JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz adipoz doku metabolik fenotip katkıda matris ve adiposit lerin rollerinin diseksiyon sağlayan bir 3D insan ekstrasellüler matriks-adiposit in vitro kültür sistemi açıklar.

Özet

Hücre dışı matriks (ECM) doku homeostazının düzenlenmesinde, hücrelerle çapraz konuşma yapmada ve hücresel fonksiyonun birden fazla yönünü düzenlemede merkezi bir rol oynar. ECM obezite yağ dokusu fonksiyonu özellikle önemli bir rol oynar, ve yağ dokusu ECM birikimi ve bileşimideğişiklikleri fareler ve insanlarda metabolik hastalık ile ilişkilidir. Küresel doku fenotipkatkıda ECM ve hücrelerin rollerinin diseksiyon izin in vitro modeller seyrek. Biz insan ECM-adiposit kültürünün yeni bir 3D in vitro modeli, adipoz doku metabolik fenotip düzenleyen ECM ve adipositlerin belirli rolleri çalışma izin açıklar. İnsan yağ dokusu ECM izole etmek için desellize edilir, daha sonra olgun adipositler içine ECM içinde ayırt edilir preadipocytes ile yeniden doldurulur. Bu yöntem metabolik olarak aktif olan ve türetildiği doku ve hastaların özelliklerini koruyan ECM-adiposit yapıları oluşturur. Bu sistemi, insan yağ dokusunda hastalığa özgü ECM-adiposit çapraz sapı göstermek için kullandık. Bu kültür modeli küresel yağ dokusu metabolik fenotip katkıda ECM ve adipositlerin rollerini incelemek için bir araç sağlar ve yağ dokusu homeostaz düzenleyen ECM rolünün çalışma izin verir.

Giriş

Hücre dışı matriks (ECM) sadece dokular için mekanik bir iskele sağlar, ama aynı zamanda içinde bulunan hücreler ile karmaşık bir çapraz meşgul, hücre çoğalması da dahil olmak üzere doku homeostaz için gerekli çeşitli süreçleri düzenleyen, farklılaşma, sinyalizasyon ve metabolizma1. Sağlıklı ECM normal doku fonksiyonunun sürdürülmesinde önemli bir rol oynarken, işlevsiz ECM birden fazla hastalığa bürünmemiştir2.

Adipoz doku metabolik hastalığın patogenezinde önemli bir rol oynar. Obezite aşırı adiposit hipertrofisi ve hücresel hipoksi ile ilişkilidir, adiposit hücre metabolizmasında defektler, ve yağ dokusu endoplazmik retikulum ve oksidatif stres ve inflamasyon. Yanlış anlaşılmış olsa da, bu karmaşık süreçler yağ dokusu besin tamponlama kapasitesini bozmak için komplo, yağ dokusundan besin taşması yol açan, birden fazla dokutoksisite, ve sistemik metabolik hastalık3,4 ,5. Yağ dokusu yetmezliğinin altında yatan olaylar dizisi ve belirli mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır, ancak yağ dokusu ECM'deki değişiklikler ecm'ye dahil edilmiştir. ECM bileşimi insan ve mürin obezitesinde yağ dokusu içinde, insan metabolik hastalığı ile ilişkili yağ dokusu ECM nitel biyokimyasal ve yapısal farklılıklar ile birlikte ECM proteininin artmış birikimi ile değiştirilir, dahil olmak üzere tip 2 diyabet ve hiperlipidemi6,7,8,9,10,11.

Bu gözlemlere rağmen, yağ dokusu ECM'nin yağ dokusu disfonksiyonuna aracılık etmedeki rolü iyi tanımlanmamıştır. Bu kısmen nihai yağ dokusu fonksiyonunun düzenlenmesinde ECM ve adipositlerin belirli rollerinin diseksiyonuna izin veren çekilebilir deneysel modellerin eksikliğinden kaynaklanmaktadır. ECM-adiposit kültürü en az iki açıdan yerli yağ dokusunun in vivo ortamını daha iyi simüle eder. İlk olarak, ECM kültürü, standart 2D kültüründe bulunmayan yerli kollajenler, elastinler ve diğer matris proteinleri de dahil olmak üzere yerli yağ dokusuna benzer moleküler bir ortam sağlar. İkinci olarak, 2D plastik kültürü plastik substrat azaltılmış elastikiyeti nedeniyle mekanik etkileri ile adiposit metabolizmasını değiştirmek için gösterilmiştir12, Hangi ECM-kültür ortadan kaldırır.

ECM'nin hücreli yağ ve diğer dokulardan izole edilerek biyolojik iskelelerin tasarlanma yöntemleri rejeneratif ve rekonstrüktif tıp ve doku mühendisliği bağlamında incelenmiştir13,14, 15,16,17,18. Daha önce insan ecm-adiposit kültürünün bir in vitro 3D modeli geliştirmek için bu yöntemleri uyarlanmış metodoloji yayınladık, ECM ve adiposit kök hücreleri kullanarak (preadipocytes) insan visseral yağ dokuları türetilmiştir11. Bu makalede, bu yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz. İnsan yağ dokusu için decellularization prosedürü, türetildiği dokunun özelliklerini koruyan biyolojik bir iskele bırakarak, hücreleri ve lipid kaldırmak için mekanik ve enzimatik tedaviler içeren dört günlük bir süreçtir. Desellülerce ECM insan pizpositlerinin adipojenik farklılaşmasını destekler ve adipositlerle yeniden oluşturulduğunda, mikromimarisi ve biyokimyasal ve hastalığa özgü sağlam yağ dokusu özelliklerini korur ve metabolik yerli yağ dokusunun karakteristik fonksiyonları. Bu matris tek başına çalışılabilir veya hücrelerle yeniden tohumlanabilir, adipoz dokusunun hücresel ve hücre dışı bileşenleri arasındaki etkileşimlerin ve çapraz konuşmaların incelenmesine izin verilir.

Protokol

Adipose dokuları, kurumsal inceleme kurulu onayı ile elektif bariatrik cerrahi uygulanan insan deneklerinden temin edilmektedir.

1. Preadipocyte izolasyon ve kültür reaktif hazırlama

  1. 1x fosfat tamponlu salin çözeltisi (PBS) %2 büyükbaş serum albumin (BSA) hazırlayın. Filtre sterilize ve 4 ° C'de saklayın.
  2. Tip II kollajenaz hazırlayın: 1x PBS'de %2 BSA'da 2 mg/mL. Kullanmadan hemen önce hazırlayın.
  3. Hazırlayın Kırmızı Kan Hücresi (RBC) Lysing Çözeltisi: 1.5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3, 10 mM disodyum EDTA deiyonize suda (DI/H2O). 4 °C'de saklayın. Kullanılmadan hemen önce DI/H2O'daki 10x stok çözeltisinden 1x RBC Lysing Çözeltisi hazırlayın.
  4. Büyüme Ortamı hazırlayın: %15 fetal büyükbaş serum (FBS), Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta:Besin Karışımı F-12 (DMEM/F12) %1antibiyotik-antimikotik solüsyon (ABAM). Filtre sterilize ve 4 ° C'de saklayın.
  5. Preadipocyte Dondurma Solüsyonu Hazırlayın: DMEM/F12 ortamlarında %10 Dimethyl Sulfoxide, %15 FBS. Filtre sterilize ve 4 ° C'de saklayın.
  6. Farklılaşma Ortamı Nı Hazırlayın: 10 mg/L transferrin, 33 μM biotin, 0.5 μM insan insülin çözeltisi, 17 μM D-pantotenik asit hemikalsiyum tuzu, 100 nM deksametazon, 2 nM 3,3',5-Triiodo-L-tironin sodyum tuzu (T3), 1 μM silitikiton, 540 μM 3- İzobutyl-1-methylxanthine (IBMX), DMEM/F12'de %1 ABAM. Filtre sterilize ve 4 ° C'de saklayın.

2. ECM reaktif hazırlama

  1. Dondurucu Tampon Çözeltisi Hazırlayın: 10 mM Tris baz, 5 mM EDTA, %1 ABAM, DI/H2O. Stir çözeltisinde %1 fenilmetilsülfonil florür (PMSF) EDTA'yı eritmek için karıştırın. 4 °C'de HCl veya NaOH.Store ile pH'ı 8,0'a ayarlayın.
  2. Enzimatik Çözelti #1 hazırlayın: %0,25 tripsin-EDTA%1 ABAM. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
  3. Durulama Tampon Çözeltisi Hazırlayın: 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 7 mM Na2HPO4,1.5 mM KH2PO4,%1 ABAM, %1 PMSF sterildi DI/H2O. Tuzları eritmek için karıştırın. HCl veya NaOH ile pH'ı 8.0'a ayarlayın. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
  4. #2 Enzimatik Çözelti Yi Hazırlayın: 55 mM Na2HPO4,17 mM KH2PO4,4,9 mM MgSO4,7H2O, %1 ABAM, DI/H2O. Store 4 °C'de %1 PMSF 3 aya kadar. Tuzları eritmek için karıştırın. Hemen kullanımdan önce, domuz pankreas 80 U / mL lipaz ekleyin, tip VI-S; 160 U/mL deoksiribonuclease I büyükbaş pankreas, tip II-S; ve 100 μg/mL ribonükle a büyükbaş pankreas, tip III-A.
  5. Polar Solvent Ekstraksiyon Çözeltisi Hazırlayın: 1% ABAM, 1% PMSF izopropanol içinde.
    DİkKAT: İnopropanol yanıcıdır; 25 °C'de yanıcı bir dolapta saklayın ve yanıcı atıklarda atın.
  6. Kullanıma hemen önce %70 etanol, %1 ABAM, %1 PMSF DI/H2O. ABAM ve PMSF ekleyin.
    DİkKAT: Etanol yanıcıdır; 25 °C'de yanıcı bir dolapta saklayın ve yanıcı atıklarda atın.
  7. Depolama Çözümü Hazırlayın: 1% ABAM, 1x PBS% 1 PMSF. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.

3. Metabolik fenotitipre reaktif hazırlama

  1. Glikoz alımı
    1. Serum Açlık Medya hazırlayın: DMEM/F12, 1% ABAM. Filtre sterilize ve 4 °C'de saklayın
    2. Kullanmadan hemen önce 1x PBS'de 200 nM insan insülin çözeltisi hazırlayın.
    3. Hazırlamak 200 nM insan insülin, 0.1 mM 2-Deoksi-D-glukoz, 1 μCi/iyi Deoksi-D-glukoz, 2-[1,2-3H(N)]],, 1x PBS içinde. Kullanmadan hemen önce hazırlayın.
  2. Lipoliz
    1. PBS seyreltilmiş İzoproterenol hazırlayın: 3 mM stok çözeltisi. Çalışma konsantrasyonuna seyreltin 3 μM'lik çalışma konsantrasyonu için.
  3. Yağ Kırmızı-O Boyama
    1. DI/H2O. Store'da oda sıcaklığında %4 Formalin hazırlayın.
    2. Hazırlayın Yağ Red-O Çalışma Çözümü. Seyreltik Yağ Kırmızı-O Çözeltisi (ORO) ile DI/H2O 3:2 oranında (ORO:DI/H2O). Kullanmadan hemen önce hazırlayın. Filtre kağıdından filtreleyin (Malzeme Tablosu).

4. Yağ dokusu temini

NOT: Visseral yağ dokusu (KDV) cerrah tarafından operasyonun başlangıcında büyük omentumdan toplanır ve hemen işlenmesi için buz üzerinde laboratuvara geri taşınır. Tüm insan dokuları ve kostik reaktifleri kullanırken, tüm çalışmaları laminar akış kaputunda, tam laboratuvar güvenlik aşınması kullanarak ve iğnelerin tekrarlanması olmadan gerçekleştirirken evrensel önlemler alınmalıdır.

  1. Doku örneğini batırmak için 50 mL konik tüpe 15-25 mL Dondurucu Tampon Çözeltisi'ne 5-10 g sağlam KDV ekleyin. Numuneleri hücre dışı hale alınana kadar -80 °C'de 1 aya kadar saklayın.
  2. Bölüm 5'te açıklandığı gibi preadipocyte izolasyonu için ayrı bir taze KDV örneği kullanın.

5. Preadipocyte izolasyonu

  1. Kollajenaz, tip II, çözeltinin 20 mL'lik kısmını 50 mL konik bir tüpe 2 g sağlam KDV yerleştirin. Daha sonra konik tüp içine steril makas takarak ve tüp içinde doku kıyma iyice kıyma. İnce bir bulamaç için tamamen kıydıktan sonra, kollajenaz çözeltisindeki dokuyu 130 rpm ve 37 °C'de 60 dakika boyunca orbital shaker'da kuluçkaya yatırın.
  2. Ortaya çıkan digestate'i 100 m'lik naylon kafesten, bir konik tüpten, taze konik bir tüpün üzerine katlanmış bir kafes parçasına dökerek 50 mL'lik yeni bir konik tüpe süzün. Bu noktada digestate orta viskoziteli bir sarı-turuncu sıvı olmalıdır, sindirilmemiş fibröz doku artık iplikçikleri küçük miktarlarda. Mesh sindirilmemiş doku, hangi atılır daha büyük parçalar yakalamak gerekir.
  3. Numuneyi 10 dk için 270 x g'de santrifüj edin.
    1. 25 °C'de 1 dk kuluçkaya yatın ve sonra 10 mL %15 FBS-DMEM/F12 ekleyin. 10 dk için 270 x g santrifüj.
  4. Supernatant çıkarın ve bir pipet ile% 15 FBS-DMEM/F12 10 mL hücre pelet resuspend. Hücre süspansiyonuna bir pipetle 100 mm Petri kabına aktarın ve 37 °C ve %5 CO2'deinkübat. Her 2-3 günde bir ortamı değiştirin.
  5. Hücreleri ayırın ve yıkayın.
    1. Bir pipet ile ortam çıkarın ve yapışık hücrelere% 0,25 tripsin-EDTA 4 mL uygulayın. Hücreleri ayırmak için 37 °C'de 10 dakika boyunca, düzenli olarak plakayı yavaşça döndürerek kuluçkaya yatırın.
    2. %15 FBS-DMEM/F12'nin 20 mL'sini ekleyin ve bu ortamdaki müstakil hücreleri pipetle yeniden askıya alın. Daha sonra 10 dk için taze 50 mL konik tüp ve santrifüj 270 x g aktarın.
    3. Supernatant çıkarın ve atın. Hücre peletini 1x PBS'de bir kez yıkayın ve daha sonra hücre peletini 20 mL taze %15 FBS-DMEM/F12'de bir pipetle yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna T-150 kültür şişesine aktarın.
  6. Kültür hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de . Hücreleri 2-3 günde bir bölerek genişletin ve %80-100 birleştiğinde 7 mL 0,25 trippsin-EDTA uygulayarak bir şişeden 8 şişeye kadar genişleyerek bölün ve genişletin.
    NOT: Bu genellikle uygun genişleme sağlar ve adipojenik potansiyeli ve hasta korur 3-4 pasajlar gerektirir- ve depoya özgü hücresel metabolik fenotipler. 4-5 pasajı aşan preadipocytes passaging adipojenik potansiyelin kaybına yol açar.
  7. Yukarıda açıklandığı gibi şişe başına 7 mL 7 mL trypsin-EDTA ile 8 şişedeki hücreleri ayırın ve 37 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
  8. Şişe başına 8 mL %15 FBS-DMEM/F12 ekleyin ve müstakil hücreleri pipetle yeniden askıya alın. Tüm hücre süspansiyonunun eşit olarak üç 50 mL konik tüpe ve santrifüje 270 x g'de 10 dk'ya bölünmesi.
  9. 15 mL konik tüpte %15 FBS-DMEM/F12'de 5 mL'lik hücre peletlerini yeniden askıya alın ve hücre sayacı ve Trypan mavisi kullanarak hücreleri sayın.
  10. 10 dakika boyunca 270 x g hücre süspansiyon santrifüj. Daha sonra Preadipocyte Dondurma Solüsyonu'ndaki hücre peletini 1 x 106/mL nihai hücre konsantrasyonuna ve 1,5 mL kriovial tüp başına 1 mL hücre süspansiyonuna aliquot 1 mL'lik bir hücre konsantrasyonuna yeniden askıya alın.
  11. Hücreleri -80 °C'de 1 gün boyunca cryovials'da saklayın. Daha sonra cryovials'ı 3-6 ay boyunca uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarın.
  12. Kullanıma hazır olduğunuzda, 37 °C'lik su banyosunda 37 °C'lik bir cryovial'ı 3-5 dk. 20 mL'lik 15 FBS-DMEM/F12'de hücreleri yeniden askıya alın ve 10 dk boyunca 270 x g'da santrifüj de santrifüj edin.
  13. Hücre peletini 20 mL'lik 15% FBS-DMEM/F12'de yeniden askıya alın, tek bir T-150 şişesine pipet leğeniniçine alın ve 2-3 gün içinde 37 °C ve %5 CO2'de%80 biraraya gelmek .
  14. Yukarıda adım 5.6'da açıklandığı gibi şişe başına %0,25 tripsin-EDTA 7 mL'lik hücreleri ayırın. ML başına 3 milyon hücrede (yani 20°L'de 6 x 104 hücre) %15 FBS-DMEM/F12'de yeniden askıya alın ve aşağıda belirtildiği gibi kullanın (bölüm 7, adım 7.4).

6. Yağ dokusu ECM hazırlanması

  1. 1. Gün: Donma-çözülme ve enzimatik sindirim #1
    1. Önceden dondurulmuş dondurulan donma (adım 4.2) Önceden ısıtılmış bir su banyosunda -80 °C ile 37 °C arasında 50 mL konik tüplerde Dondurucu Tampon Çözeltisi'nde saklanan KDV numuneleri, 20 dk nazik periyodik manuel ajitasyon ile kuluçkaya yatırılır. Çözüldükten sonra -80 °C'ye geri transfer edin ve 20 dk. 37 °C'lik su banyosundaki erime örnekleri yle biten donma-çözülme 3x'i tekrarlayın.
    2. Steril forsepsler kullanarak, KDV numunelerini 15-25 mL enzimatik çözüm #1 içeren yeni 50 mL konik tüplere aktararak KDV örneklerinin tamamen batırılmasını sağlar. Daha sonra bir yörünge shaker (130 rpm, 37 °C) bir gecede kuluçka.
  2. Gün 2: Enzimatik sindirim #2
    1. Orbital shaker üzerinde 15-25 mL Durulama Tampon Çözeltisi ile 3x yıkama örnekleri (130 rpm, 37 °C, her yıkama da 20 dk). Her yıkamadan sonra Durulama Tampon Çözeltisi dökün.
    2. Numuneleri 15-25 mL enzimatik çözelti içeren taze 50 mL konik tüplere aktarın #2 ve bir orbital shaker (130 rpm, 37 °C, bir gecede) üzerinde kuluçkaya yatırın.
  3. Gün 3: Delipidasyon
    1. Orbital shaker üzerinde 15-25 mL Durulama Tampon Çözeltisi ile 3x yıkama örnekleri (130 rpm, 37 °C, her yıkama da 20 dk). Her yıkamadan sonra Durulama Tampon Çözeltisi dökün.
    2. Numuneleri 15-25 mL Polar Solvent Ekstraksiyon Solüsyonu içeren taze 50 mL konik tüplere aktarın ve orbital shaker (130 rpm, 25 °C, geceleme) üzerinde kuluçkaya yatırın. Bu adımdan sonra lipidin çoğunluğu çıkarılmalı ve numuneler beyaz veya yarı saydam renkte olmalıdır.
      DİkKAT: Polar solvent ekstraksiyon çözeltisi yanıcıdır ve 25 °C'de depolanmalı ve kullanılmalıdır.
  4. 4. Gün: Yıkama ve depolama
    1. Numuneleri 15-25 mL durulama Tampon Çözeltisi içeren yeni 50 mL konik tüplere aktarın. Numuneleri orbital shaker üzerinde 3x yıkayın (130 rpm, 37 °C, her yıkama20 dk).
    2. Her yıkamadan sonra %70 etanol çözeltisinden dökülen numuneleri orbital shaker 'da (130 rpm, 37 °C, 20 dk) 15-25 mL%70 etanol ile yıkayın.
    3. Orbital shaker (130 rpm, 37 °C, 20 dk her yıkama) üzerinde Depolama Çözümü ile örnekleri bir kez yıkayın.
    4. Steril forsepskullanarak numuneleri 15-25 mL Depolama Çözümü içeren yeni 50 mL konik tüplere aktarın. Numuneleri tam olarak batırmak için yeterli Depolama Çözümü kullanıldığından emin olun. 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.

7. ECM-adiposit hazırlama

  1. Depolanan ECM parçalarını steril enfazlas kullanarak 24 kuyuluk tek tek kuyulara aktarın. Yinelenenler veya üçlemeler de dahil olmak üzere, planlanan akış aşağı çıktısı için gerekli olan sayıda ECM parçasını (örneğin, glikoz alımı veya lipoliz, aşağıya bakın) ekleyin. Orbital shaker üzerinde %70 etanol 3x 500 μL (130 rpm, 37 °C, 20 dk her yıkama) ile yıkayın.
  2. Bir orbital shaker (130 rpm, 37 °C, 20 dk her yıkama) steril 1x PBS 3x yıkayarak ECM rehydrate.
  3. Steril makas kullanarak, 100 mg parçalar halinde ECM'yi kesip tartın. Steril forceps kullanarak, 24-iyi plaka her kuyuya bir 100 mg parça yerleştirin. Fazla PBS'nin parçalardan dışarı çıkarmasını sağlamak için 25 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın. Pipetle fazla PBS'yi dikkatlice çıkarın.
  4. 20 μL preadipocyte hücre süspansiyonu ile her 100 mg ECM parçasıtohum (mL başına 3 milyon hücre, 20 μL başına 6 x 104 hücre, içinde 15% FBS-DMEM/F12, adım 5.10). Pipet hücreleri doğrudan ECM'ye pipet ucunu yerleştirerek ve hücre süspansiyonuna yavaşça matrisin ortasına atarak, hücre süspansiyonunun taşmadığını ve kuyunun dibine kadar uzandığını göz önünde bulundurarak ECM'ye titreyin.
    1. Hücre süspansiyonu pipet ucunun yerleştirildiği ECM'den taşıyorsa, ucu o konumdan çıkarın ve ECM'nin başka bir yerine yerleştirin. 37 °C'de 40 dk'lık ecm tohumlu kuluçka makinesi.
      NOT: QrtPCR için RNA ekstraksiyonu için, 100 μL'de 3 x 105 hücreli 500 mg ECM parçasının tohumunu (mL başına 3 milyon hücre, yani 100°L'de 3 x 105 hücre, %15 FBS-DMEM/F12).
  5. 24 kuyulu plakanın her kuyuyu, tohumlu ECM parçalarını kapsayacak şekilde 500 μL'lik büyüme ortamıyla doldurun. Kültür 37 °C ve 5% CO2 72 saat için.
  6. 72 saat sonra, %15 FBS-DMEM/F12'yi dikkatlice aspire edin, ortamın parçanın altında birikmesine izin vermek için plakayı hafifçe yatırın ve pipet ucunu rahatsız etmeden ECM parçasının hemen bitişiğinde yerleştirin. Azarladıktan sonra, 14 günlük toplam kültür süresi için, benzer bir teknik kullanarak her 2-3 günde bir medya değiştirerek, 500 μL Farklılaşma Medya ekleyin.
    1. Işık mikroskobu kullanarak farklılaşma kontrol edin: hücreler lipidler birikir, renk kahverengi-sarı ve daha küresel şeklinde açın.
      NOT: Tohumlu matrisler metabolik testler (örneğin, glikoz alımı testi, lipoliz testi, ORO), histoloji veya immünohistokimya (IHC) veya standart doku görüntüleme için kullanılabilir. Sabit doku ORO boyama ve görüntüleme için, sıvı azot ECM-adiposit örnekleri dondurmak.

8. Metabolik fenotipleme

  1. Taramalı elektron mikroskobu
    1. Örnekleri 25 °C'de Sorensen fosfat tamponundaki %2,5 glutaraldehit 12 saat. Postfix%1 osmium tetroksit içinde 4 °C'de 1 saat.
    2. Seri etanol örnekleri dehydrate. Yıkama hexamethyldisalizane, ve hava-kuru. Sonra kolloidal grafit ile taramalı elektron mikroskobu saplama üzerine monte. Kuru, ve altın ile fışkırtarak-ceket.
    3. Taramalı elektron mikroskobuyla görüntüleri yakalayın.
  2. Yağ Kırmızı-O Boyama
    1. Canlı Doku: Yağ Red-O Çözeltisi
      1. Pipetli kuyulardan dikkatlice ortam aspire edin. Daha sonra numuneleri her kuyuda 500 μL 1x PBS ile bir kez yıkayın.
      2. 25 °C'de steril deiyonize H2O'da %4 formalin 200 μL'lik numuneleri pipetle aspire edin, numuneleri her yıkamada 1x PBS (500°L) ile iki kez yıkayın.
      3. 25 °C'de %60 isopropanol numunesi 5 dk. Aspirasyon %60 isopropanol pipetle ekleyin.
      4. 5 dk. Aspire Yağı Red-O pipetle 25 °C'de Yağ Kırmızı-O çalışma çözeltisi ile leke örnekleri ve daha sonra 1x PBS (her yıkama 500 μL) ile 3x yıkama örnekleri. Sonra optik mikroskop ile görüntü.
    2. Sabit Doku: Yağ Kırmızı-O Leke Kiti
      1. Bir kriyostatüzerinde optimum kesme sıcaklığında (OCT) bileşik ve kesitte (5 μm) flash-freeze ECM-adiposit örnekleri.
      2. 2 dakika boyunca DI/H2O'da %85 propilen glikolde kaydırağı yerleştirin.
      3. 1 dakika boyunca Yağ Red-O boyama kitinden Modifiye Mayer's Hematoxylin slayt yerleştirin. DI/H2O ile iki kez kaydırak durula.
      4. Sulu montaj ortamı nı ve görüntüyü mikroskoba monte edin.
    3. QrtPCR için ECM'den RNA çıkarma
      NOT: RNA verimini en üst düzeye çıkarmak için, 100 μL'de 3 x 105 preadipocyte ile tohumlanmış 500 mg ECM parçaları kullanın ve kuyu başına 3 mL'lik Farklılaşma ortamında 6 kuyulu plakalarda yukarıdaki gibi ayırt edin.
      1. Farklılaştırıladıktan sonra, steril koplar kullanarak her bir ECM-adiposit örneğini buz üzerinde 50 mL konik bir tüpe aktarın.
      2. 500 μL Arabellek RLT ile boş iyice yıkayın. ECM-adiposit numunesi ile eşleşen 50 mL konik tüpe Tampon RLT ekleyin.
      3. Steril makas kullanarak, 50 mL konik tüp içinde her ECM-adiposit örnek ince kıyma, buz üzerinde tüp tutarken, doku kıyma konik tüp içine makas ekleme.
      4. Konik tüpler -80 °C'den 37 °C 3x'e kadar tamamen donup çözülür.
      5. Santrifüj konik tüpler 500 x g ve 4 °C 10 dk.
      6. Dikkatle bir pipet ile supernatant kaldırmak ve Bir Fibröz Doku RNA çıkarma Kiti ile RNA çıkarma için kullanmak (Malzeme Tablosu).
  3. Glikoz alımı tonu
    1. Yukarıda açıklandığı gibi 24 kuyulu plakalarda 0,5 mL farklılaşma ortamında 100 mg ECM parçalarında 6 x 104 preadipocyte ayırın (bölüm 5).
    2. 14 günlük farklılaşmadan sonra, orta yıkın ve 1x PBS ile bir kez ECM-adipositleri yıkayın. 37 °C'de 0,5 mL/kuyu Serum Açlık Orta ve kültür ve 12 saat için %5 CO2 ekleyin.
    3. 1x PBS ile orta ve yıkama hücrelerini iki kez çıkarın. PBS ve kültür de 0.5 mL / iyi% 2 BSA ekleyin 37 °C ve 5% CO2 için 2 saat.
    4. Hücreleri 1x PBS ile bir kez yıkayın, 200 nM insülin içeren veya olmayan 0,5 mL/kuyu 1x PBS ekleyin ve 40 dk boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    5. Aspire 1x PBS, 0,5 mL/iyi 1X PBS ilave 0.1 mM 2-deoksi-D-glukoz, 2 μCi/mL deoksi-D-glukoz, 2- [1,2-3H(N)], 200 nM insülin li veya olmadan ve 37 °C'de kuluçkaya yatın ve 40 dk için %5 CO2 kullanın. radyoaktif reaktifler ve atıklar, yerel kurumsal mevzuat tüzükleri tarafından zorunlu kılınan.
    6. Bir pipet ile orta çıkarın ve 1x PBS ile 3x hücreleri yıkayın. DI/H2O'ya %1'lik SDS çözeltisi ve güçlü pipetlemeli lyse hücreleri ekleyin. 10 dk için 25 °C kuluçka.
    7. Bradford protein tsay için her kuyudan 5 μL toplayın. Kalan hücre lisatının 400 μL'sini bir sintillasyon vialInde 2 mL'lik sintillasyon sıvısına aktarın. Sintillasyon sayacında 3H-2DG aktivitesi sayın. Proteinler, mg/mL'ye normalleştirilmiş dakika başına verileri analiz edin.
  4. Lipoliz istsonucu
    1. Yukarıda açıklandığı gibi, 100 mg ECM parçadaki 6 x 104 preadipocyte'yi 24 kuyulu plakalarda 0,5 mL insan farklılaştırma ortamında ayırt edin (bölüm 5).
    2. 14 günlük farklılaşmadan sonra orta ve yıkama hücrelerini sıcak 1x PBS ile iki kez yıkayın. 3 μM izoproterenol ile veya olmadan serum açlık ortamı (insülin olmadan) 0,5 mL ekleyin ve kültür adipositler 37 °C ve 5% CO2 72 saat için.
    3. -80 °C'de tayına hazır olana kadar saklanabilecek kültür süpernatantlarını toplayın. Veri normalleştirme için DNA niceliği için mikrosantrifüj tüplerde ECM toplayın.
    4. 96 kuyulu bir mikro plakaiçine her supernatant 2 μL Pipet. Trigliserid Tayin Kiti'nde verilen boşluklar (distile H2O) ve gliserol standart çözeltisi için rezerv kuyuları.
    5. Her kuyuya Trigliserid Tayin Kiti'nden 270 μL serbest gliserol reaktifi ekleyin, pipet karıştırın. 37 °C'de 5 dk kuluçka plakası.
    6. Mikroplaka spektrofotometrede 540 nm'de absorbansı ölçün.
    7. Gliserol konsantrasyonu hesaplamak ve ECM DNA ile normalleştirmek:

figure-protocol-19474

Sonuçlar

Yağ dokusu ECM hazırlanması, preadipocytes ile tohumlama, ve olgun adipositler içine in vitro farklılaşma protokol boyunca ilerleme görsel değerlendirme izin dokuaçık sıralı morfolojik değişiklikler ile sonuçlanır (Şekil 1) . ECM tohumlamak için kullanılan preadipocytes ayrı KDV örneklerinden kollajenaz sindirim kullanılarak izole edilir(Şekil 2). ECM-adiposit yapılarının her aşamasında taramalı elekt...

Tartışmalar

ECM-adiposit kültür modeli nihai doku fenotip dikte ECM ve hücrelerin bireysel rolleri diseksiyon için değerli bir araç sağlar. ECM izolasyon protokolü oldukça tekrarlanabilir, ancak hücredışılaştırma sürecinde değişkenlik görülebilir. Gün 3 delipidasyon adımı protokolde kritik bir noktadır. Gece çekimi tamamlandığında, matrisin delipidasyonu Polar Solvent Çözeltisi'nin sarıya dönmesiyle kanıtlanmalıdır, matris ise bozulmamış yağ dokusunun sarı-turuncu renk özelliğinden yarı sayd...

Açıklamalar

Yazarlar çakışan bir çıkar beyan etmezler.

Teşekkürler

Biz çalışma koordinasyonu ile yardım için Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa ve Retha Geiss teşekkür ederiz. SEM Michigan Üniversitesi Mikroskopi ve Görüntü Analiz Laboratuvarı Biyomedikal Araştırma Çekirdek Tesisi tarafından gerçekleştirildi. Bu proje NIH hibe R01DK097449 (RWO), R01DK1115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Gaziler İşleri Liyakat Hibe I01CX001811 (RWO), Pilot ve Fizibilite Hibe Michigan Diyabet Araştırma Merkezi (NIH Grant30-DK0205772), RWO (RWO) tarafından desteklenmiştir Gaziler İdaresi VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Michigan Üniversitesi Mikroskopi ve Görüntü Analiz Laboratuvarı Biyomedikal Araştırma Çekirdek Tesisi tarafından gerçekleştirilen taramalı elektron mikroskobu. Bu makalenin Şekil 4'ü ilk olarak Baker et al., J Clin Endo Metab 2017'de yayınlanmıştır; Mar 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915 ve Oxford University Press'in izni ile çoğaltıldı [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Bu materyali yeniden kullanmak için lütfen http://global.oup.com/academic/rights ziyaret edin.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTAGibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#25200056
1.5 mL cryovial tubeFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#02-682-557
10% Neutral Buffered FormalinVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#89370-094
100 µm nylon mesh filterCorning Inc., Corning, NY, USACat#352360
2-Deoxy-D-glucoseSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#D8375
2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#T6397
24-well tissue culture platesVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10861-700
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#I5879
96-well tissue culture platesVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10861-666
Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#15240062
BiotinSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#B4639
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#A8806
Buffer RLTQiagen, Hilden, GermanyCat#79216
CiglitizoneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#C3974
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USACat#NET328A250UC
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#D4513
DexamethasoneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#D4902
Dimethyl SulfoxideFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#BP231Flammable, caustic
Disodium EDTAFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#BP118
D-pantothenic acid hemicalcium saltSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#21210
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#11320033
EthanolDecon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USACat#DSP-MD.43Flammable
EVE Cell Counting Slides, NanoEnTekVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10027-446
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#10437028
GlutaraldehydeSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#G5882Caustic
HexamethyldisalizaneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#440191Flammable, caustic
Human insulin solutionSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#I9278
IsopropanolFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#A415Flammable
IsoproterenolSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#I5627Flammable
KClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S25484
KH2PO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#P5655
Lipase from porcine pancreas, type VI-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#L0382
MgSO4*7H2OSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#230391
Na2HPO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S5136
NaClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S3014
NaHCO3Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#S233
NH4ClFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#A661
Optimal cutting temperature (OCT) compoundAgar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UKCat# AGR1180
Oil Red-O Solution (ORO)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#O1391
Oil Red-O Stain KitAmerican Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USACat#KTORO-G
Osmium tetroxideSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#201030Caustic
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#93482Caustic
Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#SH3025601
Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-ASigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#R5125
RNAEasy Fibrous Tissue MiniKitQiagen, Hilden, GermanyCat#74704
Scintillation FluidFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#SX18
Scintillation Counter
Scissors, forceps, sterile
Sorensen's phosphate bufferThomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJCAS #: 10049-21-5
T-150 culture flaskVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10062-864
TaqMan Gene Expression Master MixThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#4369016
Temperature-controlled orbital shaker
Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube HomogenizerBenchmark ScientificCat#D1030
TransferrinSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#T3309
Triglyceride Determination KitSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#TR0100
Trypan blue stain, 0.4%VWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10027-446
Type II collagenaseGibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#17101015
Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mmSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#WHA5201150

Referanslar

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
  2. Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
  3. Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
  4. O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
  5. Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
  6. Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
  7. Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
  8. Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
  9. Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
  10. Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
  11. Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
  12. Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
  13. Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
  14. Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
  15. Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
  16. Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
  17. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  18. Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
  19. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
  20. Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
  21. Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
  22. O'Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
  23. Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
  24. Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 153adipositya dokusuh cre d matriksdiyabetglikoz al mobezite

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır