肺扁平上皮癌進行をモデル化する多次元共培養システム

要約

肺扁平上皮癌(LUSC)進行中の組織構造変化を、がん関連線維芽細胞(CAF)との3次元(3D)共培養で捉えるin vitroモデルシステムが開発されました。このオルガノイドシステムは、腫瘍表現型を調節する多様な腫瘍細胞内および外因性変化の役割を調査するためのユニークなプラットフォームを提供する。

要約

腫瘍-ストロマ相互作用は、肺扁平上皮癌(LUSC)の発症に重要な役割を果たす。しかし、これらの動的相互作用が腫瘍形成中に観察された組織の建築変化にどのように寄与するかを理解することは、適切なモデルがないため依然として困難である。本プロトコルでは、TUM622として知られるLUSC一次細胞培養を用いた3Dコカルチャーモデルの生成について述べている。TUM622細胞は、LUSC患者由来の異種移植片(PDX)から樹立され、基膜マトリックスに播種すると、アシナル様構造を形成するユニークな性質を有する。我々は、3DコカルチャーにおけるTUM622アキニが、LUSC進行中の組織アーキテクチャの主要な特徴と、細胞外を含む腫瘍微小環境(TME)のLUSC細胞と成分間の動的相互作用を再現することを実証する。マトリックス(ECM)および癌関連線維芽細胞(CAF)。さらに、このシステムをさまざまな下流分析にどのように活用できるかを実証するために、主な3D培養プロトコルを適応させます。全体的に、このオルガノイドモデルは、癌進行中の上皮アーキテクチャの破壊を促進する細胞組み込みおよび外因性メカニズムに関する洞察を得ることを可能にする生物学的に豊かで適応可能なプラットフォームを作成し、それを助ける新しい治療標的および診断マーカーの探索。

概要

肺癌は、世界中のがん関連死亡率の主な原因です。肺扁平上皮癌(LUSC)は、非小細胞肺癌(NSCLC)の2番目に一般的なタイプであり、全肺癌の約30%を占めるが、進行期で診断されることが多く、予後不良¹である。LUSC患者のための治療オプションは、LUSC腫瘍形成を促進する基礎となる細胞および分子メカニズムのより良い理解によって改善することができる主要な満たされていない必要性である。

ほとんどのヒト癌と同様に、LUSCの病因は、無傷の、秩序ある上皮組織アーキテクチャ²の破壊によって特徴付けられる。このプロセスの間に、適切な尖体基底細胞の極性、細胞細胞および細胞マトリックスの接触が失われ、腫瘍細胞の制御不能な成長および侵襲的な行動を可能にする。癌細胞とそれらの局所腫瘍微小環境(TME)3との重要な相互作用なしに癌細胞の悪性の特徴が現れないことは、今では広く³理解されている。細胞外マトリックス(ECM)、がん関連線維芽細胞(CAF)、内皮細胞および浸潤免疫細胞を含むTMEの主要成分は、TMEを積極的に形成し、腫瘍形成を促進する^4。それにもかかわらず、TMEにおける腫瘍細胞とこれらの主要成分が、LUSC進行中に組織構造の変化を促進するためにどのように相互作用するかに関する現在の理解は非常に限られています。

三次元(3D)培養は、正常組織と疾患組織の両方における組織アーキテクチャの変化を調節する際の細胞内および外因性の変化の生物学的活性を研究する重要なツール^{である5。}3D カルチャは、従来の 2 次元 (2D) カルチャに欠けている適切な構造および機能コンテキストを提供します。このようなシステムの追加された次元は、増殖、分化、遊球、タンパク質発現および薬物治療への応答を含む細胞生理および細胞行動の多くの側面において、生体内の組織をより密接に模倣する。近年、様々な研究室からの取り組みにより、NSCLC^{66、7、87,8}の両方のin vitro 3Dモデルが開発されています。しかし、腫瘍形成中の動的組織アーキテクチャの変化を再現し、主要な間質成分を組み込むことができる肺扁平上皮癌のモデルは利用できなかった。

ここでは、一次PDX由来LUSC細胞(TUM622と呼ばれます)とCAF9,10を用いて新規3次元(3D)コカルチャーシステムを確立^9,10するための方法について説明する。TUM622とCAFは、いずれも腫瘍¹⁰の分化が不十分なNSCLC患者由来である。ECMに単一細胞として埋め込まれると、TUM622細胞のまれな亜集団は、適切な尖体基底細胞極性を示すアシナル様構造を有するオルガノイドを形成する能力を有する。これらのアシナ様構造は、過形成性であり、非侵襲的なまま、元の腫瘍に類似した茎様および分化マーカーの異種発現を示し、したがって、LUSCの開発の初期段階を模倣する。重要なことに、アシナル様構造の組織アーキテクチャは、低分子阻害剤を有する細胞固有シグナル伝達経路の阻害またはCAFなどのECMの主要成分の追加によって変化し、後者はアキニ形成を増強し、近接時にアキニが侵襲的になることをさらに引き起こすことを示した。これらのデータは、これらの3D共培養系のLUSCオルガノイドが、LUSC細胞とTMEとの動的相互関係の調査に貴重なプラットフォームを提供し、薬物治療¹¹に対するLUSC細胞の応答をモニタリングするために適応できることを示唆している。

プロトコル

1. TUM622細胞とCAFを2D培養で受け継ぎ、培養する

1. TUM622細胞のパスエージングと培養
   1. 37°CのTUM622細胞に対する温かい3D培養培地および細胞解離試薬(材料表を参照)
   2. 2Dフラスコにおける80%合流でのTUM622細胞のパッセージ。通常、これは、合格後1週間に発生します。
   3. T75フラスコから古い媒体を捨て、6 mLのHEPESバッファーで1回洗います。細胞に直接ピペットを避けてください。
   4. HEPESバッファーを吸引する。4 mL のトリプシン/EDTA (0.25 mg/mL、材料表を参照)を追加して、トリプシン/EDTA を捨てます。
   5. トリプシン/EDTAを2 mL加え、37°Cで5分間インキュベートし、インキュベーターからフラスコを取り除き、フラスコをタップして気泡を作らずに細胞を緩め、さらに5分間培養器にフラスコを戻します。
      注:トリプシンへの長時間の暴露は、不可逆的に細胞を損傷し、その表現型を変更します, したがって、細胞がトリプシンにさらされる時間を制限することをお勧めします.
   6. 細胞が軽顕微鏡(4xまたは10x)で剥離し解離したことを確認します。4 mLの中和バッファー(TNSバッファ)を加え(材料表のサブ培養試薬情報を参照)、その後に10 mLの3D培養培地を追加します(材料表を参照)。
   7. ピペットを上下に軽くして、10 mLピペットを使用して細胞をさらに解離します。40 μmのセルストレーナーを通して50 mLの円錐形チューブに懸濁液を移します。
   8. ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用してセル番号をカウントします。
   9. 3D培養培地の20 mLに0.8 x 10⁶細胞/T75フラスコをシード(材料表を参照)。
   10. 使用済み培地の半分を新鮮な培地に置き換えることによって、一日おきに細胞を供給します。
2. CAF のパッセジングと培養
   1. 細胞が合流に達すると、パッセージのCAF。通常、これは1:2分割から培養の5日後に発生します。
   2. 20%の熱不活性化胎児ウシ血清、1%L-グルタミンおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンとRPMI基底培地を使用してCAF培地を調製する。培地を37°Cに温めます。
   3. T75フラスコでは、リン酸緩衝生理食塩基(PBS)でCAFを一度リンスし、トリプシン/EDTAを2 mL添加し、37°Cで5分間インキュベートします。
   4. 光顕微鏡で観察して、フラスコ(4xまたは10x)で細胞が解像したことを確認します。そうでなければ、インキュベーションをさらに2〜3分間延長します。
   5. 細胞が剥離して解離したら、トリプシン/EDTAを中和するために10mLの3D培養培地を加え、ピペットを数回上下に加えて、さらにCAFの解離を行います。
   6. セル懸濁液を50 mL円錐形チューブに移し、室温で5分間300 x gでスピンダウンします。
   7. 上清を捨てて、適切な体積の3D培養培地(材料表を参照)でペレットを再懸濁し、2つの新しいT75フラスコに通過させます。

2. 3D培養用細胞外マトリックスにおけるTUM622細胞のめっき

1. 実験前日には、一晩4°Cの冷蔵庫で基膜マトリックスのバイアルを解凍する。一晩で -20 °C でプラスチックピペット(2 mL)とチップを冷却します。
   注: すべての基質膜マトリックスの多くは、TUM622細胞の3D増殖をサポートするために同じ能力を持っているわけではありません。したがって、強固なアチーニ形成をサポートするものを同定するために、多数の基部膜マトリックスを取得してテストする必要があります。通常、これはマトリックス内のより高いタンパク質濃度(16-18 mg/mL)を必要とします。
2. 実験の日には、温かい3D培養培地、HEPESバッファー、トリプシン/EDTAおよびトリプシン中和バッファー(TNS)を37°Cの水浴に含む。培養を設定する直前に、解凍した基膜マトリックスを冷蔵庫から取り出し、バイアルを氷の上に置きます。
3. 氷の上に置かれた金属プラットフォームクーラーのティッシュ培養プレートを冷やします。金属冷却ラックの上に遠心管を氷の上に置きます。
4. ステップ1.1.7から得られたTUM622細胞を用いて、めっきに必要な細胞の所望の数を計算する。通常、24ウェルプレートのウェルあたり15,000〜30,000個の細胞が必要です。低密度は、イメージングや定量に適していますが、RNA抽出やウェスタンブロッティング用に細胞を収集する場合は高密度が好ましいです。
5. 冷却された遠心管(各チューブに三重めっき用の細胞を含む)に細胞懸濁液を移し、4°Cの吊りバケット遠心分離機で300xgで5分間スピンダウンします。 g
6. 上澄み液を濾過されていない先端(20μL)に取り付けた吸引ピペットで慎重に吸引し、約100μLの媒体をチューブに残します(チューブ上のマーキングをガイドとして使用)。
7. チューブの側面を軽くタップしてペレットを取り外し、冷却ラックに戻す前に解き放ちます。
8. 2 mLの予冷ピペットを使用して、バイアルを氷と接触させながら、数回上下にピペットしてマトリックスを軽く混ぜます。この手順の間に気泡がマトリックスに導入されないように、均一かつ適度な速度でピペット。
9. マトリックスの適切な体積を各遠心管に移します。24ウェルプレートに3枚ずつめっきする場合は、各チューブに1.1mLの基質膜マトリックスを加えます。
10. 事前冷却された先端を使用して、各チューブのマトリックスを上下に約10回ピペットし、均一な細胞懸濁液を作ります。
11. 310 μLのセル/マトリックス懸濁液を、冷却済みの24ウェルプレートの各ウェルに移します。ピペットはプレート表面に90°の角度で配置され、懸濁液はウェルの中心に加えます。サスペンションは、プレートを傾けることなく、広がり、全体を覆う必要があります。
12. 下流の免疫蛍光分析を容易にするために、細胞/マトリックス懸濁液を平行に2ウェルチャンバースライドにプレートします。セル/マトリックスサスペンションの100 μLを2ウェルチャンバースライドのウェルの中央に移します(材料表を参照)。これにより、行列は、はるかに小さい体積でドーム状の構造を形成することができます。
13. プレートとチャンバースライドを組織培養インキュベーターに戻し、30分間インキュベートしてマトリックスを固めます。プレート/スライドを光顕微鏡で調べ、単一の細胞がマトリックス内に均等に分布していることを確認します(4xまたは10x)。
14. 各ウェルに完全な培地を1mLの事前温め、チャンバースライドの各ウェルに3D培養培地1.5mLを加え、インキュベーターに戻します。

3. 細胞外マトリックスにおけるTUM622細胞とCAFの3Dコキュレーション

1. セクション 2 に従って TUM622 および CAF のセル中断を準備します。
2. 10 μLのセル懸濁液を取り、10 μLのトリパンブルーと混合して、CAF細胞密度をカウントします。
3. 10 μL の混合物をマカチメーターの 2 つのチャンバーのそれぞれに加え、細胞密度をカウントして計算します。
   注: CAF は不規則な形状を持ち、自動セル カウンタでは正確にカウントされない場合があります。
4. 基質膜マトリックスにTUM622細胞とCAFを共存させる
   1. 細胞密度情報に基づいて、メッキに使用する細胞の所望の数を計算する。CAFはTUM622細胞の2:1の比率でシードされます。たとえば、30,000 個の TUM622 細胞のシードの場合、60,000 個の CAF が共存します。
   2. TUM622の適切な体積とCAFセル懸濁液を同じ遠心管に移し、24ウェルプレートにメッキのためのステップ2.5-2.11に従ってください。免疫蛍光の場合、ステップ2.12で説明したように、TUM622/CAFの60 μLをチャンバースライドに混合します)。
5. 基部膜マトリックス内のオーバーレイされた CAF を使用した TUM622 のコキュレーション (資料表を参照)
   1. 手順 2.5 ~ 2.13 に従って TUM622 モノカルチャーを設定します。
   2. キャスサスペンションの数を2倍にして(播種したTUM622細胞の数と比較して)遠心管に移し、室温で5分間300 x gでスピンダウンします。
   3. 上清を吸引し、3D培養培地の1mLでCAFsを再懸濁します。
   4. 1 mL の CAF 懸濁液を、埋め込まれた TUM622 セルを含むウェルに移します。

4. RNA/タンパク質抽出および蛍光活性化細胞選別(FACS)用TUM622アチーニの収穫

1. 前日の3Dセルハーベスティングキットプロトコルに従って洗浄バッファーとセルハーベスティングバッファを準備し、4°Cで一晩冷やします。
2. プレートをプレートクーラーに置き、他の試薬を氷上に置いてから、抽出プロセスを開始してください。
3. マトリックスに触れることなく3D培養井戸から吸引培地を吸引し、1mLの洗浄バッファーでウェルを3回静かに洗浄します。
4. 最終洗浄を吸引し、各ウェルに1mLの細胞収穫バッファーを加えます。
5. p1000ピペットチップを使用して、各ウェルのマトリックスを削り取ります。
6. ピペットはマトリックスをさらに解離する。
7. 1 mLのミックスを、あらかじめ冷やされた15 mL円錐管に移します。同じ井戸に収穫バッファの別の1 mLを追加します。
8. ステップ 4.5~ 4.7 を繰り返し、同じウェルのミックスをすべて 15 mL 円錐形チューブに移します。
9. チューブと岩を4°Cで30分間キャップします。
10. 各チューブに10mLまでの氷冷PBSを充填し、300 x gで遠心分離機を4°Cで5分間充填します。
11. ペレットに触れずに上清を吸引する。上清には行列の断片が含まれている必要がありますが、回転楕円体はすべてチューブの底部に集める必要があります。
12. 2回目の洗浄のために氷冷PBSを追加します。ペレットを解震するためにチューブを数回反転します。300 x gで 5 分間スピンダウンします。
13. 紡糸中、タンパク質およびRNAの収集のためのリシスバッファーを準備します。
14. 上清を慎重に吸引し、下流処理用のリシスバッファーを添加してタンパク質またはRNAを収集します。あるいは、フロー解析/FACSソートまたはシリアルパスパサイジングのためにセルを再中断することもできます。

5. TUM622 アキニの蛍光免疫

1. 免疫蛍光バッファー(IFバッファー:0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.2%トリトンX-100および0.05%Tween-20)、一次ブロッキングバッファ(10%ヤギ血清を有するIFバッファ)、二次遮断緩衝液(20μg/mLヤギ抗マウスF(ab'2)を備₂えた一次ブロッキングバッファー)
2. 2ウェルチャンバースライドから吸気媒体を吸引し、PBSで一度すすいで、氷の上に金属板クーラーにスライドを設定します。チャンバースライドは、プロトコルの残りの部分のための金属板クーラーに残る必要があります。
3. あらかじめ冷やした4%PFAを加えて、アチーニを固定し、氷の上で20分間インキュベートします。
4. 4%のPFAを取り除き、ロッカーに穏やかな揺れで5分間、それぞれ2mLの予冷PBSで3回洗浄します。
5. PBSを吸引し、PBSで0.5%トリトンX-100の1.5mL(プレチルド)で20分間透過します。この手順の終わりまでに、ドーム状の構造が緩んでしまいます。
6. サンプル損失を避けるためにチャンバースライドからパーメアビライゼーションバッファーを穏やかに吸引します。これは、吸引ピペットに細かいチップ(20 μL)を加え、チップをチャンバーの隅に押し付けて達成します。
7. ロッカーに優しい揺れで5分間、2mLの予冷PBSで3回洗浄します。
8. 氷上の一次ブロッキングバッファーでサンプルを1時間ブロックします。
9. プライマリブロッキングバッファを取り外し、セカンダリブロッキングバッファを追加し、30分間ブロックします。
10. 一次ブロッキングバッファーに一次抗体を加え、4°Cで一晩インキュベートします。
    注:ここで使用する抗体の濃度は、2D培養で細胞を染色するために通常使用されるよりも高くする必要があります。この研究で使用される一次抗体の大部分は、1:100希釈で希釈されます(材料表を参照)。
11. 一次抗体を除去し、2 mLのコールドIFバッファーでサンプルを3回洗浄します。
    注:サンプルが緩んでいる可能性があり、吸引するときは特別な注意を払ってください。
12. RTで1時間一次ブロッキングバッファーで希釈した二次抗体にサンプルをインキュベートする。好ましい二次抗体は、バックグラウンド染色を減らすために高度にクロス吸着する必要があります。この研究で使用されるほとんどの二次抗体は、1:200希釈で希釈される。
13. 二次抗体を除去し、2 mLの冷たいIFバッファーでサンプルを3回洗浄します。
    注:サンプルが緩んでいる可能性があり、吸引するときは特別な注意を払ってください。
14. 最後の洗浄時にDAPI(1:1,000希釈)でPBSを加えて核を染色します。PBSで別の2つのスッシュを行います。
15. 3日以内に共焦点顕微鏡でサンプルを画像化します。
    注:オルガノイドの大きさと、目的の作業距離の制限により、サンプルは通常10倍または20倍の倍率で画像化されます。

6. 免疫検査用3D培養サンプルの調製

1. 2ウェルチャンバースライドから吸気培地を吸引し、PBSで一度すすいだ。
2. 3D培養物を一晩で37°Cで4%PFAで固定。
3. 4%PFAを取り除き、2.5 mLの占めるサンプルゲル(材料表を参照)で培養し、スライドを4°Cに置いて少なくとも1時間固めます。
4. 組織学的サンプルゲルで囲まれたサンプルを組織カセットに移し、一晩に自動化された組織サンプルプロセッサで処理した。
5. パラフィンワックスにサンプルを埋め込み^、12を切り離す準備をする。

7. 化合物スクリーニングのための3D細胞傷害性アッセイ(1つの96ウェルプレートの例)

1. プレートクーラーに96ウェルプレート、貯水池冷却器に25mLの貯水池、氷の上に15 mLの円錐チューブをセットしてから実験を開始します。
2. 細胞に適切な体積の基底膜マトリックスを加えることによって、あらかじめ冷やされた15 mLポリプロピレンの円錐管のTUM622細胞の細胞マトリックス懸濁液を調製する。TUM622細胞の望ましい密度は、基体膜マトリックスの70〜75 μLあたり10,000個の細胞です。ピペットは数回上下して、マトリックス内の細胞を混合することさえ可能にする。
3. プレートクーラーとリザーバーを備えたプレートを氷から乾燥した表面に移動し、移動中に膜マトリックスと氷が接触するのを避けます。
4. 泡を作成せずに、マトリックスセル混合物を冷却槽に移します。
5. メカニカルマルチチャンネルピペット(10-300 μL)を使用して、混合セルの70~75 μLを96ウェルプレートの適切なウェルに移します。
6. 37°Cで、5%CO2で、基₂質膜マトリックスを固化させるために30分間インキュベートプレート。
7. すべての行に100 μLのメディアを追加し、プレートをインキュベーターに戻します。
8. 実験の目標に応じて、翌日以降に化合物のドージングを開始します。
9. スフェロイドは、8または12ウェル真空マニホールドで使用済み培地を取り除き、所望の化合物の有無にかかわらず新鮮な培地に置き換えることによって、最大10日間、2〜3日ごとに再供給および再ドーズすることができます。
10. TUM622スフェロイドの数は、メーカーのプロトコルに従って3Dイメージャーを使用して定量化することができます。

結果

TUM622 と 2D カルチャの CA
図1は、2D培養におけるTUM622細胞およびCAFの典型的な形態を示す。TUM622細胞は大きな核で丸められ、CAFは平坦で細長い。TUM622細胞は、培養中に80%〜90%の合流に達することができる。さらなる増殖は、より多くにつながるが、直接接触しないコロニーに凝集した小さな細胞。対照的に、CAFは、より高い細胞密?...

ディスカッション

腫瘍は、がん関連線維芽細胞、内皮細胞、ECM内の免疫細胞などの間質細胞と並んで共存する癌細胞からなる異種組織である。これらの多様な成分が一緒にクロストークし、腫瘍微小環境に影響を与え、腫瘍形成を促進する上で積極的な役割を果たし、腫瘍アーキテクチャの進行性の変化を伴うプロセスである。理想的には、腫瘍発生のin vitroモデルは、生体内のヒト腫瘍で観察される動的組?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bronchial Epithelial Growth Medium	Lonza	CC-3170	BEGM
Cell Strainer 40um	ThermoFisher	352340	For passing TUM622 cells
Cleaved Caspase 3 antibody	Cell Signaling Technology	9661 (RRID:AB_2341188)	Rabbit
CoolRack CFT30	Biocision	BCS-138	For 3D culture
CoolSink XT96F	Biocision	BCS-536	For 3D culture
Cultrex 3D Cell Harvesting Kit	Bio-Techne	3448-020-K
Cultrex (preferred for co-culture)	Bio-Techne	3443-005-01	For 3D culture
CXCR4 antibody	Abcam	Ab124824 (RRID:AB_10975635)	Rabbit
E-cadherin antibody	BD Biosciences	610182 (RRID:AB_397581)	Mouse
GelCount	Oxford Optronix		For Acini counts and measurements
GM130 antibody	BD Biosciences	610822 (RRID:AB_398141)	Mouse
Goat Serum	Vector Labs	S1000 (RRID:AB_2336615)	For Immunofluorescence
Heat-inactivated FBS	Gibco	10082-147	For CAFs
Histology sample gel	Richard Allan Scientific	HG-4000-012	For Immunofluorescence
Integrin alpha 6 antibody	Millipore Sigma	Mab1378 (RRID:AB_2128317)	Rat
Involucrin antibody	Abcam	Ab68 (RRID:AB_305656)	Mouse
Ki67 antibody	Abcam	Ab15580 (RRID:AB_443209)	Rabbit
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System	Nalge Nunc International	155379 (2)	For 3D culture
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System	Nalge Nunc International	155409 (8)	For 3D culture
L-Glutamine	Gibco	25030-081	For CAFs
Matrigel (preferred for mono-culture)	Corning	356231	For 3D culture
p63 antibody	Cell Signaling Technology	13109 (SRRID:AB_2637091)	Rabbit
Pen/Strep	Gibco	15140-122	For CAFs
ReagentPack Subculture Reagents	Lonza	CC-5034	For TUM622 cell dissociation
RPMI	ThermoFisher	11875-093	For CAFs
Sox2 antibody	Cell Signaling Technology	3579 (RRID:AB_2195767)	Rabbit
TrypLE Express	Gibco	12604-021	For CAF dissociation
Vi-Cell	Bechman Coulter		Automatic cell counter
Vimentin antibody	Abcam	Ab92547 (RRID:AB_10562134)	Rabbit
β-catenin antibody	Cell Signaling Technology	2677s (RRID:AB_1030943)	Mouse