JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous décrivons un système de culture in vitro de matrice-adipocyte extracellulaire humain 3D qui permet la dissection des rôles de la matrice et des adipocytes en contribuant au phénotype métabolique de tissu adipeux.

Résumé

La matrice extracellulaire (ECM) joue un rôle central dans la régulation de l'homéostasie tissulaire, s'engageant dans le crosstalk avec les cellules et régulant de multiples aspects de la fonction cellulaire. L'ECM joue un rôle particulièrement important dans la fonction de tissu adipeux dans l'obésité, et des changements dans le dépôt et la composition d'ECM de tissu adipeux sont associés à la maladie métabolique chez les souris et les humains. Les modèles in vitro traitables qui permettent la dissection des rôles de l'ECM et des cellules en contribuant au phénotype global de tissu sont clairsemés. Nous décrivons un nouveau modèle in vitro 3D de la culture humaine d'ECM-adipocyte qui permet l'étude des rôles spécifiques de l'ECM et des adipocytes en régulant le phénotype métabolique de tissu adipeux. Le tissu adipeux humain est décellularisé pour isoler l'ECM, qui est ensuite repeuplé avec des prédipocytes qui sont ensuite différenciés dans l'ECM en adipocytes matures. Cette méthode crée des constructions ECM-adipocyte qui sont métaboliquement actives et conservent des caractéristiques des tissus et des patients dont ils sont dérivés. Nous avons utilisé ce système pour démontrer la maladie spécifique ECM-adipocyte crosstalk dans le tissu adipeux humain. Ce modèle de culture fournit un outil pour disséquer les rôles de l'ECM et des adipocytes en contribuant au phénotype métabolique global de tissu adipeux et permet l'étude du rôle de l'ECM en réglant l'homéostasie de tissu adipeux.

Introduction

La matrice extracellulaire (ECM) fournit non seulement un échafaudage mécanique pour les tissus, mais s'engage également dans le crosstalk complexe avec des cellules qui résident en elle, régulant divers processus nécessaires pour l'homéostasie tissulaire, y compris la prolifération cellulaire, différenciation, signalisation et métabolisme1. Tandis que l'ECM sain joue un rôle essentiel le maintien de la fonction normale de tissu, l'ECM dysfonctionnel a été impliqué dans les maladies multiples2.

Le tissu adipeux joue un rôle important dans la pathogénie de la maladie métabolique. L'obésité est associée à l'hypertrophie excessive d'adipocyte et à l'hypoxie cellulaire, aux défauts dans le métabolisme cellulaire d'adipocyte, et au reticulum et à l'inflammation d'endoplasmique de tissu adipeux. Bien que mal compris, ces processus complexes conspirent pour altérer la capacité de tamponde de nutriment de tissu adipeux, menant au débordement nutritif du tissu adipeux, à la toxicité dans les tissus multiples, et à la maladie métabolique systémique3,4 ,5. La séquence des événements et des mécanismes spécifiques qui sous-tendent l'échec de tissu adipeux sont mal compris, mais des altérations dans l'ECM de tissu adipeux ont été impliquées. La composition d'ECM est modifiée dans le tissu adipeux dans l'obésité humaine et murine, avec le dépôt accru de protéine d'ECM avec les différences biochimiques et structurales qualitatives dans le tissu adipeux ECM lié à la maladie métabolique humaine, y compris diabète de type 2 et hyperlipidémie6,7,8,9,10,11.

En dépit de ces observations, le rôle de l'ECM de tissu adipeux en médiatisant le dysfonctionnement adipeux de tissu n'est pas bien défini. Cela est dû en partie à un manque de modèles expérimentaux traitables qui permettent la dissection des rôles spécifiques de l'ECM et des adipocytes dans la régulation de la fonction ultime du tissu adipeux. La culture eCM-adipocyte simule mieux l'environnement in vivo du tissu adipeux indigène à au moins deux égards. Tout d'abord, la culture ECM fournit un environnement moléculaire similaire au tissu adipeux indigène, y compris les collagènes indigènes, les élastines et autres protéines matricielles absentes dans la culture 2D standard. Deuxièmement, la culture sur le plastique 2D a été montré pour modifier le métabolisme des adipocytes par des effets mécaniques en raison de l'élasticité diminuée du substrat plastique12, qui ECM-culture élimine.

Les méthodes pour concevoir des échafaudages biologiques par l'isolement de l'ECM de l'adipose décellularisé et d'autres tissus ont été étudiées dans le contexte de la médecine régénératrice et reconstructive et de l'ingénierie tissulaire13,14, 15,16,17,18. Nous avons déjà publié une méthodologie dans laquelle nous avons adapté ces méthodes pour développer un modèle 3D in vitro de la culture humaine ECM-adipocyte, en utilisant des cellules souches ECM et adipocytes (préadipocytes) dérivés de tissus adipeux viscéraux humains11. Dans le présent article, nous décrivons ces méthodes en détail. La procédure de décellularisation du tissu adipeux humain est un processus de quatre jours qui implique des traitements mécaniques et enzymatiques pour enlever les cellules et les lipides, laissant un échafaudage biologique qui maintient les caractéristiques du tissu à partir duquel il est dérivé. L'ECM décellularisé soutient la différenciation adipogénique des préadipocytes humains, et lorsqu'il est reconstitué avec des adipocytes, maintient la microarchitecture et les caractéristiques biochimiques et spécifiques à la maladie du tissu adipeux intact et s'engage dans le métabolisme fonctions caractéristiques du tissu adipeux indigène. Cette matrice peut être étudiée seule ou réensemencée avec des cellules, permettant l'étude des interactions et du croisement entre les composants cellulaires et extra-cellulaires du tissu adipeux.

Protocole

Les tissus adipeux sont achetés des sujets humains subissant la chirurgie bariatrique élective sous l'approbation institutionnelle de conseil d'examen.

1. Isolement de préadipocyte et préparation de réactif de culture

  1. Préparer 2% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans une solution saline tamponnée de phosphate 1x (PBS). Filtrer la stérilisation et les conserver à 4 oC.
  2. Préparer la collagène de type II : 2 mg/mL dans 2 % de BSA en 1x PBS. Préparer immédiatement avant l'utilisation.
  3. Préparer la solution de lysing de globule rouge (RBC) : 1,5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3, 10 mM disodium EDTA dans de l'eau déionisée (DI/H2O). Conserver à 4 oC. Préparer 1x SOLUTION lysing RBC à partir de la solution d'actions 10x dans DI/H2O immédiatement avant utilisation.
  4. Préparer les médias de croissance : 15% de sérum bovin foetal (FBS), 1% de solution antibiotique-antimycotique (ABAM) dans le moyen modifié d'aigle de Dulbecco : mélange nutritif F-12 (DMEM/F12). Filtrer la stérilisation et les conserver à 4 oC.
  5. Préparer la solution de congélation préadipocyte : 10 % de sulfoxide de diméthyle, 15 % de FBS dans les médias DMEM/F12. Filtrer la stérilisation et les conserver à 4 oC.
  6. Préparer la différenciation Des médias : 10 mg/L de transplasson, 33 m de biotine, 0,5 M de solution d'insuline humaine, 17 M D-pantothic acid hemicalcium salt, 100 nM dexamethasone, 2 nM 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3), 1 'M ciglitizone, 540 'M 3- Isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX), 1% ABAM en DMEM/F12. Filtrer la stérilisation et les conserver à 4 oC.

2. Préparation de réactif d'ECM

  1. Préparer la solution tampon de congélation : base Tris de 10 mM, 5 mM EDTA, 1 % ABAM, 1 % de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) dans la solution DI/H2O. Stir pour dissoudre l'EDTA. Ajuster le pH à 8,0 avec HCl ou NaOH.Store à 4 oC pendant une période pouvant aller jusqu'à 3 mois.
  2. Préparer la solution enzymatique #1: 1% ABAM en 0,25% trypsin-EDTA. Conserver à 4 oC jusqu'à 3 mois.
  3. Préparer rinçant la solution tampon : 137 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 7 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 1 % ABAM, 1 % PMSF en DI stérilisé/H2O. Remuer pour dissoudre les sels. Ajuster le pH à 8,0 avec HCl ou NaOH. Conserver à 4 oC jusqu'à 3 mois.
  4. Préparer la solution enzymatique #2 : 55 mM Na2HPO4, 17 mM KH2PO4, 4,9 mM MgSO47H2O, 1 % ABAM, 1 % PMSF en DI/H2O. Store 4 oC pendant 3 mois. Remuer pour dissoudre les sels. Immédiatement avant l'utilisation, ajouter 80 lipase U/mL du pancréas porcin, type VI-S; 160 U/mL deoxyribonuclease I du pancréas bovin, type II-S; et 100 ribonuclease A g/mL du pancréas bovin, type III-A.
  5. Préparer la solution d'extraction de solvantpolaire polaire : 1 % ABAM, 1 % PMSF en isopropanol.
    CAUTION: L'isopropanol est inflammable; conserver dans une armoire inflammable à 25 oC et les éliminer dans des déchets inflammables.
  6. Préparer 70% d'éthanol, 1% d'ABAM, 1% de PMSF en DI/H2O. Ajouter ABAM et PMSF juste avant l'utilisation.
    CAUTION: L'éthanol est inflammable; conserver dans une armoire inflammable à 25 oC et les éliminer dans des déchets inflammables.
  7. Préparer la solution de stockage: 1% ABAM, 1% PMSF en 1x PBS. Conserver à 4 oC jusqu'à 3 mois.

3. Préparation métabolique de réactif de phénotypage

  1. Absorption de glucose
    1. Préparer Serum Starvation Media: DMEM/F12, 1% ABAM. Filtrer la stérilisation et le stockage à 4 oC
    2. Préparer la solution d'insuline humaine de 200 nM en 1x PBS immédiatement avant utilisation.
    3. Préparer 200 nM d'insuline humaine, 0,1 mM 2-Deoxy-D-glucose, 1 'Ci/well Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H(N)]-, en 1x PBS. Préparer immédiatement avant l'utilisation.
  2. Lipolyse
    1. Préparer Isoproterenol dilué dans PBS: 3 mM solution de stock. Diluer à la concentration de travail de 3 M pour l'astodonte.
  3. Pétrole Red-O Staining
    1. Préparer 4 % de formaline dans le dI/H2O. Magasinà à température ambiante.
    2. Préparer oil Red-O Solution de travail. Diluer Oil Red-O Solution (ORO) avec DI/H2O dans un ratio de 3:2 (ORO:DI/H2O). Préparer immédiatement avant l'utilisation. Filtrer à travers le papier filtre (Tableau des matériaux).

4. Approvisionnement en tissus adipeux

REMARQUE : Le tissu adipeux viscéral (TVA) est prélevé dans le plus grand omentum au début de l'opération par le chirurgien et transporté au laboratoire sur glace pour un traitement immédiat. Des précautions universelles devraient être utilisées lors de la manipulation de tous les tissus humains et des réactifs caustiques, y compris l'exécution de tout le travail dans une hotte à débit laminaire, en utilisant l'usure complète de sécurité de laboratoire, et pas de recapping des aiguilles.

  1. Ajouter 5-10 g de TVA intacte à 15-25 ml de solution tampon de congélation dans un tube conique de 50 ml pour immerger l'échantillon de tissu. Conserver les échantillons à -80 oC jusqu'à la décellularisation, jusqu'à 1 mois.
  2. Utiliser un échantillon distinct de TVA pour l'isolement des préadipocytes tel que décrit à l'article 5.

5. Isolement préadipocyte

  1. Placer 2 g de TVA intacte dans 20 ml de collagène, type II, solution dans un tube conique de 50 ml. Ensuite, hacher soigneusement en insérant des ciseaux stériles dans le tube conique et en hassant le tissu dans le tube. Une fois entièrement haché à une lisier fin, incuber le tissu dans la solution de collagène sur un shaker orbital à 130 tr/min et 37 oC pendant 60 min.
  2. Filtrer le digestat résultant à travers un maillage en nylon de 100 m dans un tube conique frais de 50 ml en versant le digestat d'un tube conique à travers un morceau de maille plié sur le dessus d'un tube conique frais. Le digestat à ce point devrait être un liquide jaune-orange avec la viscosité modérée, avec de petites quantités de brins résiduels de tissu fibreux non digéré. Le maillage doit capturer de plus gros morceaux de tissu non digéré, qui sont jetés.
  3. Centrifuger l'échantillon à 270 x g pendant 10 min. Retirez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire dans 2 ml de solution de lysing RBC 1x avec une pipette.
    1. Incuber 1 min à 25 oC, puis ajouter 10 ml de 15 % de FBS-DMEM/F12. Centrifugeuse à 270 x g pendant 10 min.
  4. Retirez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire en 10 ml de 15 % FBS-DMEM/F12 à l'effile. Transférer la suspension cellulaire à 100 mm Petri plat avec une pipette et incuber à 37 oC et 5% CO2, jusqu'à ce que les cellules atteignent 80-100% confluence, généralement 2-6 jours. Changez les médias tous les 2-3 jours.
  5. Détachez et lavez les cellules.
    1. Retirez les supports à l'eau avec une pipette et appliquez 4 ml de trypsine-EDTA de 0,25 % sur les cellules adhérentes. Incuber à 37 oC pendant 10 min, en faisant tourbillonner périodiquement la plaque doucement pour détacher les cellules.
    2. Ajouter 20 ml de 15% FBS-DMEM/F12 et resuspendre les cellules détachées dans ce support avec une pipette. Ensuite, transférer dans un tube conique frais de 50 ml et une centrifugeuse de 270 x g pendant 10 min.
    3. Retirer le supernatant et jeter. Laver la pastille cellulaire une fois en 1x PBS, puis resuspendre la pastille cellulaire dans 20 ml de frais 15% FBS-DMEM/F12 avec une pipette. Transférer la suspension de la cellule dans un flacon de culture T-150.
  6. Cellules de culture à 37 oC et 5 % CO2. Divisez et dilatez les cellules tous les 2-3 jours lorsqu'elles atteignent 80-100% de confluence en appliquant 7 ml de trypsin-EDTA de 0,25%, passant d'un flacon à 8 flacons.
    REMARQUE : Ceci exige typiquement 3-4 passages, qui permet l'expansion appropriée et retient le potentiel adipogenic et les phénotypes métaboliques cellulaires patient- et de dépôt-spécifiques. La passage des préadipocytes au-delà de 4-5 passages conduit à la perte du potentiel adipogénique.
  7. Détachez les cellules dans 8 flacons avec 7 ml de 0,25 % de trypsine-EDTA par flacon tel que décrit ci-dessus, et incubez à 37 oC pendant 10 min.
  8. Ajouter 8 mL de 15 % de FBS-DMEM/F12 par flacon et resuspendre les cellules détachées à l'abri d'une pipette. Transférer la suspension cellulaire entière divisée uniformément en trois tubes coniques de 50 ml et centrifugeuse à 270 x g pendant 10 min.
  9. Resuspendre les granulés de cellules résultants en 5 ml de 15% FBS-DMEM/F12 dans un tube conique de 15 ml et compter les cellules à l'aide du compteur cellulaire et du bleu Trypan.
  10. Centrifugelant la suspension cellulaire à 270 x g pendant 10 min. Puis resuspendre la pastille cellulaire dans la solution de congélation préadipocyte à une concentration cellulaire finale de 1 x 106/mL, et aliquot 1 ml de suspension cellulaire par tube cryovial de 1,5 ml.
  11. Conserver les cellules dans des cryovials pendant 1 jour à -80 oC. Transférer ensuite les cryovials à l'azote liquide pour le stockage à long terme pendant 3-6 mois.
  12. Lorsqu'il est prêt à l'emploi, décongeler un cryovial dans un bain d'eau de 37 oC pendant 3 à 5 min. Resuspendre les cellules en 20 ml de 15 % FBS-DMEM/F12, et centrifugeuse à 270 x g pendant 10 min.
  13. Resuspendre la pastille cellulaire en 20 ml de 15 % FBS-DMEM/F12, pipette en un seul flacon T-150, puis passer à 80 % de confluence sur 2-3 jours à 37 oC et 5 % de CO2.
  14. Détachez les cellules avec 7 ml de trypsine-EDTA par flacon de 0,25 % comme décrit ci-dessus à l'étape 5.6. Resuspendre à 3 millions de cellules par mL (c.-à-d. 6 x 104 cellules par 20 L) dans 15 % de FBS-DMEM/F12, et utiliser comme indiqué ci-dessous (section 7, étape 7.4).

6. Préparation d'ECM de tissu adipose

  1. Jour 1 : Gel-dégel et digestion enzymatique #1
    1. Gel-dégel préalablement congelé (étape 4.2) Échantillons de TVA stockés dans la solution tampon de congélation dans des tubes coniques de 50 ml de -80 à 37 oC dans un bain d'eau préchauffé, incubant 20 min avec une douce agitation manuelle périodique. Une fois décongelé, transférer à -80 oC et couver 20 min. Répéter le gel-dégel 3x, pour terminer par la décongélation des échantillons dans un bain d'eau de 37 oC.
    2. À l'aide de forceps stériles, transférer les échantillons de TVA sur des tubes coniques frais de 50 ml contenant 15 à 25 ml de solution enzymatique #1, en veillant à ce que les échantillons de TVA soient entièrement immergés. Puis incuber toute la nuit sur un shaker orbital (130 tr/min, 37 oC).
  2. Jour 2: La digestion enzymatique #2
    1. Laver les échantillons 3x avec 15-25 ml de solution tampon de rinçage sur un shaker orbital (130 tr/min, 37 oC, 20 min par lavage). Verser la solution tampon de rinçant après chaque lavage.
    2. Transférer les échantillons dans des tubes coniques frais de 50 ml contenant 15 à 25 ml de solution enzymatique #2 et incuber sur un shaker orbital (130 tr/min, 37 oC, pendant la nuit).
  3. Jour 3: Délipidation
    1. Laver les échantillons 3x avec 15-25 ml de solution tampon de rinçage sur un shaker orbital (130 tr/min, 37 oC, 20 min par lavage). Verser la solution tampon de rinçant après chaque lavage.
    2. Transférer les échantillons dans des tubes coniques frais de 50 ml contenant 15 à 25 ml de solution d'extraction de solvants polaires et couver sur un shaker orbital (130 tr/min, 25 oC, pendant la nuit). Après cette étape, la majorité des lipides doivent être enlevés, et les échantillons doivent être blancs ou translucides en couleur.
      ATTENTION : La solution d'extraction de solvants polaires est inflammable et doit être stockée et utilisée à 25 oC.
  4. Jour 4: Lavage et stockage
    1. Transférer les échantillons dans des tubes coniques frais de 50 ml contenant 15 à 25 ml de solution tampon de rinçamie. Laver les échantillons 3x sur un shaker orbital (130 tr/min, 37 oC, 20 min par lavage).
    2. Laver les échantillons 3x avec 15-25 ml d'éthanol à 70% sur un shaker orbital (130 tr/min, 37 oC, 20 min chaque lavage) en versant la solution d'éthanol à 70% après chaque lavage.
    3. Laver les échantillons une fois à l'air d'une solution de stockage sur un shaker orbital (130 tr/min, 37 oC, 20 min par lavage).
    4. À l'aide de forceps stériles, transférer les échantillons dans des tubes coniques frais de 50 ml contenant 15 à 25 ml de solution de stockage. Assurez-vous que suffisamment de solution de stockage est utilisée pour immerger complètement les échantillons. Conserver à 4 oC jusqu'à 1 mois.

7. Préparation ECM-adipocyte

  1. Transférer les fragments d'ECM stockés dans des puits individuels de plaque de 24 puits à l'aide de forceps stériles. Ajoutez autant de fragments d'ECM dans autant de puits que nécessaire pour l'action prévue en aval (p. ex., absorption de glucose ou lipolyse, voir ci-dessous), y compris les doublons ou les triplicats. Laver à l'œil de 500 oL de 70 % d'éthanol 3x sur un shaker orbital (130 tr/min, 37 oC, 20 min par lavage).
  2. Réhydrater l'ECM en lavant 3x dans le 1x PBS stérile sur un shaker orbital (130 tr/min, 37 oC, 20 min par lavage).
  3. À l'aide de ciseaux stériles, couper et peser l'ECM en fragments de 100 mg. À l'aide de forceps stériles, placez un fragment de 100 mg dans chaque puits d'une plaque de 24 puits. Incuber à 25 oC pendant 15 min pour permettre à l'excès de PBS d'extruder des fragments. Retirez soigneusement tout excès de PBS à l'eau avec une pipette.
  4. Seed chaque fragment d'ECM de 100 mg avec 20 l de suspension cellulaire préadipocyte (3 millions de cellules par mL, 6 x 104 cellules par 20 l, dans 15% FBS-DMEM/F12, à partir de l'étape 5.10). Pipette les cellules directement dans l'ECM en plaçant la pointe de pipette dans l'ECM et en expulsant doucement la suspension cellulaire au centre de la matrice, en prenant soin que la suspension cellulaire ne déborde pas et finissent sur le fond du puits.
    1. Si la suspension de la cellule déborde de l'ECM où la pointe de pipette a été placée, retirez la pointe de cet endroit et insérez ailleurs dans l'ECM. Incubate eCM enseve pendant 40 min à 37 oC.
      REMARQUE : Pour l'extraction de l'ARN pour le qrtPCR, ensemencez chaque 500 mg de fragments d'ECM avec 3 x 105 cellules dans 100 L (3 millions de cellules par mL, c'est-à-dire 3 x 105 cellules par 100 l, dans 15 % FBS-DMEM/F12).
  5. Remplissez chaque puits de la plaque de 24 puits avec 500 l de supports de croissance pour couvrir les fragments d'ECM ensedus. Culture à 37 oC et 5 % DE CO2 pour 72 h.
  6. Après 72 h, aspirez soigneusement 15% FBS-DMEM/F12, inclinant légèrement la plaque pour permettre aux médias de s'accumulant sous le fragment, et plaçant la pointe de pipette juste à côté du fragment d'ECM sans le déranger. Après l'aspiration, ajoutez 500 l de Differentiation Media, en changeant les médias tous les 2-3 jours en utilisant une technique similaire, pour une période de culture totale de 14 jours.
    1. Vérifiez la différenciation à l'aide de la microscopie légère : les cellules accumuleront des lipides, deviendront de couleur brun-jaune et de forme plus sphérique.
      REMARQUE : Les matrices ensemencées peuvent être utilisées pour des tests métaboliques (p. ex., analyse de l'absorption du glucose, analyse de lipolyse, ORO), histologie ou immunohistochimie (IHC), ou imagerie tissulaire standard. Pour la coloration et l'imagerie des tissus fixes ORO, congelez les échantillons d'adipocyte eCM dans de l'azote liquide.

8. Phénotypage métabolique

  1. Microscopie électronique à balayage
    1. Fixer des échantillons dans 2,5 % de glutaraldéhyde dans le tampon de phosphate de Sorensen à 25 oC pendant 12 h. Postfix dans 1 % de tétroxide d'osmium dans le tampon de phosphate de Sorensen à 4 oC pour 1 h.
    2. Déshydrater en série des échantillons d'éthanol. Laver dans l'hexamethyldisalizane et sécher à l'air. Montez ensuite sur un talon de microscopie électronique à balayage avec du graphite colloïdal. Sécher, et sputter-coat avec de l'or.
    3. Capturez des images à l'échographie.
  2. Pétrole Red-O Staining
    1. Tissu vivant : Solution rouge-o d'huile
      1. Aspirez soigneusement les supports des puits à l'eau avec une pipette. Ensuite, lavez les échantillons une fois avec 500 l de 1x PBS par puits.
      2. Fixer des échantillons avec 200 'L de 4% de formaline dans la dionisation stérile H2O à 25 oC pendant 15 min. Aspirate formalin avec une pipette, laver les échantillons deux fois avec 1x PBS (500 'L chaque lavage).
      3. Ajouter 200 oL d'échantillons d'isopropanol à 25 oC pendant 5 min. Aspirate 60 % isopropanol avec une pipette.
      4. Échantillons de taches avec la solution de travail Oil Red-O à 25 oC pendant 5 min. Aspirate Oil Red-O avec une pipette, puis lavez les échantillons 3x avec 1x PBS (500 l chaque lavage). Puis l'image avec un microscope optique.
    2. Tissu fixe : Kit de tache rouge-o d'huile
      1. Échantillons d'ECM-adipocyte congelés en température de coupe optimale (OCT) composé et section (5 m) sur un cryostat.
      2. Placez la glissière dans 85 % de propylène glycol dans Le DI/H2O pendant 2 min. Placez la glissière dans la tache ORO à 60 oC pendant 6 min. Placez le lide de steh dans 85 % de propylène glycol dans DI/H2O pendant 1 min. Rincer la glissière deux fois avec DI/H2O.
      3. Placez la glissière dans l'hématoxyline de Mayer modifié du kit de coloration Oil Red-O pendant 1 min. Rincez la glissière deux fois avec de l'eau du robinet. Rincer la glissade deux fois avec DI/H2O.
      4. Montez le bordereau à l'aide d'un support de montage aqueux et de l'image au microscope.
    3. Extraction d'ARN de l'ECM pour qrtPCR
      REMARQUE : Pour maximiser le rendement de l'ARN, utilisez des fragments d'ECM de 500 mg enseisés avec 3 x 105 préadipocytes dans 100 L et différenciez comme ci-dessus dans les plaques de 6 puits dans 3 ml de média de différenciation par puits.
      1. Une fois différencié, transférer chaque échantillon individuel d'ECM-adipocyte dans un tube conique de 50 ml sur la glace à l'aide de forceps stériles.
      2. Laver le puits vide avec 500 l de Buffer RLT. Ajouter buffer RLT à 50 ml tube conique avec l'échantillon correspondant ECM-adipocyte.
      3. À l'aide de ciseaux stériles, hacher finement chaque échantillon d'Adipocyte ECM dans le tube conique de 50 ml, tout en maintenant le tube sur la glace, en insérant les ciseaux dans le tube conique pour émincer le tissu.
      4. Congeler et décongeler complètement les tubes coniques de -80 à 37 oC 3x.
      5. Centrifugeuses tubes coniques à 500 x g et 4 oC pendant 10 min.
      6. Retirez soigneusement le supernatant avec une pipette et utilisez-le pour l'extraction de l'ARN avec un kit d'extraction d'ARN tissuleux fibreux(tableau des matériaux).
  3. Test d'absorption de glucose
    1. Différencier 6 x 104 préadipocytes dans des fragments d'ECM de 100 mg dans 0,5 ml de milieu de différenciation dans des plaques de 24 puits comme décrit ci-dessus (section 5).
    2. Après 14 jours de différenciation, retirer le milieu et laver les adipocytes ECM une fois avec 1x PBS. Ajouter 0,5 mL/puits Sérum Famine Moyen et culture à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 12 h.
    3. Enlever les cellules moyennes et laver deux fois avec 1x PBS. Ajouter 0,5 mL/puits 2% BSA en PBS et culture à 37 oC et 5% de CO2 pour 2 h.
    4. Laver les cellules une fois avec 1x PBS, ajouter 0,5 mL/puits 1x PBS avec ou sans insuline de 200 nM, et couver à 37 oC pendant 40 min.
    5. Aspirate 1x PBS, ajouter 0,5 mL/puits 1X PBS avec 0,1 mM 2-deoxy-D-glucose, 2 'Ci/mL deoxy-D-glucose, 2- [1,2-3H(N)], avec ou sans 200 nM d'insuline, et incuber à 37 oC et 5% CO 2 pour 40 min. Utiliser des précautions standard pour la manipulation et l'élimination de toute l'élimination de toute l'insuline de 200 nM, et incuber à 37 oC et 5% CO2 pour 40 min. Utiliser des précautions standard pour la manipulation et l'élimination de toute l'insuline de toute la les réactifs radioactifs et les déchets, tels qu'ils sont prescrits par les lois réglementaires institutionnelles locales.
    6. Retirer le milieu à l'eau avec une pipette et laver les cellules 3x avec 1x PBS. Ajouter 420 'L de la solution SDS 1% dans DI/H2O, et lyser les cellules avec pipetage vigoureux. Incuber 25 oC pendant 10 min.
    7. Recueillir 5 L de chaque puits pour l'assay de protéine de Bradford. Transférer 400 l de lysate cellulaire restant dans 2 ml de liquide de scintillation dans une fiole de scintillation. Comptez 3activités H-2DG sur le compteur de scintillation. Analyser les données en fonction des comptes par minute normalisés en protéines, mg/mL.
  4. Test de Lipolysis
    1. Différencier 6 x 104 préadipocytes dans des fragments d'ECM de 100 mg dans 0,5 ml de milieu de différenciation humaine dans des plaques de 24 puits comme décrit ci-dessus (section 5).
    2. Après 14 jours de différenciation, retirer les cellules moyennes et laver deux fois avec 1x PBS chaud. Ajouter 0,5 ml de milieu de famine sérique (sans insuline) avec ou sans isoproténouveaul de 3 M, et adipocytes de culture à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 72 h.
    3. Recueillir les supernatants de culture, qui peuvent être stockés à -80 oC jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être mis en œue. Recueillir l'ECM dans des tubes de microcentrifuge pour la quantitation de l'ADN pour la normalisation des données.
    4. Pipet 2 'L de chaque supernatant dans une microplaque de 96 puits. Réserver les puits pour les blancs (distilléH2O) et la solution standard de glycérol fournie dans le kit de détermination du triglycéride.
    5. Ajouter 270 l de réactif sérolique libre de Triglyceride Determination Kit à chaque puits, pipette à mélanger. Incuber la plaque à 37 oC pendant 5 min.
    6. Mesurer l'absorption à 540 nm sur un spectrophotomètre microplaque.
    7. Calculez la concentration de glycérol et normalisez-la avec l'ADN de l'ECM :

figure-protocol-23211

Résultats

La préparation de l'ECM du tissu adipeux, l'ensemencement avec des préadipocytes et la différenciation in vitro en adipocytes matures entraînent des changements morphologiques séquentiaux clairs dans les tissus qui permettent l'évaluation visuelle des progrès tout au long du protocole (Figure 1) . Les prédipocytes utilisés pour semer l'ECM sont isolés à l'aide de la digestion de collagène à partir d'échantillons de TVA distincts (

Discussion

Le modèle de culture ECM-adipocyte fournit un outil précieux pour disséquer les rôles individuels de l'ECM et des cellules dans la dictation du phénotype tissulaire ultime. Le protocole d'isolement d'ECM est tout à fait reproductible, mais la variabilité dans le processus de décellularization peut être observée. L'étape de délipidation du Jour 3 est un point critique du protocole. À l'achèvement de l'extraction de nuit, la délipidation de la matrice devrait être démontrée par la solution de solvant pola...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent pas d'intérêts contradictoires.

Remerciements

Nous remercions Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa et Retha Geiss pour leur aide dans la coordination des études. SEM a été réalisé par l'Université du Michigan Microscopy et L'analyse d'images Laboratoire de recherche biomédicale Core Facility. Ce projet a été soutenu par des subventions des NIH R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot and Feasibility Grant du Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Subventions pilotes VISN 10 SPARK de l'Administration des anciens combattants ( RWO). Microscopie électronique à balayage effectuée par l'University of Michigan Microscopy and Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. La figure 4 de ce manuscrit a été publiée à l'origine dans Baker et coll., J Clin Endo Metab 2017; Mar 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, et a été reproduit avec la permission d'Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Pour obtenir la permission de réutiliser ce matériel, veuillez visiter http://global.oup.com/academic/rights.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTAGibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#25200056
1.5 mL cryovial tubeFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#02-682-557
10% Neutral Buffered FormalinVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#89370-094
100 µm nylon mesh filterCorning Inc., Corning, NY, USACat#352360
2-Deoxy-D-glucoseSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#D8375
2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#T6397
24-well tissue culture platesVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10861-700
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#I5879
96-well tissue culture platesVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10861-666
Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#15240062
BiotinSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#B4639
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#A8806
Buffer RLTQiagen, Hilden, GermanyCat#79216
CiglitizoneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#C3974
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USACat#NET328A250UC
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#D4513
DexamethasoneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#D4902
Dimethyl SulfoxideFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#BP231Flammable, caustic
Disodium EDTAFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#BP118
D-pantothenic acid hemicalcium saltSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#21210
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#11320033
EthanolDecon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USACat#DSP-MD.43Flammable
EVE Cell Counting Slides, NanoEnTekVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10027-446
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#10437028
GlutaraldehydeSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#G5882Caustic
HexamethyldisalizaneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#440191Flammable, caustic
Human insulin solutionSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#I9278
IsopropanolFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#A415Flammable
IsoproterenolSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#I5627Flammable
KClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S25484
KH2PO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#P5655
Lipase from porcine pancreas, type VI-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#L0382
MgSO4*7H2OSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#230391
Na2HPO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S5136
NaClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S3014
NaHCO3Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#S233
NH4ClFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#A661
Optimal cutting temperature (OCT) compoundAgar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UKCat# AGR1180
Oil Red-O Solution (ORO)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#O1391
Oil Red-O Stain KitAmerican Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USACat#KTORO-G
Osmium tetroxideSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#201030Caustic
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#93482Caustic
Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#SH3025601
Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-ASigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#R5125
RNAEasy Fibrous Tissue MiniKitQiagen, Hilden, GermanyCat#74704
Scintillation FluidFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#SX18
Scintillation Counter
Scissors, forceps, sterile
Sorensen's phosphate bufferThomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJCAS #: 10049-21-5
T-150 culture flaskVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10062-864
TaqMan Gene Expression Master MixThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#4369016
Temperature-controlled orbital shaker
Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube HomogenizerBenchmark ScientificCat#D1030
TransferrinSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#T3309
Triglyceride Determination KitSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#TR0100
Trypan blue stain, 0.4%VWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10027-446
Type II collagenaseGibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#17101015
Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mmSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#WHA5201150

Références

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
  2. Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
  3. Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
  4. O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
  5. Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
  6. Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
  7. Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
  8. Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
  9. Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
  10. Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
  11. Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
  12. Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
  13. Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
  14. Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
  15. Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
  16. Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
  17. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  18. Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
  19. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
  20. Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
  21. Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
  22. O'Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
  23. Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
  24. Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Bioing nierieNum ro 153adipocytetissu adipeuxmatrice extracellulairediab teabsorption de glucoseob sit

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.