מערכת מרב התרבות Coculture מודל ריאות קשקש התקדמות קרצינומה

Summary

מערכת מודל מבחנה פותחה כדי ללכוד שינויים אדריכליים רקמה במהלך קרצינומה של הריאות קשקש (LUSC) התקדמות ב תלת מימדי (3D) שיתוף התרבות עם סרטן הקשורים פיברותקיעות (CAFs). מערכת זו אורגאיד מספק פלטפורמה ייחודית כדי לחקור את התפקידים של שונים תא הגידול הפנימי ושינויים חיצוניים לווסת את פנוטיפים הגידול.

Abstract

גידול-משתית אינטראקציות לשחק תפקיד קריטי בפיתוח של קרצינומה של הריאות קשקש (LUSC). עם זאת, הבנת האינטראקציות הדינמיות הללו תורמות לשינויים ברקמה האדריכלית שנצפתה במהלך הפעילות המאתגרת עקב חוסר המודלים המתאימים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הדור של מודל coculture 3D באמצעות תרבות התא הראשי LUSC המכונה TUM622. תאים TUM622 הוקמו מטופל lusc נגזר מבע שתל (pdx) ויש להם את המאפיין הייחודי ליצור מבנים כמו שכבתית כאשר נזרע בתוך מטריצה קרום המרתף. אנו להדגים כי TUM622 acini בתלת-ממד coculture תכונות מפתח של האדריכלות רקמה במהלך התקדמות LUSC, כמו גם את האינטראקציות דינמי בין תאים LUSC ורכיבים של מיקרוסביבה הגידול (TME), כולל מסחטות מטריקס (ECM) והתרופות הקשורות לסרטן (CAFs). אנו להתאים את פרוטוקול 3D העיקרי שלנו culturing כדי להדגים כיצד מערכת זו יכולה להיות מנוצל עבור ניתוח שונים במורד הזרם. בסך הכל, מודל זה אורגאיד יוצר פלטפורמה עשירה ביולוגית וישימה המאפשרת לקבל תובנה לתוך תא פנימי מנגנונים חיצוניים המקדמים את השיבוש של ארכיטקטורות אפיתל במהלך התקדמות קרצינומה ויסייע החיפוש אחר מטרות טיפוליות חדשות וסמני אבחון.

Introduction

סרטן ריאות הוא הגורם המוביל לתמותה הקשורות לסרטן ברחבי העולם. קרצינומה של תאי הקשקש (LUSC), שהוא הסוג השני הנפוץ ביותר של סרטן ריאות שאינו קטן תאים (NSCLC) וחשבונות עבור כ 30% של סרטן ריאות כל, מאובחנת לעתים קרובות בשלבים מתקדמים יש פרוגנוזה גרועה¹. אפשרויות טיפול עבור חולים lusc הם הצורך העיקרי קליניות שניתן לשפר על ידי הבנה טובה יותר של מנגנונים סלולריים ומולקולריים המשמש כונן lusc tumorigenesis.

כמו ברוב סוגי הסרטן האנושיים, הפתוגנזה של LUSC הוא מאופיין על ידי שיבוש של שלמות, היטב מסודרת רקמת אפיתל הרקמה². במהלך תהליך זה, הנכון apical-בסיס תא קוטביות, תא תא ואנשי הקשר מטריקס יאבדו, המתיר צמיחה בלתי מבוקרת התנהגות פולשנית של תאים סרטניים. עכשיו זה מוערך מאוד כי תכונות ממאירות של תאים סרטניים לא יכול להיות ביטוי ללא הקשר החשוב בין תאים סרטניים המקומי שלהם מיקרוסביבה הגידול (TME)³. רכיבי מפתח ב-TME כולל מטריצה החילוץ (ECM), סרטן הקשורים פיברותקיעות (CAFs), כמו גם תאים אנדותל וחדירה תאים חיסוניים באופן פעיל הצורה של TME וכוננים tuמוריגנזה⁴. עם זאת, ההבנה הנוכחית שלנו כיצד תאים סרטניים ורכיבים מרכזיים אלה ב TME אינטראקציה לכונן שינויים אדריכליים במהלך LUSC התקדמות היא מוגבלת מאוד.

תרבות תלת ממדית (3D) היא כלי חשוב כדי ללמוד את הפעילות הביולוגית של שינויים פנימיים בתאים וחיצוניים בוויסות שינויי אדריכלי רקמות ברקמות נורמלי וחולה⁵. התרבויות תלת-ממדיות מספקות את ההקשר המבני והפונקציונלי המתאים, החסר בדרך כלל בתרבויות דו-ממדיות מסורתיות (2D). הממדים הנוספים של מערכות כאלה לחקות מקרוב יותר רקמות בvivo בהיבטים רבים של פיזיולוגיה התא והתנהגויות סלולר, כולל התפשטות, בידול, הגירה, חלבון ביטוי ותגובה לטיפול בסמים. בשנים האחרונות, המאמצים של מעבדות שונות הובילו לפיתוח של מודלים 3d מחוץ גופית עבור ריאה רגילה כמו גם nsclc^6,7,8. עם זאת, מודל של קרצינומה של הריאות הקשקש שיכול ללכוד הן את שינויי הרקמה הדינמית של רקמות במהלך tuמוריגנזה, כמו גם לשלב רכיבי סטרומה מפתח לא היה זמין.

כאן, אנו מתארים את השיטות להקמת רומן תלת מימדי (3d) מערכת coculture באמצעות התאים הראשוניים pdx נגזר (נקרא TUM622) ו-כף s^9,10. הן TUM622 ו-CAFs נגזרות החולה NSCLC עם גידולים הבדיל גרוע¹⁰. כאשר מוטבעים כתאים בודדים ב-ECM, אוכלוסיית משנה נדירה של תאי TUM622 מעניקה את היכולת ליצור אורגנואידים עם מבנים דמויי-שכבתית המציגים קוטביות מתאימה של תא בסיס-apical. אלה מבנים כמו שכבתית הם hyperplastic, להציג ביטוי הטרוגנית של גזע כמו סמנים בידול דומה לגידול המקורי תוך שנותר לא פולשני, ובכך לחקות את השלב המוקדם ביותר של פיתוח LUSC. חשוב מכך, הראנו כי הארכיטקטורה רקמות של מבנים כמו שכבתית יכול להיות שונה על ידי עיכוב של תא-פנימי איתות מסלולים עם מעכבי מולקולה קטנה או תוספת של רכיבי מפתח ECM כגון CAFs, האחרון אשר מגביר את היווצרות acinar ועוד מעוררת acinar להיות פולשנית כאשר בסמיכות. יחד, נתונים אלה מראים כי מערכת זו שיתוף התרבות התלת-ממד של LUSC אורגנואידים מספק פלטפורמה רבת ערך עבור החקירה של הדדיות דינמי בין תאים LUSC ו TME יכול להיות מותאם עבור ניטור התגובה של תאי LUSC לטיפול בסמים¹¹.

Protocol

1. הפספ ו Culturing TUM622 תאים ו-CAFs בתרבויות דו-ממדיות

1. הTUM622 תאים מפני הזדקנות וculturing
   1. חם 3D בינוני התרבות ואת הדיסוציאציה של התא ריאגנטים (ראה טבלת חומרים) עבור TUM622 תאים ב 37 ° c.
   2. מעבר TUM622 תאים ב 80% שטף ב 2D מבחנות. בדרך כלל, זה קורה שבוע לאחר הפסנת.
   3. להיפטר המדיום הישן מ T75 תרמוס ולשטוף פעם עם 6 מ ל של מאגר HEPES. הימנע מליטוף ישירות על התאים.
   4. . ומתה את המאגר של הכלב הוסף 4 מ ל טריפסין/EDTA (0.25 mg/mL, ראה טבלה של חומרים) לשטיפה מהירה ולהשליך את טריפסין/edta.
   5. הוסף 2 מ ל טריפסין/EDTA ו-דגירה ב 37 ° c עבור 5 דקות. הסר מבחנות מן החממה ולהקיש על מבחנות כדי לשחרר את התאים מבלי ליצור בועות אוויר ולהחזיר צלוחיות לחממה עבור 5 דקות נוספות.
      הערה: חשיפה ממושכת לטריפסין תגרום לנזק הפיך בתאים ולשינוי פנוטיפ שלהם, ולכן מומלץ להגביל את תאי הזמן החשופים לטריפסין.
   6. אישור תאים התנתק מתחת למיקרוסקופ אור (4x או 10x). הוסף 4 מ ל של ניטרול מאגר (מאגר TNS) (ראה מידע מגיב תת-תרבות בטבלת החומרים) ואחריו 10 מ ל של מדיום תרבות תלת-ממד (ראה טבלת חומרים).
   7. הפיפטה מעלה-ומטה בעדינות כדי להמשיך ולנתק את התאים באמצעות צינורות של 10 מ ל. העבר את ההשעיה באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר לתוך צינורית חרוט 50 mL.
   8. ספירת מספרי תאים באמצעות מונה הומוציטוטומטר או תא אוטומטי.
   9. זרעי 0.8 x 10⁶ תאים/T75 בקבוקון 20 מ ל של בינונית תרבות תלת-ממדית (ראה טבלת חומרים).
   10. האכילו את התאים בכל יום אחר על-ידי החלפת חצי מהמדיום המושקע במדיום טרי.
2. הפסנות והזדקנות הקפה
   1. מעבר בקפה כאשר התאים מגיעים לשטף. בדרך כלל, זה מתרחש לאחר 5 ימים של culturing מ 1:2 לפצל.
   2. הכנת בינונית-קפה באמצעות בינוני RPMI הבסיס עם 20% חום מופעל סרום העובר, 1% L-גלוטמין ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין. חמם את המדיום עד 37 ° c.
   3. ב T75 בקבוקון, לשטוף את CAFs עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) פעם אחר כך להוסיף 2 מ ל טריפסין/EDTA ו דגירה ב 37 ° c עבור 5 דקות.
   4. להתבונן תחת מיקרוסקופ קל כדי להבטיח תאים הנתק בבקבוקון (4x או 10x). אם לא, להאריך את הדגירה של 2-3 מינימום אחר.
   5. לאחר תאים מנותקים והתנתק, להוסיף 10 מ ל של בינונית התרבות 3D לנטרל את טריפסין/EDTA ו פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להמשיך לנתק את ה-CAFs.
   6. העבר את ההשעיה התא לתוך שפופרת חרוט 50 mL ו ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   7. להיפטר supernatant ולהשעות את הגלולה בנפח מתאים של בינונית תרבות תלת-ממד (ראה טבלת חומרים) ומעבר לשתי מבחנות חדש T75.

2. ציפוי תאים TUM622 מטריצה מימדית עבור 3D בתפירה

1. יום לפני הניסוי, להפשיר את הבקבוקונים של מטריצת קרום המרתף במקרר 4 ° c בלילה. הרגעות פיפטות פלסטיק (2 מ ל) וטיפים ב-20 ° c ללילה.
   הערה: לא כל הרבה מטריקס קרום המרתף יש את אותה יכולת לתמוך בצמיחה 3D של תאים TUM622. לכן, יש צורך לרכוש ולבדוק מספר רב של מטריקס קרום המרתף כדי לזהות את אלה התומכים היווצרות acini חסון. בדרך כלל, זה דורש ריכוז חלבון גבוה יותר (16-18 mg/mL) במטריצה.
2. ביום הניסוי, מדיום התרבות התלת-ממדית החמה, מאגר ה-HEPES, טריפסין/EDTA וטריפסין ניטרול מאגר (TNS) באמבט מים ב37 ° c. מיד לפני הקמת התרבות, לקחת את המטריקס המוסדר ממברנה קרום המרתף מהמקרר ולשים את הבקבוקון על הקרח.
3. הרגעות את לוחיות התרבות רקמות על קריר פלטפורמת מתכת להציב על הקרח. מניחים צינורות צנטריפוגה על מתלה מתכת קירור על קרח.
4. שימוש בתאים TUM622 שהתקבלו משלב 1.1.7, לחשב את המספר הרצוי של תאים הדרושים לציפוי. בדרך כלל, 15000-30, בתאי 0000 נחוצים לכל טוב של צלחת 24. צפיפות נמוכה יותר מתאימה יותר עבור הדמיה וכימות, בעוד צפיפות גבוהה עדיפה בעת איסוף תאים עבור הפקת RNA או בלוק המערבי.
5. העברת תא הבולם לתוך צינור הצנטריפוגה מקורר (כל צינור המכיל תאים עבור ציפוי שלישיה) ו ספין למטה ב 300 x g בצנטריפוגה דלי תלוי ב 4 ° c עבור 5 דקות.
6. מנושף את הסופרנטנט בזהירות עם פיפטה מריר מוצמד לטיפ לא מסונן (20 μL), ועוזב כ-100 μL של המדיום בצינור (השתמש בסימונים בצינור כמדריך).
7. הקש בעדינות על הצד של הצינור להוציא והנתק את הגלולה לפני החזרתו למדף הקירור.
8. באמצעות 2 מ ל הפיפטות מקורר לערבב בעדינות את המטריצה על ידי ליטוף למעלה ולמטה כמה פעמים תוך שמירה על הבקבוקון במגע עם הקרח. פיפטה במהירות מתונה, כך ששום בועות לא הוכנסו לתוך המטריצה במהלך הליך זה.
9. להעביר את הנפח המתאים של המטריצה לתוך כל צינורית צנטריפוגה. לציפוי מטריליטים בצלחת 24-היטב, הוסיפו 1.1 מ ל של מטריצת קרום המרתף לכל צינור.
10. באמצעות עצות טרום מקורר, פיפטה את המטריצה בכל צינור למעלה ולמטה כ 10 פעמים כדי לבצע השעיה תא אחיד.
11. העברת 310 μL של תא/מטריצה השעיית לכל טוב של צלחת מקורר מראש 24-היטב. הפיפטה ממוקם בזווית 90 מעלות למשטח הצלחת וההשעיה התווספה למרכז הבאר. ההשעיה צריכה להתפשט ולכסות את כל הבאר ללא צורך להטות את הצלחת.
12. כדי להקל על ניתוח הזרם האנטי-מטריצות, צלחת ההשעיה של התא/מטריצה במקביל לתוך 2-היטב שקופיות קאמרית. העבר 100 μL של תא/מטריצה הבולם למרכז של באר של 2-היטב שקופית קאמרית (ראה טבלת חומרים). זה מאפשר למטריצה ליצור מבנה כמו כיפת עם נפח הרבה יותר קטן.
13. החזר את הצלחת ואת השקופית הקאמרית חזרה לתוך החממה תרבות רקמות ו הדגירה עבור 30 דקות כדי לאפשר את המטריצה כדי לגבש. בדוק את הלוח/השקופית תחת מיקרוסקופ קל כדי לוודא שתאים בודדים מופצים באופן שווה בתוך המטריצה (4x או 10x).
14. הוסף 1 מ ל של התרבות טרום מחומם 3D השלם בינוני לתוך כל טוב ו 1.5 mL של מדיום התרבות 3D לכל טוב של שקופית קאמרית ואז להחזיר אותם לחממה.

3.3D Coculturing של תאים TUM622 ו-כף s ב מטריקס מסחטות

1. הכינו את השעיות התאים של TUM622 ו-CAFs לפי סעיף 2.
2. לספור את צפיפות התא קפה על ידי לקיחת 10 μL של השעיית תא וערבוב זה עם 10 μL של טריפי כחול.
3. הוסף 10 μL של התערובת לכל אחד משני החדרים על hemacytometer כדי לספור ולחשב צפיפות התא.
   הערה: ל-CAFs יש צורות לא סדירות וייתכן שלא ייספרו במדויק על מונה תאים אוטומטי.
4. שיתוף TUM622 תאים ו-CAFs בתוך מטריצת קרום המרתף
   1. בהתבסס על מידע צפיפות התא, לחשב את המספר הרצוי של תאים המשמשים לציפוי. CAFs הם שנזרע ביחס 2:1 של תאים TUM622. לדוגמה, עבור 30,000 תאים TUM622 הזרע, 60,000 CAFs הם שיתוף מוטבע.
   2. העבר את הנפח המתאים של TUM622, כמו גם הבולם התא של CAFs לתוך שפופרת הצנטריפוגה אותו ובצע את השלבים 2.5-2.11 לציפוי לתוך לוחות 24-טוב. עבור אימונוoforas, העברת 60 μL של שילוב TUM622/CAFs לשקופיות קאמרית כמתואר בשלב 2.12).
5. Coculturing TUM622 עם מצופה כף s בתוך מטריצות קרום מרתף (ראה לוח חומרים)
   1. הגדר TUM622 מונו-תרבות בהתאם לשלבים 2.5-2.13.
   2. העבר פעמיים את מספר ההשעיה של CAFs (לעומת מספר התאים TUM622 הזרע) לתוך שפופרת צנטריפוגה ו ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. ומחדש את הקפה ב 1 מ ל של מדיום תרבות תלת-ממד.
   4. העבר את 1 mL של הבולם של CAFs היטב המכיל את התאים TUM622 מוטבעים.

4. קציר TUM622 Acini עבור RNA/חלבון חילוץ ומיון תאים פלואורסצנטית-פעיל (FACS)

1. הכנת מאגר לשטוף ומאגר קצירת תאים בהתאם לפרוטוקול ערכת הפיתוח של התא התלת-ממדי ביום הקודם ולצנן את הלילה ב -4 ° c.
2. לשמור לוחיות על מצנן צלחת וריאגנטים אחרים על הקרח לפני תחילת תהליך החילוץ.
3. שטפי מדיה מבארות תרבות תלת-ממדית מבלי לגעת במטריצה ולשטוף בעדינות את הבאר 3 פעמים עם 1 mL של מאגר לשטוף.
4. מטפי את השטיפה הסופית ומוסיפים 1 מ ל של מאגר קצירת תאים לכל באר.
5. השתמש בטיפ p1000 כדי לגרד את המטריצה מכל באר.
6. הפיפטה מעלה ומטה. כדי לנתק את המטריצה
7. העבר 1 mL של התערובת לצינור מקורר מראש של 15 מ"ל. הוסף עוד 1 mL של מאגר קציר לאותו הבאר.
8. חזור על שלבים 4.5-4.7, והעבר את כל התמהיל של אותו היטב לתוך 1 15 mL חרוט.
9. מכסה את הצינורות והסלע ב -4 ° c עבור 30 דקות.
10. ממלאים כל צינור עם הקרח קר PBS עד 10 מ ל ולאחר מכן צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
11. . מבלי לגעת בגלולה על הסופרנטאנט להכיל חלקי מטריקס, אך יש לאסוף את כל הספרואידים בתחתית הצינורית.
12. הוסיפו את הערוץ הקרח הקר. לשטיפה נוספת היפוך הצינור כמה פעמים כדי לנתק את הגלולה. ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות.
13. בזמן ספינינג, להכין מאגר לפירוק לחלבון ו-RNA אוסף.
14. הוסף בזהירות את supernatant ולהוסיף מאגר הליזה עבור עיבוד במורד הזרם לאסוף חלבון או RNA. לחילופין, ניתן להשעות תאים מחדש עבור ניתוח זרימה/מיון FACS או הפסעות סדרתית.

5. immunofluorescence של TUM622 Acini

1. הכנת מאגר אימונוללואוורנציה (אם מאגר: PBS עם 0.1% בסרום שור (BSA), 0.2% טריטון X-100 ו 0.05% רצף-20), מאגר חסימת ראשי (אם מאגר עם 10% הסרום עז), מאגר חסימה משני (מאגר חסימת ראשי עם 20 μg/mL₂עז נגד העכבר F (ab
2. שטוף בינוני מ 2-היטב שקופיות קאמרית, לשטוף פעם אחת עם PBS ולהגדיר את השקופית על מצנן לוחית מתכת על קרח. השקופית הקאמרית צריכה להישאר על מצנן המתכת לשארית הפרוטוקול.
3. הוסף טרום מקורר 4% כלייט כדי לתקן את acini ו דגירה על הקרח 20 דקות.
4. הסרת 4% בתחתית ולשטוף שלוש פעמים עם 2 מ ל של ה-PBS מקורר כל אחד עבור 5 דקות עם נדנדה עדין על הנדנדה.
5. מרוב הPBS והחדירות עם 1.5 mL של 0.5% טריטון X-100 ב-PBS (טרום מקורר) עבור 20 דקות. עד סוף הליך זה, מבנה כמו כיפת יהיה רופף.
6. הפחת בעדינות את מאגר החדירות מהשקופית הקאמרית כדי להימנע מאובדן דגימה. זה מושגת על ידי הוספת טיפ דק (20 μL) לתוך הפיפטה ולחיצה על הקצה לכיוון הפינה של החדר.
7. לרחוץ שלוש פעמים עם 2 מ ל של הPBS מקורר כל אחד עבור 5 דקות עם נדנדה עדין על הנדנדה.
8. חסום את המדגם עם מאגר החסימה העיקרי על הקרח עבור 1 h.
9. הסר מאגר חסימות ראשי והוסף מאגר חסימות משני וחסום עבור 30 דקות.
10. הוסיפו נוגדנים עיקריים במאגר החסימות הראשי ובמשך הלילה ב-4 ° c.
    הערה: ריכוז הנוגדנים המשמשים כאן צריך להיות גבוה יותר מאשר בדרך כלל בשימוש לצביעת תאים בתרבות דו-ממדית. רוב הנוגדנים העיקריים המשמשים במחקר זה מדולל ב 1:100 דילול (ראה לוח חומרים).
11. הסר נוגדנים ראשוניים ושטוף את המדגם 3 פעמים עם 2 מ ל של מאגר IF קר.
    הערה: הדגימות יכולות להיות משוחררות, לנקוט זהירות נוספת בעת הפחתת מייפת.
12. מודלת את הדגימות של נוגדנים משניים מדולל במאגר חסימת ראשי עבור 1 h ב RT. הנוגדנים המשניים המועדפת צריך להיות מאוד צולבות adsorbed כדי להפחית את כתמים ברקע. הנוגדנים המשניים ביותר בשימוש במחקר זה מדולל ב 1:200 דילול.
13. הסר נוגדנים משניים ושטוף את המדגם 3 פעמים עם 2 מ ל של מאגר IF קר.
    הערה: הדגימות יכולות להיות משוחררות, לנקוט זהירות נוספת בעת הפחתת מייפת.
14. הוסף את ה-PBS עם DAPI (1:1000 דילול) במהלך השטיפה האחרונה כדי להכתים את הגרעין. לבצע עוד 2 שוטפים ב-PBS.
15. התמונה הדגימות על מיקרוסקופ הקונמוקד בתוך 3 ימים.
    הערה: בשל גודל האורגנואידים והמגבלות במרחק העבודה של המטרה, הדגימות מוסיביות בדרך כלל בהגדלה של 10x או 20x.

6. הכנת דגימות תרבות תלת-ממדית לאימונוהיסטוכימיה

1. שטוף בינוני מ 2-היטב שקופיות קאמרית ולשטוף פעם אחת עם PBS.
2. לתקן את התרביות תלת-ממד ב 4% בכיוון כדור הבמה ב37 ° c.
3. הסרה של 4% כלפי מע, תרביות סראונד עם 2.5 מ ל של ג'ל לדוגמא היסטולוגיה (ראו טבלת חומרים) ומניחים את השקופית ב -4 ° c כדי לגבש לפחות 1 h.
4. דגימות העברה מוקפים ג'ל היסטולוגית לדוגמה לקלטות רקמות ומעובד במעבד מדגם ממוחשב לדגימת רקמה בלילה.
5. להטביע דגימות בשעווה פרפין ולהתכונן לכיוון¹².

7. בדיקת הרעלים הציטובית של 3D עבור הקרנה מורכבת (דוגמה עבור 1 96-ובכן צלחת)

1. הגדר צלחת 96-ובכן על מצנן צלחת, מאגר 25 מ ל על מצנן אגירה ו 15 מ ל שפופרות חרוט על קרח לפני תחילת הניסוי.
2. הכנת השעיות של מטריצת התאים של תאים TUM622 בשפופרת מלפני מקורר 15 מ"ל פוליפרופילן באמצעות הוספת הנפח המתאים של מטריצת קרום המרתף לתאים. הצפיפות הרצויה עבור TUM622 תאים הוא 10,000 תאים לכל 70-75 μL של מטריצה קרום המרתף. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לאפשר אפילו ערבוב של תאים בתוך המטריצה.
3. הזז את הצלחת עם צידנית צלחת ומאגר עם קריר מאגר הרחק מהקרח אל משטח יבש כדי להימנע ממגע של מטריקס קרום המרתף עם קרח במהלך ההעברה.
4. העבר את תערובת התא מטריצה למאגר קירור מבלי ליצור בועות.
5. באמצעות הצנרת מכני רב-ערוצי (10-300 μL), העברה 70-75 μL של התאים לערבב לתוך כל טוב המתאים של הצלחת 96-באר.
6. הצלחת דגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO₂ עבור 30 דקות עבור מטריצת קרום המרתף כדי לגבש.
7. הוסף 100 μL של מדיה בכל השורות והחזר את הצלחת לחממה.
8. התחל במינון מורכב ביום הבא או במועד מאוחר יותר, בהתאם למטרת הניסוי.
9. Spheroids ניתן להאכיל מחדש מחדש כל 2-3 ימים עד 10 ימים, על ידי הסרת מדיה בילו עם 8-או 12-היטב ואקום והחלפה עם מדיה טרייה עם או בלי תרכובות רצויות.
10. מספר TUM622 spheroids יכול להיות כימות באמצעות 3d צמידה בהתאם לפרוטוקול של היצרן.

תוצאות

TUM622 ו-CAFs בתרבות הדו
איור 1 מציג את המבנה האופייני של תאים TUM622 ו-cafs בתרבות הדו-ממדית. תאים TUM622 מעוגלים עם גרעינים גדולים בעוד CAFs הם שטוחים מוארך. TUM622 תאים יכולים להגיע ל-80%-90% שליטה בתרבות. התפשטות נוספת מובילה ליותר, אך תאים קטנים הצבורים במושבות שא...

Discussion

גידולים הם רקמות הטרוגנית מורכב של תאים סרטניים הקיימים זה לצד זה עם תאים סטרומה כגון סרטן הקשורים פיברותקיעות, תאים אנדותל ותאים חיסוניים בתוך ECM. יחד, אלה רכיבים מגוונים לחצות לדבר ולהשפיע על מיקרוסביבה הגידול, משחק תפקיד פעיל בנהיגה tuמוריגנזה, תהליך הכרוך שינויים מתקדמים בארכיטקטורת ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bronchial Epithelial Growth Medium	Lonza	CC-3170	BEGM
Cell Strainer 40um	ThermoFisher	352340	For passing TUM622 cells
Cleaved Caspase 3 antibody	Cell Signaling Technology	9661 (RRID:AB_2341188)	Rabbit
CoolRack CFT30	Biocision	BCS-138	For 3D culture
CoolSink XT96F	Biocision	BCS-536	For 3D culture
Cultrex 3D Cell Harvesting Kit	Bio-Techne	3448-020-K
Cultrex (preferred for co-culture)	Bio-Techne	3443-005-01	For 3D culture
CXCR4 antibody	Abcam	Ab124824 (RRID:AB_10975635)	Rabbit
E-cadherin antibody	BD Biosciences	610182 (RRID:AB_397581)	Mouse
GelCount	Oxford Optronix		For Acini counts and measurements
GM130 antibody	BD Biosciences	610822 (RRID:AB_398141)	Mouse
Goat Serum	Vector Labs	S1000 (RRID:AB_2336615)	For Immunofluorescence
Heat-inactivated FBS	Gibco	10082-147	For CAFs
Histology sample gel	Richard Allan Scientific	HG-4000-012	For Immunofluorescence
Integrin alpha 6 antibody	Millipore Sigma	Mab1378 (RRID:AB_2128317)	Rat
Involucrin antibody	Abcam	Ab68 (RRID:AB_305656)	Mouse
Ki67 antibody	Abcam	Ab15580 (RRID:AB_443209)	Rabbit
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System	Nalge Nunc International	155379 (2)	For 3D culture
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System	Nalge Nunc International	155409 (8)	For 3D culture
L-Glutamine	Gibco	25030-081	For CAFs
Matrigel (preferred for mono-culture)	Corning	356231	For 3D culture
p63 antibody	Cell Signaling Technology	13109 (SRRID:AB_2637091)	Rabbit
Pen/Strep	Gibco	15140-122	For CAFs
ReagentPack Subculture Reagents	Lonza	CC-5034	For TUM622 cell dissociation
RPMI	ThermoFisher	11875-093	For CAFs
Sox2 antibody	Cell Signaling Technology	3579 (RRID:AB_2195767)	Rabbit
TrypLE Express	Gibco	12604-021	For CAF dissociation
Vi-Cell	Bechman Coulter		Automatic cell counter
Vimentin antibody	Abcam	Ab92547 (RRID:AB_10562134)	Rabbit
β-catenin antibody	Cell Signaling Technology	2677s (RRID:AB_1030943)	Mouse