Многомерная система кокультуры для моделирования плоского квадроцикла Прогрессирование карциномы

Резюме

Система модели in vitro была разработана для захвата архитектурных изменений тканей при плоской карциноматической карциномате легких (LUSC) прогрессии в трехмерной (3D) совместной культуре с связанными с раком фибробластами (CAFs). Эта органоидная система обеспечивает уникальную платформу для изучения роли различных опухолевых клеток, интродуцированных и насущных изменений, которые модулируют фенотип опухоли.

Аннотация

Опухолево-стромноговые взаимодействия играют решающую роль в развитии плоской карциномы легких (LUSC). Однако понимание того, как эти динамические взаимодействия способствуют изменениям в области архитектуры, наблюдаемым во время опухолевого генеза, остается сложным из-за отсутствия соответствующих моделей. В этом протоколе мы описываем генерацию 3D-модели кокультуры с использованием культуры первичных клеток LUSC, известной как TUM622. Tum622 клетки были созданы из LUSC пациента полученных ксенотрансплантат (PDX) и имеют уникальное свойство формировать ацинар-подобных структур, когда семенами в подвале мембраны матрицы. Мы демонстрируем, что TUM622 acini в 3D-кокультуре переизглашает ключевые особенности архитектуры тканей во время прогрессии LUSC, а также динамические взаимодействия между клетками LUSC и компонентами микроокружения опухоли (TME), включая внеклеточные матрицы (ECM) и связанные с раком фибробласты (CAFs). Мы также адаптируем наш основной 3D культивирование, чтобы продемонстрировать, как эта система может быть использована для различных анализов ниже по течению. В целом, эта органоидная модель создает биологически богатую и адаптируемую платформу, которая позволяет получить представление о клеточных и внутренних механизмов, которые способствуют нарушению эпителиальной архитектуры во время прогрессирования карциномы и помогут поиск новых терапевтических целей и диагностических маркеров.

Введение

Рак легких является основной причиной смертности, связанной с раком во всем мире. Карцинома легких плоскоклеточной (LUSC), которая является вторым наиболее распространенным типом немелкоклеточного рака легких (NSCLC) и составляет примерно 30% всех раковых заболеваний легких, часто диагностируется на поздних стадиях и имеет плохой прогноз¹. Варианты лечения для пациентов LUSC являются одной из основных неудовлетворенных потребностей, которые могут быть улучшены путем лучшего понимания основных клеточных и молекулярных механизмов, которые управляют LUSC опухолевого.

Как и в большинстве случаев рака человека, патогенез LUSC характеризуется нарушением нетронутыми, хорошо упорядоченной эпителиальной ткани архитектуры². В ходе этого процесса утрачены надлежащие атикально-базальные клеточные полярности, клеточные клетки и клеточные матричные контакты, что позволяет неконтролируемый рост и инвазивное поведение опухолевых клеток. В настоящее время широко ценится, что злокачественные особенности раковых клеток не могут проявляться без важного взаимодействия между раковыми клетками и их местной микросредой опухоли (TME)³. Ключевые компоненты в TME, включая внеклеточной матрицы (ECM), связанные с раком фибробласты (ЦАФ), а также эндотелиальные клетки и инфильтрации иммунных клеток активно формируют TME и диски tumorigenesis⁴. Тем не менее, наше текущее понимание того, как опухолевые клетки и эти ключевые компоненты в TME взаимодействуют, чтобы управлять тканевыми архитектурными изменениями во время прогрессии LUSC, очень ограничено.

Трехмерная (3D) культура является важным инструментом для изучения биологической активности клеточных и насущных изменений в регулировании архитектурных изменений тканей как в нормальных, так и в болезненных тканях⁵. 3D культуры обеспечивают соответствующий структурный и функциональный контекст, который обычно отсутствует в традиционных двухмерных (2D) культур. Дополнительные размеры таких систем более точно имитируют ткани in vivo во многих аспектах физиологии клеток и клеточного поведения, включая пролиферацию, дифференциацию, миграцию, экспрессию белка и реакцию на медикаментозное лечение. В последние годы усилия различных лабораторий привели к разработке в пробирке 3D-моделей как для обычных^{легких,}так и для NSCLC^6,7,,8. Тем не менее, модель плоской карциномы легких, которая может резюмировать как динамические архитектурные изменения ткани во время опухолевого, а также включить ключевые стромальные компоненты был недоступен.

Здесь мы описываем методы создания новой 3-мерной (3D) системы сокультуры с использованием первичных PDX-производных клеток LUSC (термин TUM622) и CAFs^9,10. Оба TUM622 и CAFs являются производными от NSCLC пациента с плохо дифференцированных опухолей¹⁰. При встраиваемых в себя в качестве одиночных клеток в ECM, редкая субпопуляция клеток TUM622 имеет возможность формировать органоиды с ацинар-подобными структурами, которые отображают надлежащее атикально-базальной полярности клеток. Эти ацинар-подобные структуры гиперпластичны, демонстрируют неоднородное выражение стволовых и дифференциационных маркеров, похожих на исходную опухоль, оставаясь при этом неинвазивными, и таким образом имитируют самую раннюю стадию развития LUSC. Важно отметить, что мы показали, что архитектура тканей ацинаровоподобных структур может быть изменена путем ингибирования клеточных сигнальных путей с помощью мелких молекулных ингибиторов или добавления ключевых компонентов в ECM, таких как ЦАФы, последний из которых усиливает образование ацини и еще больше провоцирует ацини стать инвазивными, когда в непосредственной близости. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что эта 3D-система сокультуры органоидов LUSC является ценной платформой для исследования динамической взаимности между клетками LUSC и TME и может быть адаптирована для мониторинга реакции клеток LUSC на медикаментозное лечение^11.

протокол

1. Пропускные и культивирование TUM622 ячеек и CAFs в 2D-культурах

1. Пропуск и культивирование клеток TUM622
   1. Теплый 3D культуры средних и клеточных реагентов диссоциации (см. Таблица материалов) для TUM622 клеток при 37 градусов по Цельсию.
   2. Прохождение TUM622 клеток при 80% вниски в 2D колбах. Как правило, это происходит через неделю после прохождения.
   3. Откажитесь от старой среды из колбы T75 и вымойте один раз с 6 мл буфера HEPES. Избегайте пиптинг непосредственно на клетки.
   4. Аспирируй буфер HEPES. Добавьте 4 мл трипсина/ЭДТА (0,25 мг/мл, см. Таблицу Материалов) для быстрого промывки и отбросьте трипсин/ЭДТА.
   5. Добавьте 2 мл трипсина/ЭДТА и инкубируйте при 37 градусах По 5 мин. Удалите фляги из инкубатора и коснитесь колбы, чтобы ослабить клетки, не создавая пузырьков воздуха и возвращайте фляги в инкубатор еще на 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное воздействие трипсина необратимо повредит клетки и изменить их фенотип, таким образом, рекомендуется ограничить время клетки подвергаются трипсин.
   6. Подтвержденные клетки отделились и отделились под легким микроскопом (4x или 10x). Добавьте 4 мл буфера нейтрализации (буфер TNS) (см. информацию о реагентах субкультуры в таблице материалов),за которым следуют 10 мл 3D-культуры (см. Таблица материалов).
   7. Пипетка вверх-вниз осторожно, чтобы еще больше разъединить клетки с помощью 10 мл пипетки. Перенесите подвеску через 40 мкм-ситечко в коническую трубку мощностью 50 мл.
   8. Подсчитайте номера клеток с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
   9. Семена 0,8 х 10⁶ ячеек/T75 колба в 20 мл 3D-культуры среды (см. Таблица материалов).
   10. Кормите клетки через день, заменяя половину отработанного носителя свежей средой.
2. Пропускные и культивирование ЦАФов
   1. Проходные CAFs, когда клетки достигают спущенности. Обычно это происходит после 5 дней культивирования от 1:2 раскола.
   2. Подготовка каф-среде с использованием базальной среды RPMI с 20% теплоинактивированной сывороткой крупного рогатого скота плода, 1% L-глютамина и 1% пенициллина/стрептомицина. Разогрейте среднюю до 37 градусов по Цельсию.
   3. В колбе T75, промыть CAFs с фосфат-буфером сольника (PBS) один раз добавить 2 мл трипсина / EDTA и инкубировать при 37 КС в течение 5 мин.
   4. Наблюдайте под светлым микроскопом для того чтобы обеспечить клетки разъединять в колбе (4x или 10x). Если нет, продлите инкубацию еще на 2-3 мин.
   5. После того, как клетки отделились и разобщены, добавьте 10 мл 3D-культуры среды, чтобы нейтрализовать трипсин/EDTA и пипетку вверх и вниз несколько раз, чтобы еще больше разъединить ЦАФы.
   6. Перенесите суспензию клетки в коническую трубку 50 мл и снесите вниз при 300 х г в течение 5 минут при комнатной температуре.
   7. Отбросьте супернатант и отразите гранулы в соответствующем объеме 3D-культуры среды (см. Таблица материалов)и перейти в две новые фляги T75.

2. Покрытие TUM622 клеток в внеклеточной матрице для 3D Культирования

1. За день до эксперимента, оттепель флаконы подвалм мембранной матрицы в холодильнике 4 кВ ночь. Охладить пластиковые пипетки (2 мл) и наконечники при -20 градусов на ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не все много подвальной мембранной матрицы имеют одинаковую способность поддерживать 3D рост клеток TUM622. Таким образом, необходимо приобрести и протестировать несколько партий подвальной мембранной матрицы, чтобы определить те, которые поддерживают надежное образование ацини. Как правило, это требует более высокой концентрации белка (16-18 мг/мл) в матрице.
2. В день эксперимента, теплая 3D-культура среды, HEPES буфер, трипсин / EDTA и трипсин нейтрализации буфера (TNS) в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Непосредственно перед настройкой культуры, принять оттаяла подвал мембраны матрицы из холодильника и положить флакон на лед.
3. Охлаждение тканевых культурных пластин на металлической платформе кулер размещены на льду. Поместите центрифуги на металлическую стойку охлаждения на льду.
4. Используя клетки TUM622, полученные с шага 1.1.7, вычислите нужное количество ячеек, необходимых для покрытия. Как правило, 15000-300000 клеток необходимы на колодец 24-хорошо пластины. Более низкая плотность больше подходит для визуализации и количественной оценки, в то время как более высокая плотность предпочтительнее при сборе клеток для экстракции РНК или западного промотирования.
5. Перенесите суспензию клеток в охлажденный центрифуговый трубку (каждая трубка, содержащая клетки для тройного умыкают) и вращайтесь вниз при 300 х г в висячей центрифуге в вешалом ведре при 4 кв кв 5 мин.
6. Тщательно аспирируйте супернатант с помощью аспирирующей пипетки, прикрепленной к нефильтрованного наконечника (20 кЛ), оставляя в трубке около 100 зл. м/с (использовать маркировку на трубке в качестве направляющего руководства).
7. Аккуратно нажмите на стороне трубки, чтобы выбить и разъединить гранулы, прежде чем вернуть его в стойку охлаждения.
8. Используя 2 мл предварительно охлажденных пипетки, аккуратно перемешать матрицу, труба вверх и вниз несколько раз, сохраняя флакон в контакте со льдом. Пипетка на ровной и умеренной скорости, так что никакие пузырьки не вводятся в матрицу во время этой процедуры.
9. Перенесите соответствующий объем матрицы в каждую центрифужную трубку. Для покрытия трипликетов в 24-хорошая пластина, добавить 1,1 мл подвала мембранной матрицы для каждой трубки.
10. Используя предварительно охлажденные наконечники, пипетка матрицы в каждой трубке вверх и вниз около 10 раз, чтобы сделать однородную подвеску ячейки.
11. Передача 310 л клеточной/матричной подвески в каждую скважину предварительно охлажденной 24-хорошо пластины. Пипетка помещается под углом 90 градусов к поверхности пластины, а подвеска добавляется к центру колодца. Подвеска должна распространяться и покрывать весь колодец без необходимости наклона пластины.
12. Для облегчения анализа иммунофлуоресценции ниже по течению, пластины ячейки / матричной подвески параллельно в 2-хорошо камерных слайдов. Передача 100 Зл клеточной/матричной подвески в центр скважины 2-колодца камерного слайда (см. Таблица материалов). Это позволяет матрице образовывать куполообразную структуру с гораздо меньшим объемом.
13. Вернуть пластину и камеры слайд обратно в ткани культуры инкубатора и инкубировать в течение 30 минут, чтобы матрица затвердеть. Изучите пластину/слайд под световым микроскопом, чтобы убедиться, что отдельные клетки равномерно распределены по матрице (4x или 10x).
14. Добавьте 1 мл предварительно разогретой 3D-культуры полной среды в каждую скважину и 1,5 мл 3D культуры среды к каждой скважине камеры слайд затем вернуть их в инкубатор.

3. 3D Coculturing TUM622 клеток и CAFs во внеклеточной матрице

1. Подготовка клеточных суспензий TUM622 и CAFs в соответствии с разделом 2.
2. Подсчитайте плотность клеток CAF, взяв 10 зл клеточной подвески и смешав ее с 10 ЗЛ трипан синего цвета.
3. Добавьте 10 юл смеси к каждой из двух камер на гемаситометре, чтобы подсчитать и рассчитать плотность клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: CAFs имеют неправильные формы и не могут быть точно подсчитаны на автоматическом счетчике ячейки.
4. Совместное встраивание TUM622 клеток и CAFs в матрицу мембран ывальное полотно
   1. На основе информации о плотности клеток вычислите нужное количество ячеек, используемых для покрытия. ЦАО посеяны в соотношении 2:1 от клеток TUM622. Например, для 30 000 посеянных TUM622 ячеек 60 000 ЦАФов со-встроены.
   2. Перенесите соответствующий объем TUM622, а также подвеску ячейки CAFs в ту же центрифугу трубки и выполните шаги 2,5-2,11 для покрытия в 24-колодцевые пластины. Для иммунофлуоресценции, передача 60 Л TUM622/CAFs смешивать на камерные слайды, как описано в шаге 2.12).
5. Coculturing TUM622 с накладными CAFs в матрице мембраны подвала (см. Таблица материалов)
   1. Настройка монокультуры TUM622 по шагам 2.5-2.13.
   2. Перенесите в два раза больше подвески CAFs (по сравнению с количеством посеянных TUM622 ячеек) в центрифужную трубку и снесите вниз при температуре в 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   3. Приспособите супернатант и повторно остановите CAFs в 1 мл 3D-культуры среды.
   4. Перенесите 1 мл подвески CAFs в скважину, содержащую встроенные клетки TUM622.

4. Сбор урожая TUM622 Acini для экстракции РНК/белка и флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS)

1. Подготовьте буфер для мытья и буфер сбора ячеек в соответствии с протоколом сбора 3D-клеток накануне и охладите на ночь при 4 градусах Цельсия.
2. Держите пластины на пластине кулер и другие реагенты на льду, прежде чем начать процесс извлечения.
3. Аспирные носители из 3D-культурных колодцев, не касаясь матрицы, и аккуратно промойте колодец 3 раза 1 мл буфера для мытья.
4. Прибавьте к окончательной стирке и добавьте 1 мл буфера сбора клеток к каждой скважине.
5. Используйте p1000 пипетка отзыв, чтобы соскребать матрицу от каждого колодца.
6. Пипетка вверх и вниз, чтобы еще больше разъединить матрицу.
7. Перенесите 1 мл смеси в предварительно охлажденный конической трубке 15 мл. Добавьте еще 1 мл буфера для сбора урожая в тот же колодец.
8. Повторите шаги 4.5-4.7, и перенесите всю смесь одной и той же и той же и в одну коническую трубку 15 мл.
9. Крышка труб и рок на 4 КК в течение 30 мин.
10. Заполните каждую трубку ледяной PBS до 10 мл, а затем центрифуги на 300 х г в течение 5 минут при 4 градусах По Цельсия.
11. Пусть же придав себя супернатанта, не касаясь гранул. Супернатан должен содержать фрагменты матрицы, но все сфероиды должны быть собраны в нижней части трубки.
12. Добавьте ледяной PBS для второй стирки. Перевернуть трубку несколько раз, чтобы разъединить гранулы. Спин вниз на 300 х г в течение 5 мин.
13. Во время вращения, подготовить лисис буфер для белка и РНК сбора.
14. Тщательно аспирировать супернатант и добавить буфер лиза для обработки ниже по течению для сбора белка или РНК. Кроме того, ячейки могут быть переприкованы для анализа потока /сортировки FACS или последовательного пропуска.

5. Иммунофлуоресценция TUM622 Ачини

1. Подготовка буфера иммунофлуоресценции (БУФЕР IF: PBS с 0,1% бычьего сыворотки альбумина (BSA), 0,2% Triton X-100 и 0,05% Tween-20), первичный блокирующий буфер (буфер IF с 10% козьей сывороткой), вторичный блокирующий буфер (первичный буфер блокировки с 20 мкг/мл козла против мыши F.ab))₂)
2. Аспир среды из 2-колодец камерных слайдов, промыть один раз с PBS и установить слайд на металлической пластины кулер на льду. Камера слайд должен оставаться на металлической пластины кулер для остальной части протокола.
3. Добавить предварительно охлажденный 4% PFA, чтобы исправить ацини и инкубировать на льду в течение 20 минут.
4. Удалить 4% PFA и мыть три раза с 2 мл предварительно охлажденных PBS каждый в течение 5 минут с нежным качания на рокер.
5. АспирpbS и permeabilize с 1,5 мл 0,5% Тритон X-100 в PBS (предварительно охлажденный) в течение 20 минут. К концу этой процедуры куполоподобная структура станет рыхлой.
6. Аккуратно аспирируйте буфер permeabilization от слайда камеры, чтобы избежать потери образца. Это достигается путем добавления тонкого наконечника (20 л) к успокоительной пипетке и нажатия кончика к углу камеры.
7. Вымойте три раза с 2 мл предварительно охлажденных PBS каждый в течение 5 минут с нежным качания на рокер.
8. Заблокируйте образец основным блокирующим буфером на льду в течение 1 ч.
9. Удалите первичный блокирующий буфер и добавьте вторичный блокирующий буфер и заблокируйте в течение 30 минут.
10. Добавить первичные антитела в первичный блокирующий буфер и инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация антител, используемых здесь должна быть выше, чем обычно используется для окрашивания клеток в 2D-культуре. Большинство первичных антител, используемых в этом исследовании, разбавляются при 1:100 разбавления (см. Таблица материалов).
11. Удалить первичные антитела и вымыть образец 3 раза с 2 мл холодного буфера ЕСЛИ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть свободными, принимать дополнительную осторожность при успомывке.
12. Инкубировать образцы во вторичных антителах, разбавленных в первичном блокирующем буфере на 1 ч на RT. Предпочтительные вторичные антитела должны быть сильно перекрестными адсорсингами, чтобы уменьшить фоновое окрастраивание. Большинство вторичных антител, используемых в этом исследовании разбавляются при 1:200 разбавления.
13. Удалите вторичные антитела и промойте образец 3 раза с 2 мл холодного буфера ЕСЛИ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть свободными, принимать дополнительную осторожность при успомывке.
14. Добавить PBS с DAPI (1:1,000 разбавления) во время последней стирки, чтобы испачкать ядро. Выполнить еще 2 смеет в PBS.
15. Изображение образцов на конфокальный микроскоп в течение 3 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за размера органоидов и ограничений в рабочем расстоянии цели, образцы, как правило, изображения на 10x или 20x увеличение.

6. Подготовка 3D образцов культуры для иммуногистохимии

1. Аспир среды из 2-колодец камерных слайдов и промыть один раз с PBS.
2. Исправить 3D культур в 4% PFA на 37 градусов по Цельсию в одночасье.
3. Удалите 4% ПФА, объемные культуры с 2,5 мл гистологии образец геля (см. Таблица материалов) и место слайд на 4 кв С, чтобы затвердеть, по крайней мере 1 ч.
4. Передача образцов, окруженных гистологическим гелем образца, на тканевые кассеты и обработанных в автоматизированном процессоре образца ткани на ночь.
5. Вставлять образцы в парафиновый воск и готовиться к сечению¹².

7. 3D Анализ цитотоксичности для скрининга соединения (Пример для одной 96-хорошо плиты)

1. Установите 96-колодчатую пластину на плиту кулер, резервуар 25 мл на резервуаре кулер и 15 мл конических труб на льду перед началом эксперимента.
2. Подготовка клеточной матричной суспензии tum622 клеток в предварительно охлажденной 15 мл полипропиленовой конической трубки, добавив соответствующий объем подвальной мембранной матрицы в клетки. Пожеланная плотность для tum622 клеток составляет 10 000 клеток на 70-75 л мембранной матрицы. Пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы позволить даже смешивания клеток в матрице.
3. Переместите пластину с плитой кулер и резервуар с резервуаром кулер от льда на сухую поверхность, чтобы избежать контакта подвала мембранной матрицы со льдом во время передачи.
4. Перенесите смесь матричных клеток в охлаждающий резервуар, не создавая пузырьков.
5. Используя механический многоканальный пипетк (10-300 л), перенесите 70-75 л клеток смеси в каждую соответствующую скважину 96-хорошей пластины.
6. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия и 5% CO₂ в течение 30 мин для оболочки мембраны в подвале, чтобы затвердеть.
7. Добавьте 100 л носителей во всех рядах и верните пластину в инкубатор.
8. Начните дозировку соединения на следующий день или позже в зависимости от цели эксперимента.
9. Сфероиды могут быть повторно скормлены и повторно дозируются каждые 2-3 дня в течение 10 дней, путем удаления отработанных носителей с 8- или 12-хорошо вакуума многообразия и замены со свежими средствами массовой информации с или без желаемых соединений.
10. Количество сфероидов TUM622 можно количественно определить с помощью 3D-изображения в соответствии с протоколом производителя.

Результаты

TUM622 и CAFs в 2D-культуре
На рисунке 1 представлена типичная морфология клеток TUM622 и CAFs в 2D-культуре. Клетки TUM622 округлены большими ядрами, в то время как ЦАО плоские и удлиненные. Tum622 клетки могут достигать 80%-90% стоек в культуре. Дальнейшее распрос...

Обсуждение

Опухоли являются неоднородными тканями, состоящими из раковых клеток, сосуществующих бок о бок со стромальными клетками, такими как связанные с раком фибробласты, эндотелиальные клетки и иммунные клетки в ECM. Вместе эти разнообразные компоненты перекрестного разговора и влияния на ми?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bronchial Epithelial Growth Medium	Lonza	CC-3170	BEGM
Cell Strainer 40um	ThermoFisher	352340	For passing TUM622 cells
Cleaved Caspase 3 antibody	Cell Signaling Technology	9661 (RRID:AB_2341188)	Rabbit
CoolRack CFT30	Biocision	BCS-138	For 3D culture
CoolSink XT96F	Biocision	BCS-536	For 3D culture
Cultrex 3D Cell Harvesting Kit	Bio-Techne	3448-020-K
Cultrex (preferred for co-culture)	Bio-Techne	3443-005-01	For 3D culture
CXCR4 antibody	Abcam	Ab124824 (RRID:AB_10975635)	Rabbit
E-cadherin antibody	BD Biosciences	610182 (RRID:AB_397581)	Mouse
GelCount	Oxford Optronix		For Acini counts and measurements
GM130 antibody	BD Biosciences	610822 (RRID:AB_398141)	Mouse
Goat Serum	Vector Labs	S1000 (RRID:AB_2336615)	For Immunofluorescence
Heat-inactivated FBS	Gibco	10082-147	For CAFs
Histology sample gel	Richard Allan Scientific	HG-4000-012	For Immunofluorescence
Integrin alpha 6 antibody	Millipore Sigma	Mab1378 (RRID:AB_2128317)	Rat
Involucrin antibody	Abcam	Ab68 (RRID:AB_305656)	Mouse
Ki67 antibody	Abcam	Ab15580 (RRID:AB_443209)	Rabbit
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System	Nalge Nunc International	155379 (2)	For 3D culture
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System	Nalge Nunc International	155409 (8)	For 3D culture
L-Glutamine	Gibco	25030-081	For CAFs
Matrigel (preferred for mono-culture)	Corning	356231	For 3D culture
p63 antibody	Cell Signaling Technology	13109 (SRRID:AB_2637091)	Rabbit
Pen/Strep	Gibco	15140-122	For CAFs
ReagentPack Subculture Reagents	Lonza	CC-5034	For TUM622 cell dissociation
RPMI	ThermoFisher	11875-093	For CAFs
Sox2 antibody	Cell Signaling Technology	3579 (RRID:AB_2195767)	Rabbit
TrypLE Express	Gibco	12604-021	For CAF dissociation
Vi-Cell	Bechman Coulter		Automatic cell counter
Vimentin antibody	Abcam	Ab92547 (RRID:AB_10562134)	Rabbit
β-catenin antibody	Cell Signaling Technology	2677s (RRID:AB_1030943)	Mouse