JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем 3D человека внеклеточной матрицы-адипоцитов в пробирке культуры системы, которая позволяет вскрытие ролей матрицы и адипоцитов в содействии жировой ткани метаболического фенотипа.

Аннотация

Внеклеточной матрицы (ECM) играет центральную роль в регулировании ткани гомеостаза, участие в перекрестном разговоре с клетками и регулирования нескольких аспектов клеточной функции. ECM играет особенно важную роль в функции жировой ткани при ожирении, а изменения в жировой ткани ECM осаждения и состава связаны с метаболическимзаболеваниеи у мышей и людей. Tractable in vitro модели, которые позволяют вскрытие ролей ECM и клеток в содействии глобальной ткани фенотип редки. Мы описываем новую 3D-модель eCM-адипоцита человека, которая позволяет изучать конкретные роли ECM и адипоцитов в регулировании жировой ткани метаболического фенотипа. Ужировая ткань человека decellularized для того чтобы изолировать ECM, которая затем repopulated с preadipocytes которые после этого продифференцированы внутри ECM в возмужалые адипоциты. Этот метод создает eCM-адипоцитные конструкции, которые метаболически активны и сохраняют характеристики тканей и пациентов, из которых они получены. Мы использовали эту систему, чтобы продемонстрировать специфические заболевания ECM-адипоцита перекрестный стебель в ткани жировой ткани человека. Эта модель культуры обеспечивает инструмент для вскрытия ролей ECM и адипоцитов в содействии глобальной жировой ткани метаболического фенотипа и позволяет изучение роли ECM в регулировании жировой ткани гомеостаза.

Введение

Внеклеточной матрицы (ECM) не только обеспечивает механические эшафот для тканей, но и участвует в сложных перекрестный разговор с клетками, которые находятся в нем, регулирующие различные процессы, необходимые для ткани гомеостаза, в том числе пролиферации клеток, дифференциации, сигнализации и метаболизма1. В то время как здоровый ECM играет важную роль в поддержании нормальной функции тканей, дисфункциональные ECM был вовлечен в многочисленные заболевания2.

Жировая ткань играет важную роль в патогенезе метаболических заболеваний. Ожирение связано с чрезмерной гипертрофией адипоцитов и клеточной гипоксией, дефектами в адипоцитном клеточном метаболизме, а также эндоплазмическим ретикулумом жировой ткани и окислительным стрессом и воспалением. Хотя плохо понимали, эти сложные процессы в сговоре, чтобы нарушить жировой ткани питательных питательных буферизации потенциала, что приводит к переполнению питательных веществ из жировой ткани, токсичность в нескольких тканях, и системные метаболические заболевания3,4 ,5. Последовательность событий и конкретных механизмов, лежащих в основе жировой ткани неудачи плохо изучены, но изменения в жировой ткани ECM были вовлечены. Состав ECM изменяется в жировой ткани при человеческом и муриновое ожирение, с увеличением осаждения белка ECM наряду с качественными биохимическими и структурными различиями в жировой ткани ECM, связанными с метаболическим заболеванием человека, включая диабет атипа 2 и гиперлипидемия6,7,8,9,10,11.

Несмотря на эти наблюдения, роль жировой ткани ECM в посредничестве жировой дисфункции ткани не четко определена. Отчасти это связано с отсутствием уступчивых экспериментальных моделей, которые позволяют рассеивание конкретных ролей ECM и адипоцитов в регулировании конечной функции жировой ткани. ECM-адипоцитная культура лучше имитирует среду in vivo родной жировой ткани, по крайней мере, в двух отношениях. Во-первых, культура ECM обеспечивает молекулярную среду, похожую на родную жировую ткань, включая местные коллагены, эластины и другие матричные белки, отсутствующие в стандартной 2D-культуре. Во-вторых, культура на 2D пластике, как было показано, изменяет метаболизм адипоцитов с помощью механических эффектов из-за снижения эластичности пластикового субстрата12,который ECM-культура устраняет.

Методы инженера биологических лесов путем изоляции ECM от децеллюлярного жирового и других тканей были изучены в контексте регенеративной и реконструктивной медицины и тканевой инженерии13,14, 15,16,17,18. Мы ранее опубликовали методологию, в которой мы адаптировали эти методы для разработки в пробирке 3D модель человеческой eCM-адипоцитной культуры, используя ECM и адипоцитов стволовых клеток (preadipocytes) полученных из человеческих висцеральных жировые ткани11. В настоящей статье мы подробно описываем эти методы. Процедура децеллюляризации жировой ткани человека представляет собой четырехдневный процесс, который включает в себя механическое и ферментативное лечение для удаления клеток и липидов, оставляя биологические эшафот, который поддерживает характеристики ткани, из которой он получен. Децеллюлярный ECM поддерживает адипогенную дифференциацию проредепоцитов человека, а при восстановлении с помощью адипоцитов поддерживает микроархитектуру и биохимические и болезнеговорящие характеристики нетронутой жировой ткани и участвует в метаболии функции, характерные для родной жировой ткани. Эту матрицу можно изучить самостоятельно или повторно посеять с клетками, что позволяет изучать взаимодействия и перекрестный разговор между клеточными и внеклеточными компонентами жировой ткани.

протокол

Адипогенные ткани закупаются у людей, проходящих выборную бариатрическую хирургию под утверждением институционального совета по обзору.

1. Изоляция Ипредипоцита и подготовка культурного реагента

  1. Приготовьте 2% крупного сывороточного альбумина (BSA) в 1x фосфатбуферном сольном растворе (PBS). Фильтр стерилизовать, и хранить при 4 градусах Цельсия.
  2. Подготовка тип II коллагенеза: 2 мг /мл в 2% BSA в 1x PBS. Приготовьтесь непосредственно перед использованием.
  3. Подготовка Red Blood Cell (РБК) Лизинирование Решение: 1,5 М НН4Cl, 100 мМ NaHCO3, 10 мМ динатрия EDTA в деионизированной воде (DI/H2O). Хранить при 4 градусах по Цельсию. Подготовьте 1x решение для использования РБК из 10x биржевого решения в DI/H2O непосредственно перед использованием.
  4. Подготовка Рост Сми: 15% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS), 1% антибиотик-антимикотическое решение (ABAM) в Dulbecco в модифицированных Eagle Medium: Питательная смесь F-12 (DMEM/F12). Фильтр стерилизовать, и хранить при 4 градусах Цельсия.
  5. Подготовка Preadipocyte Замораживание Решение: 10% диметил сульфоксид, 15% FBS в DMEM / F12 СМИ. Фильтр стерилизовать, и хранить при 4 градусах Цельсия.
  6. Подготовка Дифференциация Media: 10 мг/л трансферрин, 33 мкм биотин, 0,5 мкм человеческого инсулина раствор, 17 мкм D-пантотеновая кислота гемикальциевого соли, 100 нМ дексаметазон, 2 нМ 3,3',5-Трийодо-L-тиронина соль натрия (T3), 1 мкм циглицизон, 54М0 Изобутил-1-метилксантин (IBMX), 1% ABAM в DMEM/F12. Фильтр стерилизовать, и хранить при 4 градусах Цельсия.

2. Подготовка реагента ECM

  1. Подготовка Замораживание Буфер ноsolution: 10 мм Tris базы, 5 мМ EDTA, 1% ABAM, 1% фенилметилфольфилфонил фторид (PMSF) в DI / H2O. Перемешать решение для растворения EDTA. Отрегулируйте pH до 8.0 с HCl или NaOH.Store при 4 градусах по Цельсию на срок до 3 месяцев.
  2. Подготовьте энзиматете-решение #1: 1% ABAM в 0,25% трипсин-EDTA. Хранить при 4 градусах по Цельсию до 3 месяцев.
  3. Подготовка Промывка Буфер Ном Решение: 137 мм NaCl, 2,68 мм KCl, 7 мМ Na2HPO4, 1,5 мМ KH2PO4, 1% ABAM, 1% PMSF в стерилизованных DI / H2O. Перемешать растворить. Отрегулируйте pH до 8.0 с HCl или NaOH. Хранить при 4 градусах по Цельсию до 3 месяцев.
  4. Подготовка ферментативного решения #2: 55 мМ Na2HPO4, 17 мМ KH2PO4, 4,9 мМ MgSO4No 7H2O, 1% ABAM, 1% PMSF в DI/H2O. Хранить 4 КК на срок до 3 месяцев. Перемешать, чтобы растворить соли. Непосредственно перед использованием добавьте 80 U/mL липасы из свиной поджелудочной железы, типа VI-S; 160 U/mL дезоксирибонуклеэI из бычьей поджелудочной железы, типа II-S; и 100 мкг/мл рибонулеаза А из бычьей поджелудочной железы, типа III-А.
  5. Подготовка Решения для извлечения Polar Solvent: 1% ABAM, 1% PMSF в изопропаноле.
    ВНИМАНИЕ: Изопропанол легковоспламеняющийся; хранить в легковоспламеняющихся шкафу при 25 градусах Цельсия и утилизировать в легковоспламеняющихся отходах.
  6. Подготовка 70% этанола, 1% ABAM, 1% PMSF в DI/H2O. Добавить ABAM и PMSF непосредственно перед использованием.
    ВНИМАНИЕ: Этанол легковоспламеняющийся; хранить в легковоспламеняющихся шкафу при 25 градусах Цельсия и утилизировать в легковоспламеняющихся отходах.
  7. Подготовка решения для хранения данных: 1% ABAM, 1% PMSF в 1x PBS. Хранить при 4 градусах по Цельсию до 3 месяцев.

3. Метаболический препарат реагента фенотипирования

  1. Поглощение глюкозы
    1. Подготовка сыворотки голода СМИ: DMEM / F12, 1% ABAM. Фильтр стерилизовать, и хранить при 4 градусах Цельсия
    2. Приготовьте 200 нм раствор инсулина человека в 1x PBS непосредственно перед использованием.
    3. Приготовьте 200 нм человеческого инсулина, 0,1 мМ 2-дезокси-D-глюкозы, 1 "Ci/well Deoxy-D-глюкозы, 2-1,2-3H (N) - в 1x PBS. Приготовьтесь непосредственно перед использованием.
  2. Липолиз
    1. Приготовьте изопротеренол, разбавленный в PBS: 3 мМ на складе. Разбавить до рабочей концентрации 3 мкм для ассе.
  3. Нефть Красно-O окрашивание
    1. Подготовка 4% Формалин в DI / H2O. Хранить при комнатной температуре.
    2. Подготовка масло Красно-O Рабочее решение. Разбавленное масло Red-O Solution (ORO) с DI/H2O в соотношении 3:2 (ORO:DI/H2O). Приготовьтесь непосредственно перед использованием. Фильтр через фильтровальную бумагу(Таблица материалов).

4. Закупка жировой ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Висцеральная жировая ткань (НДС) собирается из большего omentum в начале операции хирургом и транспортируется обратно в лабораторию на льду для немедленной обработки. Универсальные меры предосторожности должны быть использованы при обработке всех человеческих тканей и едких реагентов, в том числе выполнение всех работ в ламинарном капоте потока, используя полный износ лабораторной безопасности, и не recapping игл.

  1. Добавьте 5-10 г нетронутого НДС в 15-25 мл раствора замораживания буфера в конической трубке 50 мл, чтобы погрузить образец ткани. Храните образцы при -80 градусах По цельсии до децеллюляризации, на срок до 1 месяца.
  2. Используйте отдельный свежий образец НДС для изоляции проредепоцитов, как описано в разделе 5.

5. Изоляция Проедипоцита

  1. Поместите 2 г нетронутого НДС в 20 мл коллагенезы, типа II, раствора в конической трубке 50 мл. Затем фарш тщательно путем вставки стерильных ножниц в конической трубки и измельчения ткани в трубе. После полного измельчения до тонкой суспензии, инкубировать ткани в растворе коллагеназа на орбитальный шейкер при 130 об/мин и 37 градусов по Цельсию в течение 60 мин.
  2. Фильтр результирующего дигестата через 100 мкм нейлоновой сетки в свежий 50 мл конической трубки, заливки дигестат из одной конической трубки через кусок сетки сложить поверх свежей конической трубки. Дигестат омисавной на данный момент должна быть желто-оранжевая жидкость с умеренной вязкостью, с небольшим количеством остаточных нитей непереваренной волокнистой ткани. Сетка должна захватывать более крупные кусочки непереваренной ткани, которые отбрасываются.
  3. Centrifuge образец на 270 х г в течение 10 мин. Удалите супернатант и resuspend клеточной гранулы в 2 мл 1x РБК Lysing Solution с пипеткой.
    1. Инкубировать в течение 1 мин при 25 градусах Цельсия, а затем добавить 10 мл 15% FBS-DMEM/F12. Центрифуга при 270 х г в течение 10 мин.
  4. Удалите супернатант и resuspend клеточной гранулы в 10 мл 15% FBS-DMEM/F12 с пипеткой. Перенесите суспензию клетки на 100 мм петри блюдо с пипеткой и инкубировать при 37 градусах Цельсия и 5% CO2,пока клетки не достигнут 80-100% слияния, как правило, 2-6 дней. Меняйте носители каждые 2-3 дня.
  5. Отсоедините и помойте клетки.
    1. Удалите носители с помощью пипетки и нанесите 4 мл 0,25% трипсина-ЭДТА на клетки адептов. Инкубировать при 37 градусах По области в течение 10 мин, периодически закрученного пластины осторожно, чтобы отделить клетки.
    2. Добавьте 20 мл 15% FBS-DMEM/F12 и повторно отсоедините отдельные ячейки в этом носителе с помощью пипетки. Затем перенесите на свежую коническую трубку 50 мл и центрифугу 270 х г в течение 10 мин.
    3. Удалите супернатант и отбросьте. Вымойте клеточные гранулы один раз в 1x PBS, а затем resuspend клеточной гранулы в 20 мл свежих 15% FBS-DMEM/F12 с пипеткой. Перенесите подвеску ячейки в культурную колбу Т-150.
  6. Культурные клетки при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2. Разделение и расширение клеток каждые 2-3 дня, как они достигают 80-100% слияния, применяя 7 мл 0,25% трипсин-EDTA, расширяясь от одной колбы до 8 колб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это обычно требует 3-4 проходов, что позволяет соответствующее расширение и сохраняет адипогенный потенциал и пациента и депо конкретных клеточных метаболических фенотипов. Пропуск ные preadipocytes свыше 4-5 проходов приводит к потере адипогенного потенциала.
  7. Отсоединить клетки в 8 колбах с 7 мл 0,25% трипсин-ЭДТА на колбу, как описано выше, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
  8. Добавьте 8 мл из 15% FBS-DMEM/F12 на колбу и переприостановите отдельные ячейки с помощью пипетки. Передача всей клеточной подвески равномерно разделена на три конические трубки 50 мл и центрифугу на 270 х г в течение 10 минут.
  9. Приостановить результирующую клеточные гранулы в 5 мл 15% FBS-DMEM/F12 в конической трубке 15 мл и считать ячейки с помощью клеточного счетчика и трипан-голубого.
  10. Центрифуги ядочная подвеска на 270 х г в течение 10 мин. Затем resuspend клеточной гранулы в Preadipocyte Замораживание Раствор для окончательной концентрации клеток 1 х 106/мл, и aliquot 1 мл клеточной подвески на 1,5 мл кривиальной трубки.
  11. Храните клетки в криовиалах в течение 1 дня при -80 градусах По Цельсию. Затем перенесите криовиалы в жидкий азот для длительного хранения в течение 3-6 месяцев.
  12. Когда готовы к использованию, оттаивать один кривиной в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 3-5 мин. Перенатяните клетки в 20 мл 15% FBS-DMEM/F12, и центрифуга на 270 х г в течение 10 мин.
  13. Приостановите действие клеточной гранулы в 20 мл 15% FBS-DMEM/F12, пипетка в одну колбу Т-150, а затем вырасти до 80% слияния в течение 2-3 дней при 37 C и 5% CO2.
  14. Отсоединить клетки с 7 мл 0,25% трипсин-ЭДТА на колбу, как описано выше в шаге 5.6. Приостановить на 3 миллиона ячеек на мл (т.е. 6 х 104 ячейки на 20 л) в 15% FBS-DMEM/F12, и использовать в описанном ниже (раздел 7, шаг 7.4).

6. Препарат ECM жировой ткани

  1. День 1: Заморозка-оттепель и ферментативное пищеварение #1
    1. Заморозка-оттепель ранее замороженные (шаг 4.2) ОБРАЗЦы НДС, хранящиеся в замораживании буферного раствора в конических трубках 50 мл от -80 градусов по Цельсию в разогретой водяной бане, инкубируя 20 мин с нежным периодическим ручным возбуждением. После оттаять, передача обратно в -80 градусов и инкубировать 20 мин. Повторите замораживание оттепели 3x, заканчивая оттаиванием образцов в 37 градусов воды.
    2. Используя стерильные щипцы, перенесите образцы НДС на свежие конические трубки мощностью 50 мл, содержащие 15-25 мл #1 энзимативного раствора, гарантируя полное погружение проб НДС. Затем инкубировать на ночь на орбитальный шейкер (130 об/мин, 37 градусов по Цельсию).
  2. День 2: Ферментативное пищеварение #2
    1. Вымойте образцы 3x с 15-25 мл раствора промывки буфера на орбитальной шейкер (130 об/мин, 37 кв.с, 20 мин каждая стирка). Налейте промывки буфера решение после каждой стирки.
    2. Перенос образцов на свежие конические трубки мощностью 50 мл, содержащие 15-25 мл ферментативного раствора, #2 и инкубировать на орбитальной шейкере (130 об/мин, 37 градусов по Цельсию, ночь).
  3. День 3: Делипидация
    1. Вымойте образцы 3x с 15-25 мл раствора промывки буфера на орбитальной шейкер (130 об/мин, 37 кв.с, 20 мин каждая стирка). Налейте промывки буфера решение после каждой стирки.
    2. Передача образцов на свежие конические трубки мощностью 50 мл, содержащие 15-25 мл раствора извлечения Polar Solvent, и инкубировать на орбитальной шейкере (130 об/мин, 25 градусов по Цельсию, за ночь). После этого шага, большинство липидов должны быть удалены, и образцы должны быть белого или полупрозрачного цвета.
      ВНИМАНИЕ: Раствор извлечения полярного растворителя является легковоспламеняющимся и должен храниться и использоваться при 25 градусах Цельсия.
  4. День 4: Мытье и хранение
    1. Перенос образцов на свежие конические трубки мощностью 50 мл, содержащие 15-25 мл раствора для промывки буфера. Вымойте образцы 3x на орбитальном шейкере (130 об/мин, 37 кв.с. по 20 мин каждая стирка).
    2. Вымойте образцы 3x с 15-25 мл 70% этанола на орбитальной шейкер (130 об/мин, 37 кв.с, 20 мин каждый смыть) слива 70% раствора этанола после каждой стирки.
    3. Вымойте образцы один раз с хранением решение на орбитальной шейкер (130 об /н.э., 37 кв.с. по 20 мин за стирку).
    4. Используя стерильные щипцы, перенесите образцы на свежие конические трубки мощностью 50 мл, содержащие 15-25 мл раствора для хранения. Убедитесь, что достаточное количество решений для хранения используется для полного погружения образцов. Хранить при 4 градусах по Цельсию до 1 месяца.

7. Препарат ECM-адипоцита

  1. Перенос хранящихся фрагментов ECM в отдельные скважины 24-колодца пластины с помощью стерильных щипцы. Добавьте столько фрагментов ECM в столько скважин, сколько требуется для запланированного нижепом прогноза (например, поглощение глюкозы или липолиз, см. ниже), включая дубликаты или трипликаты. Вымойте 500 л 70% этанола 3x на орбитальном шейкере (130 об/мин, 37 градусов по Цельсию, по 20 мин на стирку).
  2. Регидратировать ECM путем мытья 3x в стерильных 1x PBS на орбитальной шейкер (130 об/мин, 37 кв.м, 20 мин каждая стирка).
  3. Используя стерильные ножницы, вырезать и взвесить ECM в 100 мг фрагментов. Используя стерильные щипчинки, поместите по 110 мг фрагмента в каждом колодце 24-колодца пластины. Инкубировать при 25 градусах По области в течение 15 минут, чтобы избыток PBS выдался из фрагментов. Тщательно удалите излишки PBS с помощью пипетки.
  4. Семена каждый 100 мг Фрагмент ECM с 20 зл и предипоцитной клеточной суспензии (3 миллиона клеток на мл, 6 х 104 клетки на 20 QL, в 15% FBS-DMEM/F12, от шага 5.10). Pipette клетки непосредственно в ECM, поместив кончик пипетки в ECM и осторожно изгнания подвески клетки в центре матрицы, заботясь, что клеточная подвеска не переполнения и в конечном итоге на нижней части колодца.
    1. Если суспензия ячейки переполнена ECM, где был помещен наконечник пипетки, удалите наконечник из этого места и вставьте где-нибудь еще в ECM. Инкубировать посеянный ECM в течение 40 мин при 37 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экстракции РНК для qrtPCR, семена каждый 500 мг ECM фрагментов с 3 х 105 клеток в 100 мл (3 млн клеток на мл, т.е., 3 х 105 клеток на 100 qL, в 15% FBS-DMEM / F12).
  5. Заполните каждую скважину из 24-колодца пластины с 500 л роста средств массовой информации для покрытия семян ECM фрагментов. Культура при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2 на 72 ч.
  6. После 72 ч тщательно аспирируйте 15% FBS-DMEM/F12, слегка наклоняя пластину, чтобы позволить сми бассейн ниже фрагмента, и размещение кончика пипетки только рядом с фрагментом ECM, не нарушая его. После аспирации, добавить 500 qL дифференциации СМИ, изменение средств массовой информации каждые 2-3 дня с использованием аналогичной техники, в течение всего периода культуры 14 дней.
    1. Проверьте на дифференциацию с помощью световой микроскопии: клетки будут накапливать липиды, покрасить коричнево-желтый цвет и более сферическую форму.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Семенные матрицы могут быть использованы для метаболического тестирования (например, анализ поглощения глюкозы, анализ липолиза, ORO), гистологии или иммуногистохимии (IHC), или стандартной визуализации тканей. Для фиксации оращивания и визуализации ткани ORO заморозьте образцы ECM-адипоцита в жидком азоте.

8. Метаболический фенотипирование

  1. Сканирование электронной микроскопии
    1. Исправьте образцы в 2,5% глютаральдегида в фосфатном буфере Соренсена при 25 градусах по Цельсию на 12 ч. Postfix в 1% тетроксида осмия в фосфатном буфере Соренсена при 4 C на 1 ч.
    2. Серийноо обезвоживать образцы этанола. Вымойте в гексаметилдисализане и высушите воздухом. Затем смонтируйте на сканирующей электронной микроскопии заглушку с коллоидным графитом. Сухой, и распыление пальто с золотом.
    3. Захват изображений с помощью сканирующего электронного микроскопа.
  2. Нефть Красно-O окрашивание
    1. Live Ткань: Масло Red-O Решение
      1. Тщательно аспирируйте носители из колодцев с пипеткой. Затем мыть образцы один раз с 500 Зл 1x PBS в скважине.
      2. Исправьте образцы с 200 qL 4% формалина в стерильных деионизированных H2O при 25 градусах по Цельсию в течение 15 мин. Аспир формалин с пипеткой, мыть образцы два раза с 1x PBS (500 л каждой стирки).
      3. Добавьте 200 л из 60% образцов изопропанола при 25 градусах по Цельсию в течение 5 мин. Аспир 60% изопропанол с пипеткой.
      4. Образцы пятна с маслом Red-O рабочий раствор на 25 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Аспир масло Red-O с пипеткой, а затем мыть образцы 3x с 1x PBS (500 qL каждая стирка). Затем изображение с оптическим микроскопом.
    2. Фиксированная ткань: Масло Red-O пятно Kit
      1. Флэш-заморозка ECM-адипоцитов образцов в оптимальной температуре резки (OCT) соединения и раздел (5 мкм) на криостат.
      2. Поместите слайд в 85% пропилена гликоль в DI / H2O в течение 2 мин. Поместите слайд в ORO пятно на 60 градусов по Цельсию в течение 6 мин. Место steh lide в 85% пропилена гликоль в DI / H2O в течение 1 мин. Промыть слайд дважды с DI / H2O.
      3. Поместите слайд в модифицированный гематоксилин Майера из нефти Red-O окрашивающий комплект для 1 мин. Промыть слайд дважды с водопроводной водой. Промыть слайд дважды с DI / H2O.
      4. Установите coverslip с помощью вавливой среды монтажа и изображения на микроскоп.
    3. Извлечение РНК из ECM для qrtPCR
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы максимизировать выход РНК, используйте 500 мг фрагментов ECM, посеянных с 3 х 105 preadipocytes в 100 ЗЛ и дифференцировать как выше в 6-колодцевых пластин в 3 мл дифференциации средств массовой информации в скважине.
      1. После того, как дифференцированы, передача каждого отдельного ECM-адипоцита образца в 50 мл конической трубки на льду с помощью стерильных щипцы.
      2. Вымойте пустой колодец с 500 Зл Баффер RLT. Добавьте коническую трубку Buffer RLT в 50 мл с соответствующим образцом ECM-адипоцита.
      3. Используя стерильные ножницы, мелко фарш каждый eCM-адипоцит образца в 50 мл конической трубки, удерживая трубку на льду, вставляя ножницы в коническую трубку, чтобы фарш ткани.
      4. Полностью заморозить и разморозить конические трубки от -80 до 37 градусов по Цельсию 3x.
      5. Конические трубки Centrifuge при 500 х г и 4 кв 10 мин.
      6. Тщательно удалите супернатант с пипеткой и использовать для извлечения РНК с фиброзной ткани РНК экстракт(Таблица материалов).
  3. Поглощение глюкозы
    1. Дифференцируйте 6 x 104 проредеипоцитов в 100 мг фрагментов ECM в 0,5 мл дифференциации среды в 24-колодных пластинах, как описано выше (раздел 5).
    2. После 14 дней дифференциации, удалить среду и мыть ECM-адипоцитов один раз с 1x PBS. Добавьте 0,5 мл/хорошо сыворотки голода среднего и культуры на 37 КС и 5% CO2 на 12 ч.
    3. Удалите средние и мыть клетки дважды с 1x PBS. Добавить 0,5 мл/хорошо 2% BSA в PBS и культуры на 37 КС и 5% CO2 на 2 ч.
    4. Вымойте клетки один раз с 1x PBS, добавить 0,5 мл / хорошо 1x PBS с или без 200 НМ инсулина, и инкубировать при 37 кв С в течение 40 мин.
    5. Аспират 1x PBS, добавить 0,5 мл /хорошо 1X PBS с 0,1 мМ 2-дезокси-D-глюкозы, 2 "Ci/mL дезокси-D-глюкозы, 2- 1,2-3H (N) ", с или без 200 нм инсулина, и инкубировать при 37 кс и 5% CO2 для 40 мин. радиоактивных реагентов и отходов, как это предусмотрено местными институциональными нормативными актами.
    6. Удалите среду с пипеткой и мыть клетки 3x с 1x PBS. Добавьте 420 л 1% SDS-раствора в DI/H2O и лисиц-клетки с энергичным пипеткой. Инкубировать 25 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
    7. Соберите 5 л от каждого колодца для анализа белка Брэдфорда. Передача 400 л оставшихся клеточных лисатов в 2 мл сцинтилляционной жидкости во флаконе сцинтилляции. Подсчитайте 3H-2DG деятельности на счетчик есинки. Анализ данных по мере того, как считается, что в минуту нормализуется к белку, мг/мл.
  4. Липолиза ассси
    1. Дифференцируйте 6 x 104 проредепоцитов в 100 мг фрагментов ECM в 0,5 мл среды дифференциации человека в 24-колодных пластинах, как описано выше (раздел 5).
    2. После 14 дней дифференциации, удалить средние и мыть клетки дважды с теплой 1x PBS. Добавьте 0,5 мл среды голодания в сыворотке (без инсулина) с изопротеренолом или без нее, а также культурные адипоциты при 37 градусах По кв. м и 5% CO2 на 72 ч.
    3. Собирайте культурные супернацианты, которые могут храниться при -80 градусов по Цельсию до готовности к ассе. Сбор ECM в микроцентрифуговых трубках для количественной оценки ДНК для нормализации данных.
    4. Пипет капота 2 зл и l каждого супернатанта в микроплиту 96 колодцей. Резервные скважины для заготовок (дистиллированный H2O) и glycerol стандартное решение, представленное в комплекте определения триглицеридов.
    5. Добавьте 270 л свободного глицерола реагента из триглицеридов Determination Kit к каждой скважине, пипетку смешать. Инкубировать тарелку при 37 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
    6. Измерьте абсорбцию на уровне 540 нм на микроплитном спектрофотометре.
    7. Рассчитайте концентрацию глицерола и нормализуйс с помощью ДНК eCM:

figure-protocol-21968

Результаты

Подготовка жировой ткани ECM, посев с проредепоцитами, и дифференциация в пробирке в зрелые адипоциты приводят к четким последовательным морфологическим изменениям в ткани, что позволяет визуальную оценку прогресса по всему протоколу (Рисунок 1) . Приде...

Обсуждение

Модель культуры ECM-адипоцитов является ценным инструментом для вскрытия отдельных ролей ECM и клеток в диктовке конечной фенотипа ткани. Протокол изоляции ECM довольно воспроизводим, но может наблюдаться изменчивость процесса децеллюляризации. Шаг по делипидуляции дня 3 является критич?...

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о каких-либо противоречащих друг другу интересах.

Благодарности

Мы благодарим Даниэль Бергер, Мэрилин Вудрафф, Симону Корреа и Рету Гайсс за помощь в координации исследований. SEM была выполнена ВУниверситете Мичигана микроскопии и анализа изображений Лаборатория биомедицинских исследований Основной фонд. Этот проект был поддержан NIH гранты R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Ветераны заслуги Грант I01CX001811 (RWO), пилот и доступность Грант из Мичигана Диабет исследовательский центр (NIH Грант P30-DK020572) (RWO), Администрация ветеранов VISN 10 СПАРК Пилот грант (RWO). Сканирование электронной микроскопии в исполнении Мичиганского университета микроскопии и анализа изображений Лаборатория биомедицинских исследований Основной фонд. Рисунок 4 этой рукописи был первоначально опубликован в журнале Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; 1 марта;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, и был воспроизведен с разрешения издательства Оксфордского университета (https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329). Для получения разрешения на повторное использование этого материала, пожалуйста, посетите http://global.oup.com/academic/rights.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTAGibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#25200056
1.5 mL cryovial tubeFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#02-682-557
10% Neutral Buffered FormalinVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#89370-094
100 µm nylon mesh filterCorning Inc., Corning, NY, USACat#352360
2-Deoxy-D-glucoseSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#D8375
2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#T6397
24-well tissue culture platesVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10861-700
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#I5879
96-well tissue culture platesVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10861-666
Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#15240062
BiotinSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#B4639
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#A8806
Buffer RLTQiagen, Hilden, GermanyCat#79216
CiglitizoneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#C3974
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USACat#NET328A250UC
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#D4513
DexamethasoneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#D4902
Dimethyl SulfoxideFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#BP231Flammable, caustic
Disodium EDTAFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#BP118
D-pantothenic acid hemicalcium saltSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#21210
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#11320033
EthanolDecon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USACat#DSP-MD.43Flammable
EVE Cell Counting Slides, NanoEnTekVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10027-446
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#10437028
GlutaraldehydeSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#G5882Caustic
HexamethyldisalizaneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#440191Flammable, caustic
Human insulin solutionSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#I9278
IsopropanolFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#A415Flammable
IsoproterenolSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#I5627Flammable
KClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S25484
KH2PO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#P5655
Lipase from porcine pancreas, type VI-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#L0382
MgSO4*7H2OSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#230391
Na2HPO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S5136
NaClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S3014
NaHCO3Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#S233
NH4ClFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#A661
Optimal cutting temperature (OCT) compoundAgar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UKCat# AGR1180
Oil Red-O Solution (ORO)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#O1391
Oil Red-O Stain KitAmerican Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USACat#KTORO-G
Osmium tetroxideSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#201030Caustic
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#93482Caustic
Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#SH3025601
Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-ASigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#R5125
RNAEasy Fibrous Tissue MiniKitQiagen, Hilden, GermanyCat#74704
Scintillation FluidFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#SX18
Scintillation Counter
Scissors, forceps, sterile
Sorensen's phosphate bufferThomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJCAS #: 10049-21-5
T-150 culture flaskVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10062-864
TaqMan Gene Expression Master MixThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#4369016
Temperature-controlled orbital shaker
Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube HomogenizerBenchmark ScientificCat#D1030
TransferrinSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#T3309
Triglyceride Determination KitSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#TR0100
Trypan blue stain, 0.4%VWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10027-446
Type II collagenaseGibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#17101015
Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mmSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#WHA5201150

Ссылки

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
  2. Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
  3. Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
  4. O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
  5. Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
  6. Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
  7. Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
  8. Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
  9. Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
  10. Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
  11. Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
  12. Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
  13. Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
  14. Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
  15. Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
  16. Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
  17. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  18. Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
  19. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
  20. Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
  21. Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
  22. O'Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
  23. Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
  24. Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

153

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены