Système de coculture multidimensionnel pour modéliser la progression du carcinome pulmonaire

Résumé

Un système de modèle in vitro a été développé pour capturer des changements architecturaux de tissu pendant le carcinome squamous de poumon (LUSC) progression dans une co-culture 3 dimensions (3D) avec des fibroblastes cancer-associés (CAFs). Ce système organoïde fournit une plate-forme unique pour étudier les rôles de divers changements tumoraux-intrinsèques et extrinsèques qui modulent le phénotype tumoral.

Résumé

Les interactions tumeur-stroma jouent un rôle critique dans le développement du carcinome squamous pulmonaire (LUSC). Cependant, la compréhension de la façon dont ces interactions dynamiques contribuent aux changements architecturaux tissulaires observés pendant la tumorigenesis reste difficile en raison de l’absence de modèles appropriés. Dans ce protocole, nous décrivons la génération d’un modèle de coculture 3D utilisant une culture cellulaire primaire LUSC connue sous le nom de TUM622. Des cellules TUM622 ont été établies à partir d’un xénogreffe dérivé du patient LUSC (PDX) et ont la propriété unique pour former des structures acinar-like une fois ensemencées dans une matrice de membrane de sous-sol. Nous démontrons que l’acini TUM622 dans la coculture 3D récapitule les principales caractéristiques de l’architecture tissulaire pendant la progression de LUSC ainsi que les interactions dynamiques entre les cellules de LUSC et les composants du microenvironnement tumoral (TME), y compris l’extracellulaire (ECM) et les fibroblastes associés au cancer (CPF). Nous adaptons également notre protocole principal de culturisation 3D pour démontrer comment ce système pourrait être utilisé pour diverses analyses en aval. Dans l’ensemble, ce modèle organoïde crée une plate-forme biologiquement riche et adaptable qui permet d’obtenir un aperçu des mécanismes cellulaires intrinsèques et extrinsèques qui favorisent la perturbation des architectures épithéliales pendant la progression du carcinome et aidera la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques et de marqueurs diagnostiques.

Introduction

Le cancer du poumon est la principale cause de mortalité liée au cancer dans le monde. Le carcinome épidermoïde pulmonaire (LUSC), qui est le deuxième type le plus commun de cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) et représente environ 30% de tous les cancers du poumon, est souvent diagnostiqué à des stades avancés et a un mauvais pronostic¹. Les options de traitement pour les patients de LUSC sont un besoin non satisfait majeur qui peut être amélioré par une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents qui conduisent la tumorigenesis de LUSC.

Comme pour la plupart des cancers humains, la pathogénie de LUSC se caractérise par la perturbation de l’architecture des tissus épithéliaux intacts et bien^{ordonnés 2}. Au cours de ce processus, la polarité apical-basale appropriée de cellules, les contacts de cellule-cellule-cellule-matrice sont perdus, permettant la croissance incontrôlée et le comportement invasif des cellules de tumeur. Il est maintenant largement apprécié que les caractéristiques malignes des cellules cancéreuses ne peuvent pas se manifester sans un interaction importante entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement tumoral local (TME)³. Composants clés du TME, y compris la matrice extracellulaire (ECM), les fibroblastes associés au cancer (CF) ainsi que les cellules endothéliales et les cellules immunitaires infiltrées façonnent activement le TME et stimulent la tumorigenesis⁴. Néanmoins, notre compréhension actuelle de la façon dont les cellules tumorales et ces composants clés dans le TME interagissent pour conduire des changements architecturaux de tissu pendant la progression de LUSC est très limitée.

La culture tridimensionnelle (3D) est un outil important pour étudier les activités biologiques des changements cellulaires-intrinsèques et extrinsèques dans la régulation des changements architecturaux tissulaires dans les tissus normaux et malades⁵. Les cultures 3D fournissent le contexte structurel et fonctionnel approprié qui fait habituellement défaut dans les cultures bidimensionnelles traditionnelles (2D). Les dimensions ajoutées de ces systèmes imitent plus étroitement l’in vivo tissulaire dans beaucoup d’aspects de la physiologie cellulaire et des comportements cellulaires, y compris la prolifération, la différenciation, la migration, l’expression de protéine et la réponse au traitement de drogue. Ces dernières années, les efforts de divers laboratoires ont conduit au développement de modèles in vitro 3D à la fois pour le poumon normal ainsi que NSCLC^6,7,8. Cependant, un modèle pour le carcinome squamous de poumon qui peut récapituler les changements architecturaux dynamiques de tissu pendant la tumorigenesis aussi bien qu’incorporer des composants stromaux clés n’était pas disponible.

Ici, nous décrivons les méthodes pour établir un nouveau système de coculture 3 dimensions (3D) à l’aide de cellules LUSC primaires dérivées de PDX (appelées TUM622) et CAFs^9,10. Les deux TUM622 et CAFs sont dérivés du patient de NSCLC présentant les tumeurs mal différenciées^10. Lorsqu’il est incorporé comme cellules simples dans ECM, une sous-population rare de cellules TUM622 ont la capacité de former des organoïdes avec des structures acinar-like qui affichent la polarité apical-basale appropriée de cellules. Ces structures acinar-like sont hyperplastiques, montrent l’expression hétérogène des marqueurs de tige-comme et de différenciation semblables à la tumeur originale tout en restant non-invasive, et imitent ainsi le stade le plus tôt du développement de LUSC. Fait important, nous avons montré que l’architecture tissulaire des structures acinar-like pourrait être modifiée par l’inhibition des voies de signalisation cellulaire-intrinsèques avec de petits inhibiteurs de molécule ou l’ajout de composants clés dans les ECM tels que les CAF, ce dernier qui améliore la formation d’acini et provoque davantage l’acini à devenir envahissant quand à proximité. Ensemble, ces données suggèrent que ce système de co-culture 3D des organoïdes LUSC fournit une plate-forme précieuse pour l’étude de la réciprocité dynamique entre les cellules LUSC et le TME et pourrait être adapté pour surveiller la réponse des cellules LUSC au traitement médicamenteux¹¹.

Protocole

1. Passaging et Culturing TUM622 Cellules et CAF dans les cultures 2D

1. Passaging et culturing TUM622 cellules
   1. Moyenne de culture 3D chaude et réactifs de dissociation cellulaire (voir Tableau des matériaux) pour les cellules TUM622 à 37 oC.
   2. Passage TUM622 cellules à 80% confluence dans les flacons 2D. Habituellement, cela se produit 1 semaine après le passage.
   3. Jetez le vieux milieu d’un flacon T75 et lavez-la une fois avec 6 ml de tampon HEPES. Évitez de se déverser directement sur les cellules.
   4. Aspirez le tampon HEPES. Ajouter 4 ml de trypsine/EDTA (0,25 mg/ml, voir Tableau des matériaux) pour un rinçage rapide et jeter la trypsine/EDTA.
   5. Ajouter 2 ml de trypsine/EDTA et incuber à 37 oC pendant 5 min. Retirer les flacons de l’incubateur et appuyez sur les flacons pour desserrer les cellules sans créer de bulles d’air et retourner les flacons à l’incubateur pendant 5 minutes supplémentaires.
      REMARQUE : Une exposition prolongée à la trypsine endommagera irrémédiablement les cellules et modifiera leur phénotype, il est donc recommandé de limiter le temps que les cellules sont exposées à la trypsine.
   6. Confirmer que les cellules se sont détachées et dissociées au microscope léger (4x ou 10x). Ajouter 4 ml de tampon de neutralisation (tampon TNS) (voir les informations de réactif de sous-culture dans le tableau des matériaux) suivie de 10 ml de milieu de culture 3D (voir Tableau des matériaux).
   7. Pipette de haut en bas doucement pour dissocier davantage les cellules à l’aide d’une pipette de 10 ml. Transférer la suspension par une passoire cellulaire de 40 m dans un tube conique de 50 ml.
   8. Comptez les numéros de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.
   9. Graine 0.8 x 10⁶ cellules/T75 flacon dans 20 mL de milieu de culture 3D (voir Tableau des matériaux).
   10. Nourrir les cellules tous les deux jours en remplaçant la moitié du milieu dépensé par un milieu frais.
2. Les CAF de passage et de culture
   1. Passage CAFs lorsque les cellules atteignent la confluence. Habituellement, cela se produit après 5 jours de culte à partir d’une scission de 1:2.
   2. Préparer le milieu café à l’aide d’un milieu basal RPMI avec un sérum bovin foetal inactivé à la chaleur de 20 %, 1 % de L-Glutamine et 1 % de pénicilline/streptomycine. Chauffer le milieu à 37 oC.
   3. Dans un flacon T75, rincez les CAB avec saline tamponnée par phosphate (PBS) une fois, puis ajoutez 2 ml de trypsin/EDTA et incuber à 37 oC pendant 5 min.
   4. Observez sous un microscope léger pour vous assurer que les cellules se sont dissociées dans le flacon (4x ou 10x). Si ce n’est pas le cas, étendre l’incubation pour un autre 2-3 min.
   5. Une fois que les cellules se sont détachées et dissociées, ajoutez 10 ml de milieu de culture 3D pour neutraliser la trypsine/EDTA et la pipette de haut en bas à plusieurs reprises pour dissocier davantage les CAF.
   6. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml et descendre à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
   7. Jetez le supernatant et réutilisez la pastille dans un volume approprié de milieu de culture 3D (voir tableau des matériaux)et passagez dans deux nouveaux flacons T75.

2. Plating TUM622 Cellules dans la matrice extracellulaire pour culturing 3D

1. La veille de l’expérience, décongeler les flacons de matrice de membrane du sous-sol dans un réfrigérateur de 4 oC pendant la nuit. Pipettes en plastique refroidies (2 ml) et conseils à -20 oC pendant la nuit.
   REMARQUE : Tous les lots de matrice de membrane de sous-sol n’ont pas la même capacité à soutenir la croissance 3D des cellules TUM622. Par conséquent, il est nécessaire d’acquérir et de tester plusieurs lots de matrice de membrane de sous-sol pour identifier ceux qui soutiennent la formation robuste d’acini. Habituellement, cela nécessite une concentration plus élevée de protéines (16-18 mg/mL) dans la matrice.
2. Le jour de l’expérience, milieu de culture 3D chaud, tampon HEPES, trypsin/EDTA et tampon de neutralisation de la trypsine (TNS) dans un bain d’eau de 37 oC. Immédiatement avant de mettre en place la culture, sortir la matrice de membrane décongelée du réfrigérateur et mettre la fiole sur la glace.
3. Refroidir les plaques de culture tissulaire sur une glacière plate-forme métallique placée sur la glace. Déposer des tubes de centrifugeuse sur une grille de refroidissement métallique sur la glace.
4. À l’aide de cellules TUM622 obtenues à partir de l’étape 1.1.7, calculez le nombre de cellules nécessaires au placage. Typiquement, 15.000-30.0000 cellules sont nécessaires par puits d’une plaque de 24 puits. Une densité plus faible est plus adaptée à l’imagerie et à la quantification, tandis qu’une densité plus élevée est préférable lors de la collecte des cellules pour l’extraction de l’ARN ou le ballonnement occidental.
5. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse refroidi (chaque tube contenant des cellules pour le placage triplicate) et tourner vers le bas à 300 x g dans une centrifugeuse seau suspendue à 4 oC pendant 5 minutes.
6. Aspirez soigneusement le supernatant à une pipette aspirante fixée à une pointe non filtrée (20 ll), en laissant environ 100 l de l’eau du milieu dans le tube (utiliser des marques sur le tube comme guide).
7. Appuyez doucement sur le côté du tube pour déloger et dissocier la pastille avant de la retourner à la grille de refroidissement.
8. À l’aide des pipettes pré refroidies de 2 ml, mélanger délicatement la matrice en faisant monter et descendre à quelques reprises tout en gardant la fiole en contact avec la glace. Pipette à une vitesse égale et modérée de sorte qu’aucune bulle n’est introduite dans la matrice au cours de cette procédure.
9. Transférer le volume approprié de la matrice dans chaque tube de centrifugeuse. Pour placage des triplicates dans une plaque de 24 puits, ajouter 1,1 ml de matrice de membrane de sous-sol à chaque tube.
10. À l’aide de pointes pré refroidies, pipette la matrice dans chaque tube de haut en bas environ 10 fois pour faire une suspension cellulaire uniforme.
11. Transférer 310 L de suspension cellulaire/matrice dans chaque puits d’une plaque de 24 puits pré-refroidie. La pipette est placée à un angle de 90 degrés à la surface de la plaque et la suspension ajoutée au centre du puits. La suspension doit se propager et couvrir l’ensemble du puits sans avoir besoin d’incliner la plaque.
12. Pour faciliter l’analyse de l’immunofluorescence en aval, plaquez la suspension de la cellule/matrice en parallèle en glissières de chambre à deux puits. Transférer 100 L de suspension cellulaire/matrice au centre d’un puits de 2 puits de la diapositive de chambre (voir Tableau des matériaux). Cela permet à la matrice de former une structure en forme de dôme avec un volume beaucoup plus faible.
13. Remettre l’assiette et la chambre glisser de nouveau dans un incubateur de culture tissulaire et incuber pendant 30 minutes pour permettre à la matrice de se solidifier. Examinez la plaque/la diapositive sous un microscope léger pour vous assurer que les cellules individuelles sont réparties uniformément dans la matrice (4x ou 10x).
14. Ajouter 1 ml de culture 3D pré-réchauffée complète milieu dans chaque puits et 1,5 mL de culture 3D moyen à chaque puits de la diapositive de chambre, puis les retourner à l’incubateur.

3. Coculturing 3D des cellules et DES CAF TUM622 dans la matrice extracellulaire

1. Préparer les suspensions cellulaires de TUM622 et de CFC selon l’article 2.
2. Comptez la densité cellulaire des FAC en prenant 10 l de suspension cellulaire et en la mélangeant avec 10 l de bleu trypan.
3. Ajouter 10 L du mélange à chacune des deux chambres sur un hémacytomètre pour compter et calculer la densité cellulaire.
   REMARQUE : Les CAF ont des formes irrégulières et peuvent ne pas être comptés avec précision sur un compteur cellulaire automatique.
4. Co-embéquer les cellules TUM622 et les CCA dans la matrice de membrane de sous-sol
   1. Sur la base de l’information sur la densité cellulaire, calculez le nombre de cellules utilisées pour le placage. Les CAF sont ensemencés à un rapport de 2:1 des cellules TUM622. Par exemple, pour 30 000 cellules TUM622 ensemencées, 60 000 CF sont co-incorporées.
   2. Transférer le volume approprié de TUM622 ainsi que la suspension cellulaire CAFs dans le même tube de centrifugeuse et suivre les étapes 2.5-2.11 pour le placage en plaques de 24 puits. Pour l’immunofluorescence, transférez 60 L de mélange TUM622/CAFs aux diapositives de chambre telles que décrites à l’étape 2.12).
5. Cocultant TUM622 avec DES CAF superposés dans la matrice de membrane de sous-sol (voir tableau des matériaux)
   1. Configurez la monoculture TUM622 selon les étapes 2.5-2.13.
   2. Transférer deux fois le nombre de CFs suspension (par rapport au nombre de cellules TUM622 ensemencées) dans un tube de centrifugeuse et tourner vers le bas à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
   3. Aspirez le supernatant et réutilisez les CAF dans 1 ml de milieu de culture 3D.
   4. Transférer la suspension de 1 ml de CFs au puits contenant les cellules TUM622 intégrées.

4. Récolte TUM622 Acini pour l’extraction d’ARN/protéine et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

1. Préparer le tampon de lavage et le tampon de récolte cellulaire selon le protocole de la trousse de récolte cellulaire 3D la veille et réfrigérer la nuit à 4 oC.
2. Gardez les plaques sur une glacière et d’autres réactifs sur la glace avant de commencer le processus d’extraction.
3. Aspirer les supports des puits de culture 3D sans toucher la matrice et laver doucement le puits 3 fois avec 1 ml de tampon de lavage.
4. Aspirer le dernier lavage et ajouter 1 ml de tampon de récolte cellulaire à chaque puits.
5. Utilisez une pointe de pipette p1000 pour gratter la matrice de chaque puits.
6. Pipette de haut en bas pour dissocier davantage la matrice.
7. Transférer 1 ml du mélange dans un tube conique pré-réfrigéré de 15 ml. Ajouter un autre tampon de récolte de 1 ml au même puits.
8. Répétez les étapes 4.5-4.7, et transférez tous les mélanges du même puits dans un tube conique de 15 mL.
9. Couronner les tubes et la roche à 4 oC pendant 30 min.
10. Remplir chaque tube de PBS glacé jusqu’à 10 ml, puis de centrifugeuse à 300 x g pendant 5 minutes à 4 oC.
11. Aspirer le supernatant sans toucher la pastille. Le supernatant doit contenir des fragments de matrice, mais les sphéroïdes doivent tous être recueillis au fond du tube.
12. Ajouter le PBS glacé pour un deuxième lavage. Inverser le tube à quelques reprises pour dissocier la pastille. Tourner à 300 x g pendant 5 min.
13. Pendant la rotation, préparez le tampon de lyse pour la collecte des protéines et de l’ARN.
14. Aspirez soigneusement le supernatant et ajoutez un tampon de lyse pour le traitement en aval afin de recueillir des protéines ou de l’ARN. Alternativement, les cellules pourraient être réutilisé pour l’analyse de flux/FACS tri ou le passaging en série.

5. Immunofluorescence de TUM622 Acini

1. Préparer le tampon d’immunofluorescence (TAMPON IF : PBS avec 0,1% d’albumine de sérum bovin (BSA), 0,2% Triton X-100 et 0,05% Tween-20), tampon de blocage primaire (tampon IF₂avec sérum de chèvre à 10%), tampon de blocage secondaire (tampon de blocage primaire avec 20 'g/mL anti-souris F(ab')
2. Aspirer le milieu des toboggans de chambre à 2 puits, rincer une fois avec PBS et mettre la glissière sur le refroidisseur de plaque métallique sur la glace. La glissière de chambre doit rester sur le refroidisseur de plaque de métal pour le reste du protocole.
3. Ajouter 4% de PFA pré-réfrigéré pour fixer l’acini et incuber sur la glace pendant 20 min.
4. Retirer 4% PFA et laver trois fois avec 2 ml de PBS pré-réfrigéré chacun pendant 5 min avec bascule douce sur un rocker.
5. Aspirez PBS et perméabilisez avec 1,5 ml de Triton X-100 à 0,5 % dans PBS (pré-réfrigéré) pendant 20 min. À la fin de cette procédure, la structure en forme de dôme se détachera.
6. Aspirez doucement le tampon de perméabilisation de la diapositive de chambre pour éviter la perte d’échantillon. Ceci est réalisé en ajoutant une pointe fine (20 l) à la pipette aspirante et en appuyant sur la pointe vers le coin de la chambre.
7. Laver trois fois avec 2 ml de PBS pré-réfrigéré chacun pendant 5 min avec bascule douce sur un rocker.
8. Bloquer l’échantillon avec le tampon de blocage primaire sur la glace pendant 1 h.
9. Retirez le tampon de blocage primaire et ajoutez le tampon de blocage secondaire et bloquez pendant 30 min.
10. Ajouter les anticorps primaires dans le tampon de blocage primaire et incuber pendant la nuit à 4 oC.
    REMARQUE : La concentration des anticorps utilisés ici devrait être plus élevée que normalement utilisée pour les cellules de coloration dans la culture 2D. La plupart des anticorps primaires utilisés dans cette étude sont dilués à 1:100 dilution (voir Tableau des matériaux).
11. Retirer les anticorps primaires et laver l’échantillon 3 fois avec 2 ml de tampon IF froid.
    REMARQUE : Les échantillons peuvent être lâches, prendre une prudence supplémentaire lors de l’aspiration.
12. Incuber les échantillons dans les anticorps secondaires dilués dans le tampon de blocage primaire pendant 1 h à RT. Les anticorps secondaires préférés devraient être fortement inter-adsorbed pour réduire la coloration de fond. La plupart des anticorps secondaires utilisés dans cette étude sont dilués à 1:200 dilution.
13. Enlever les anticorps secondaires et laver l’échantillon 3 fois avec 2 ml de tampon IF froid.
    REMARQUE : Les échantillons peuvent être lâches, prendre une prudence supplémentaire lors de l’aspiration.
14. Ajouter PBS avec DAPI (1:1,000 dilution) pendant le dernier lavage pour tacher le noyau. Les 2 autres lavages effectuent pbs.
15. Imagez les échantillons sur un microscope confocal dans les 3 jours.
    REMARQUE : En raison de la taille des organoïdes et des limites de la distance de travail de l’objectif, les échantillons sont généralement photographiés à 10x ou 20x grossissement.

6. Préparation d’échantillons de culture 3D pour l’immunohistochimie

1. Aspirer le milieu des diapositives de chambre 2 puits et rincer une fois avec PBS.
2. Fixez les cultures 3D en PFA à 47 oC du jour au lendemain.
3. Enlever 4% de PFA, entourer les cultures avec 2,5 ml de gel d’échantillon d’histologie (voir tableau des matériaux) et placer la diapositive à 4 oC pour se solidifier pendant au moins 1 h.
4. Transférer des échantillons entourés de gel d’échantillon histologique à des cassettes tissulaires et traités dans un processeur d’échantillon de tissu automatisé pendant la nuit.
5. Incorporer des échantillons dans de la cire de paraffine et préparer la section¹².

7. 3D Cytotoxicity Assay for Compound Screening (Exemple pour une plaque de 96 puits)

1. Placez une plaque de 96 puits sur une glacière, un réservoir de 25 ml sur un refroidisseur de réservoir et un tube conique de 15 ml sur la glace avant de commencer l’expérience.
2. Préparer les suspensions de matrice cellulaire des cellules TUM622 dans un tube conical en polypropylène pré-réfrigéré de 15 ml en ajoutant le volume approprié de la matrice de membrane du sous-sol aux cellules. La densité désirée pour les cellules TUM622 est de 10 000 cellules par 70-75 l de matrice de membrane de sous-sol. Pipette de haut en bas à quelques reprises pour permettre même le mélange des cellules dans la matrice.
3. Déplacez la plaque avec un refroidisseur de plaque et un réservoir avec un refroidisseur de réservoir loin de la glace à une surface sèche pour éviter le contact de la matrice de membrane du sous-sol avec de la glace pendant le transfert.
4. Transférer le mélange de cellules de matrice dans le réservoir de refroidissement sans créer de bulles.
5. À l’aide d’une pipette multicanal mécanique (10-300 ll), transférer 70-75 L des cellules de mélange dans chaque puits approprié d’une plaque de 96 puits.
6. Plaque incubée à 37 oC et 5% DE CO₂ pendant 30 min pour que la matrice de membrane du sous-sol se solidifie.
7. Ajoutez 100 L de supports dans toutes les rangées et retournez la plaque à l’incubateur.
8. Commencez à doser composé le lendemain ou plus tard selon l’objectif de l’expérience.
9. Les sphéroïdes peuvent être re-alimentés et re-dosés tous les 2-3 jours pendant un bon jusqu’à 10 jours, en supprimant les supports dépensés avec un collecteur de vide de 8 ou 12 puits et en remplaçant par des supports frais avec ou sans composés désirés.
10. Le nombre de sphéroïdes TUM622 pourrait être quantifié à l’aide d’imageur 3D selon le protocole du fabricant.

Résultats

TUM622 et LES CPF dans la culture 2D
La figure 1 présente la morphologie typique des cellules TUM622 et des CIF dans la culture 2D. Les cellules TUM622 sont arrondies avec de grands noyaux tandis que les CF sont plats et allongés. Les cellules TUM622 peuvent atteindre 80%-90% confluency dans la culture. Une prolifération accrue conduit à plus de cellules, mais plus petites, regroupées dans des colonies qui n’entrent pas en contact d...

Discussion

Les tumeurs sont des tissus hétérogènes composés de cellules cancéreuses coexistant côte à côte avec des cellules stromales telles que les fibroblastes associés au cancer, les cellules endothéliales et les cellules immunitaires dans l’ECM. Ensemble, ces divers composants parlent et influencent le microenvironnement tumoral, jouant un rôle actif dans la conduite de tumorigenesis, un processus qui implique des changements progressifs dans l’architecture tumorale. Idéalement, un modèle in vitro de développ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bronchial Epithelial Growth Medium	Lonza	CC-3170	BEGM
Cell Strainer 40um	ThermoFisher	352340	For passing TUM622 cells
Cleaved Caspase 3 antibody	Cell Signaling Technology	9661 (RRID:AB_2341188)	Rabbit
CoolRack CFT30	Biocision	BCS-138	For 3D culture
CoolSink XT96F	Biocision	BCS-536	For 3D culture
Cultrex 3D Cell Harvesting Kit	Bio-Techne	3448-020-K
Cultrex (preferred for co-culture)	Bio-Techne	3443-005-01	For 3D culture
CXCR4 antibody	Abcam	Ab124824 (RRID:AB_10975635)	Rabbit
E-cadherin antibody	BD Biosciences	610182 (RRID:AB_397581)	Mouse
GelCount	Oxford Optronix		For Acini counts and measurements
GM130 antibody	BD Biosciences	610822 (RRID:AB_398141)	Mouse
Goat Serum	Vector Labs	S1000 (RRID:AB_2336615)	For Immunofluorescence
Heat-inactivated FBS	Gibco	10082-147	For CAFs
Histology sample gel	Richard Allan Scientific	HG-4000-012	For Immunofluorescence
Integrin alpha 6 antibody	Millipore Sigma	Mab1378 (RRID:AB_2128317)	Rat
Involucrin antibody	Abcam	Ab68 (RRID:AB_305656)	Mouse
Ki67 antibody	Abcam	Ab15580 (RRID:AB_443209)	Rabbit
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System	Nalge Nunc International	155379 (2)	For 3D culture
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System	Nalge Nunc International	155409 (8)	For 3D culture
L-Glutamine	Gibco	25030-081	For CAFs
Matrigel (preferred for mono-culture)	Corning	356231	For 3D culture
p63 antibody	Cell Signaling Technology	13109 (SRRID:AB_2637091)	Rabbit
Pen/Strep	Gibco	15140-122	For CAFs
ReagentPack Subculture Reagents	Lonza	CC-5034	For TUM622 cell dissociation
RPMI	ThermoFisher	11875-093	For CAFs
Sox2 antibody	Cell Signaling Technology	3579 (RRID:AB_2195767)	Rabbit
TrypLE Express	Gibco	12604-021	For CAF dissociation
Vi-Cell	Bechman Coulter		Automatic cell counter
Vimentin antibody	Abcam	Ab92547 (RRID:AB_10562134)	Rabbit
β-catenin antibody	Cell Signaling Technology	2677s (RRID:AB_1030943)	Mouse