時間4°Cで1時間固定する。
   2. エタノール中のサンプルを連続脱水します。ヘキサメチルジサリンで洗浄し、空気乾燥した。次に、コロイド黒鉛を用いた走査型電子顕微鏡スタブに取り付けます。ドライ、およびゴールドのスパッタコート。
   3. 走査型電子顕微鏡で画像を撮像します。
2. オイルレッドオー染色
   1. ライブティッシュ:オイルレッドオー溶液
      1. ピペットで井戸から慎重にメディアを吸引。その後、井戸あたり1x PBSの500 μLで1回サンプルを洗浄します。
      2. 25°Cで滅菌脱_イオンH2Oで200μLの4%ホルマリンのサンプルを15分間固定し、ピペットでアサーピットホルマリンを吸引し、サンプルを1x PBS(500°L各洗浄)で2回洗浄します。
      3. ピペットで25°Cで60%イソプロパノールサンプル200μLを25°Cで加えます。
      4. オイルレッドオー加工液でサンプルを25°Cで5分間染色し、ピペットで油性レッドオーを吸引し、サンプル3xを1x PBS(500°L各洗浄)で洗浄します。次に光学顕微鏡で画像化する。
   2. 固定ティッシュ:オイルレッドオーステインキット
      1. 最適な切断温度(OCT)化合物およびクライオスタット上のセクション(5μm)でのフラッシュ凍結ECM脂肪細胞サンプル。
      2. スライドをDI/H₂Oの85%プロピレングリコールに2分間置き、6分間60°Cのオロ染色にスライドを置き、DI/H₂Oで85%プロピレングリコールにステリドを入れ、DI/H₂Oでスライドを2回すすぐります。
      3. オイルレッドオー染色キットの修正マイヤーのヘマトキシリンにスライドを1分間置き、水道水でスライドを2回すすいで下します。DI/H₂Oで2回スライドをリンスします。
      4. 水性取り付け媒体と画像を顕微鏡に使用してカバースリップを取り付けます。
   3. qrtPCR 用 ECM からの RNA 抽出
      注:RNA収率を最大化するには、100μLで3 x 10⁵のプレディポサイトで播種された500 mgのECMフラグメントを使用し、ウェルあたりの分化媒体の3 mLの6ウェルプレートで上記のように区別します。
      1. 分化したら、滅菌鉗子を用いて個々のECM-脂肪細胞試料を氷上の50mL円錐管に移す。
      2. 500°LのバッファRLTで空の井戸を洗います。一致するECM脂肪細胞サンプルを持つ50 mL円錐管にバッファRLTを追加します。
      3. 滅菌ハサミを使用して、50mL円錐管内の各ECM脂肪細胞サンプルを細かくミンチし、チューブを氷上に保持したまま、組織をミンチするために円錐管にハサミを挿入する。
      4. 円錐形のチューブを-80°Cから37°3xまで完全に凍結解凍します。
      5. 500 x gと 4 °C で円錐形チューブを 10 分間分離します。
      6. ピペットで上清を慎重に取り除き、繊維組織RNA抽出キット(材料表)を使用してRNA抽出に使用します。
3. グルコース取り込みアッセイ
   1. 上述したように24ウェルプレート中の分化培地中の0.5mLの分化培地中の100mg ECM断片中の6x 10⁴プラジポサイトを区別する(セクション5)。
   2. 分化の14日後、培地を取り出し、ECM脂肪細胞を1x PBSで1回洗浄します。0.5 mL/ウェル血清飢餓培地と培養物を37°C、5%CO2を12時間加えます。
   3. 培地を取り出し、細胞を1x PBSで2回洗浄します。PBSに0.5 mL/ウェル2%BSAを加え、37°Cで培養し、2時間5%CO2を加えます。
   4. 細胞を1x PBSで1回洗浄し、200nMインスリンの有無にかかわらず0.5 mL/well 1x PBSを加え、37°Cで40分間インキュベートします。
   5. アサイツ1x PBS、0.1 mM 2-デオキシD-グルコース、2μCi/mLデオキシD-グルコース、2-[1,2-3 H(N)]、200nMインスリンの有無にかかわらず0.5 mL/ウェル1X PBSを加え、37°Cおよび5%CO2でインキュベートし、40分間の取り扱いおよび5%CO2を使用する。放射性試薬および廃棄物は、現地の機関の規制法によって義務付けられている。
   6. ピペットで培地を取り出し、細胞3xを1x PBSで洗浄します。DI/H₂Oに420μLの1%SDS溶液を加え、活発なピペットで細胞を溶解します。25°Cを10分間インキュベートする。
   7. ブラッドフォードタンパク質アッセイのために各ウェルから5 μLを収集します。残りの細胞リサートの400μLをシンチレーションバイアル中のシンチレーション液の2mLに移す。シンチレーションカウンター^で3H-2DG活性をカウントします。タンパク質 mg/mL に正規化された 1 分あたりのカウント数としてデータを分析します。
4. 脂肪分解アッセイ
   1. 上記のように24ウェルプレート中のヒト分化培地の0.5mLで100mg ECM断片中の6x 10⁴のプレディポサイトを区別する(セクション5)。
   2. 分化の14日後、培地を除去し、温かい1x PBSで細胞を2回洗浄する。3μMイソプロテレノールの有無にかかわらず血清飢餓培地(インスリンなし)を0.5mL加え、脂肪細胞を37°C、72時間5%CO2で培養します。
   3. 培養上清を収集し、アッセイの準備ができるまで-80°Cで保存することができる。ECMをマイクロ遠心管で回収し、データの正規化のためのDNA定量を行います。
   4. 各上清のピペット2μLを96ウェルマイクロプレートに入れた。トリグリセリド決定キットに用意されているブランク(_蒸留H2O)およびグリセロール標準溶液用のウェルを予約します。
   5. トリグリセリド決定キットから270μLの無料グリセロール試薬を各ウェルに加え、ピペットを混ぜます。37°Cで5分間インキュベートプレート。
   6. マイクロプレート分光光度計で540nmで吸光度を測定します。
   7. グリセロールの濃度を計算し、ECMからのDNAで正規化します。

結果

脂肪組織ECMの調製、プレディポサイトによる播種、および成熟脂肪細胞への体外分化により、プロトコル全体の進行を視覚的に評価できる組織の明らかな逐次形態変化をもたらす(図1).ECMの播種に用いられるプレディポサイトは、別々のVATサンプルからのコラゲネアゼ消化を用いて単離される(図2)。処理の各段階におけるECM...

ディスカッション

ECM-脂肪細胞培養モデルは、ECMおよび細胞の個々の役割を究極の組織表現型のディクテーションで解剖するための貴重なツールを提供します。ECM分離プロトコルは非常に再現可能であるが、脱細胞化プロセスにおける変動性が観察され得る。3日目の脂質異常ステップは、プロトコルの重要なポイントです。一晩の抽出の完了時に、マトリックスの脱脂は、極性溶媒溶液が黄色に変わるように?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	Cat#25200056
1.5 mL cryovial tube	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#02-682-557
10% Neutral Buffered Formalin	VWR International LLC., Radnor, PA, USA	Cat#89370-094
100 µm nylon mesh filter	Corning Inc., Corning, NY, USA	Cat#352360
2-Deoxy-D-glucose	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#D8375
2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#T6397
24-well tissue culture plates	VWR International LLC., Radnor, PA, USA	Cat#10861-700
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#I5879
96-well tissue culture plates	VWR International LLC., Radnor, PA, USA	Cat#10861-666
Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)	Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	Cat#15240062
Biotin	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#B4639
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#A8806
Buffer RLT	Qiagen, Hilden, Germany	Cat#79216
Ciglitizone	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#C3974
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA	Cat#NET328A250UC
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#D4513
Dexamethasone	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#D4902
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#BP231	Flammable, caustic
Disodium EDTA	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#BP118
D-pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#21210
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12	Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#11320033
Ethanol	Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA	Cat#DSP-MD.43	Flammable
EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek	VWR International LLC., Radnor, PA, USA	Cat#10027-446
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	Cat#10437028
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#G5882	Caustic
Hexamethyldisalizane	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#440191	Flammable, caustic
Human insulin solution	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#I9278
Isopropanol	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#A415	Flammable
Isoproterenol	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#I5627	Flammable
KCl	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#S25484
KH2PO4	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#P5655
Lipase from porcine pancreas, type VI-S	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#L0382
MgSO4*7H2O	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#230391
Na2HPO4	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#S5136
NaCl	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#S3014
NaHCO3	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#S233
NH4Cl	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#A661
Optimal cutting temperature (OCT) compound	Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK	Cat# AGR1180
Oil Red-O Solution (ORO)	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#O1391
Oil Red-O Stain Kit	American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA	Cat#KTORO-G
Osmium tetroxide	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#201030	Caustic
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#93482	Caustic
Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#SH3025601
Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#R5125
RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit	Qiagen, Hilden, Germany	Cat#74704
Scintillation Fluid	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#SX18
Scintillation Counter
Scissors, forceps, sterile
Sorensen's phosphate buffer	Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ	CAS #: 10049-21-5
T-150 culture flask	VWR International LLC., Radnor, PA, USA	Cat#10062-864
TaqMan Gene Expression Master Mix	ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#4369016
Temperature-controlled orbital shaker
Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer	Benchmark Scientific	Cat#D1030
Transferrin	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#T3309
Triglyceride Determination Kit	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#TR0100
Trypan blue stain, 0.4%	VWR International LLC., Radnor, PA, USA	Cat#10027-446
Type II collagenase	Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	Cat#17101015
Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#WHA5201150