Sistema di cocultura multidimensionale per modellare la progressione del carcinoma squamoso polmonare

Riepilogo

È stato sviluppato un sistema di modelli in vitro per catturare i cambiamenti architettonici dei tessuti durante la progressione del carcinoma squamoso polmonare (LUSC) in una co-coltura tridimensionale (3D) con fibroblasti associati al cancro (CAF). Questo sistema organoide fornisce una piattaforma unica per studiare i ruoli dei diversi cambiamenti delle cellule tumorali-intrinseche ed estrinseci che modulano il fenotipo tumorale.

Abstract

Le interazioni tumora-stroma svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo del carcinoma squamoso polmonare (LUSC). Tuttavia, comprendere come queste interazioni dinamiche contribuiscono ai cambiamenti architettonici dei tessuti osservati durante la tumorigenesi rimane difficile a causa della mancanza di modelli appropriati. In questo protocollo viene descritta la generazione di un modello di cocultura 3D utilizzando una coltura cellulare primaria LUSC nota come TUM622. Le cellule TUM622 sono state create da un xenotrapianto derivato dal paziente LUSC (PDX) e hanno la proprietà unica di formare strutture acinariche quando seminate in una matrice di membrana seminterrato. Dimostriamo che TUM622 acini nella cocultura 3D riassume le caratteristiche chiave dell'architettura tissutale durante la progressione del LUSC, nonché le interazioni dinamiche tra le cellule LUSC e i componenti del microambiente tumorale (TME), compreso l'extracellulare (ECM) e fibroblasti associati al cancro (CAF). Adattiamo ulteriormente il nostro principale protocollo di coltura 3D per dimostrare come questo sistema potrebbe essere utilizzato per varie analisi a valle. Nel complesso, questo modello organoide crea una piattaforma biologicamente ricca e adattabile che consente di ottenere informazioni sui meccanismi cellulari-intrinseci ed estrinseci che promuovono l'interruzione delle architetture epiteliali durante la progressione carcinoma e aiuteranno la ricerca di nuovi bersagli terapeutici e marcatori diagnostici.

Introduzione

Il cancro del polmone è la principale causa di mortalità legata al cancro in tutto il mondo. Il carcinoma a cellule squamose polmonari (LUSC), che è il secondo tipo più comune di cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC) e rappresenta circa il 30% di tutto il cancro del polmone, viene spesso diagnosticato in fase avanzata e ha una prognosi infausta¹. Le opzioni di trattamento per i pazienti affetti da LUSC sono un'importante necessità insoddisfatta che può essere migliorata da una migliore comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari sottostanti che guidano la tumorigenesi LUSC.

Come per la maggior parte dei tumori umani, la patogenesi di LUSC è caratterizzata dalla rottura dell'architettura del tessuto epiteliale intatta e ben ordinata². Durante questo processo, la corretta polarità delle cellule apicali-basali, i contatti cell-cell e cell-matrix vengono persi, permettendo una crescita incontrollata e un comportamento invasivo delle cellule tumorali. È ormai ampiamente risaputo che le caratteristiche maligne delle cellule tumorali non possono manifestarsi senza un'importante interazione tra le cellule tumorali e il loro microambiente tumorale locale (TME)³. Componenti chiave del TME, tra cui matrice extracellulare (ECM), fibroblasti associati al cancro (CAF), cellule endoteliali e cellule immunitarie infiltranti modellano attivamente il TME e guidano la tumorigenesi⁴. Tuttavia, la nostra attuale comprensione di come le cellule tumorali e questi componenti chiave del TME interagiscono per guidare i cambiamenti architettonici dei tessuti durante la progressione del LUSC è molto limitata.

La coltura tridimensionale (3D) è uno strumento importante per studiare le attività biologiche dei cambiamenti cellulari-intrinseci ed estrinseci nella regolazione dei cambiamenti architettonici dei tessuti nei tessuti normali e malati⁵. Le colture 3D forniscono il contesto strutturale e funzionale appropriato che di solito manca nelle tradizionali colture bidimensionali (2D). Le dimensioni aggiunte di tali sistemi imitano più da vicino il tessuto in vivo in molti aspetti della fisiologia cellulare e dei comportamenti cellulari, tra cui la proliferazione, la differenziazione, la migrazione, l'espressione proteica e la risposta al trattamento farmacologico. Negli ultimi anni, gli sforzi di vari laboratori hanno portato allo sviluppo di modelli 3D in vitro sia per il polmone normale che per NSCLC^6,7,8. Tuttavia, non era disponibile un modello per il carcinoma squamoso polmonare che può ricapitolare sia i cambiamenti architettonici dei tessuti dinamici durante la tumorigenesi che incorporare i componenti stromali chiave.

Qui, descriviamo i metodi per stabilire un nuovo sistema di coculture tridimensionale (3D) utilizzando cellule LUSC primarie derivate da PDX (definite TUM622) e CAF^9,10. Sia TUM622 che CAF sono derivati dal paziente NSCLC con tumori scarsamente differenziati¹⁰. Quando sono incorporate come singole cellule in ECM, una rara sottopopolazione di cellule TUM622 ha la capacità di formare organoidi con strutture acinari che mostrano una corretta polarità delle cellule apical-basali. Queste strutture acinari sono iperplastiche, mostrano un'espressione eterogenea di marcatori simili a gambi e di differenziazione simili al tumore originale, pur rimanendo non invasivi, e quindi imitano il primo stadio dello sviluppo lUSC. È importante sottolineare che abbiamo dimostrato che l'architettura tissutale delle strutture acinariche potrebbe essere alterata dall'inibizione delle vie di segnalazione intrinseche delle cellule con inibitori di piccole molecole o dall'aggiunta di componenti chiave nell'ECM, quest'ultimo dei quali migliora la formazione di acini e provoca ulteriormente l'invasivo acini quando si trovano in prossimità. Insieme, questi dati suggeriscono che questo sistema di cocoltura 3D di organoidi LUSC fornisce una piattaforma preziosa per lo studio della reciprocità dinamica tra le cellule LUSC e il TME e potrebbe essere adattato per monitorare la risposta delle cellule LUSC al trattamento farmacologico¹¹.

Protocollo

1. Passare e coltivare TUM622 Cellule e CAF in colture 2D

1. Passare e coltivare cellule TUM622
   1. Reagenti di dissociazione di dissociazione di coltura 3D caldi (vedi Tabella dei materiali)per le cellule TUM622 a 37 gradi centigradi.
   2. Passaggio delle cellule TUM622 con l'80% di confluenza nei flaconi 2D. Di solito, questo si verifica 1 settimana dopo il passaggio.
   3. Eliminare il vecchio mezzo da un flacone T75 e lavare una volta con 6 mL di buffer HEPES. Evitare di pipettare direttamente sulle cellule.
   4. Aspirati il buffer HEPES. Aggiungere 4 mL di trypsin/EDTA (0,25 mg/mL, vedere Tabella dei materiali) per un rapido risciacquo e scartare la trypsin/EDTA.
   5. Aggiungere 2 mL di orpsina/EDTA e incubare a 37 gradi centigradi per 5 min. Rimuovere i flaconi dall'incubatrice e toccare i flaconi per allentare le cellule senza creare bolle d'aria e restituire i flaconi all'incubatrice per altri 5 min.
      NOTA: L'esposizione prolungata alla trypsin danneggerà irreversibilmente le cellule e altererà il loro fenotipo, quindi si consiglia di limitare il tempo in cui le cellule sono esposte alla trypsina.
   6. Confermare che le cellule si sono staccate e dissociate al microscopio luminoso (4x o 10x). Aggiungere 4 mL di buffer di neutralizzazione (tNS buffer) (vedere le informazioni sul reagente di sottolingua nella tabella dei materiali) seguito da 10 mL di supporto di coltura 3D (vedere Tabella dei materiali).
   7. Pipetta su e giù delicatamente per dissociare ulteriormente le cellule utilizzando una pipetta da 10 mL. Trasferire la sospensione attraverso un colino a celle da 40 m in un tubo conico da 50 ml.
   8. Contare i numeri di cella utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato.
   9. Seme 0,8 x 10⁶ cellule/T75 fiaschetta in 20 mL di mezzo di coltura 3D (vedere Tabella dei materiali).
   10. Alimentare le cellule ogni due giorni sostituendo metà del mezzo speso con un mezzo fresco.
2. Superamento e coltura di CAF
   1. Passaggio CAF quando le cellule raggiungono la confluenza. Di solito, questo si verifica dopo 5 giorni di coltura da una divisione 1:2.
   2. Preparare il mezzo CAF utilizzando il mezzo basale RPMI con il 20% di siero bovino fetale inattivato dal calore, l'1% L-Glutamine e l'1% Penicillin/Streptomycin. Riscaldare il mezzo a 37 gradi centigradi.
   3. In un flacone T75, risciacquare i FILE CAF con la salina con buffer fosfato (PBS) una volta quindi aggiungere 2 mL di orpsina/EDTA e incubare a 37 gradi centigradi per 5 min.
   4. Osservare al microscopio leggero per garantire che le cellule si siano dissociate nel pallone (4x o 10x). In caso contrario, estendere l'incubazione per altri 2-3 min.
   5. Una volta che le cellule si sono staccate e dissociate, aggiungere 10 mL di mezzo di coltura 3D per neutralizzare la trippsina/EDTA e la pipetta su e giù più volte per dissociare ulteriormente i CAF.
   6. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 mL e girare verso il basso a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente.
   7. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente il pellet in un volume appropriato di supporto di coltura 3D (vedi Tabella dei materiali)e passare in due nuovi flaconi T75.

2. placcatura delle cellule TUM622 nella matrice extracellulare per la coltura 3D

1. Il giorno prima dell'esperimento, scongelare le fiale della matrice della membrana del seminterrato in un frigorifero di 4 gradi centigradi durante la notte. Raffreddare le pipette di plastica (2 mL) e punte a -20 gradi durante la notte.
   NOTA: Non tutti i lotti di matrice di membrana seminterrato hanno la stessa capacità di sostenere la crescita 3D delle cellule TUM622. Pertanto, è necessario acquisire e testare più lotti di matrice di membrana seminterrato per identificare quelli che supportano una robusta formazione di acini. Di solito, questo richiede una maggiore concentrazione proteica (16-18 mg/mL) nella matrice.
2. Il giorno dell'esperimento, mezzo di coltura 3D caldo, tampone HEPES, trypsin/EDTA e trypsin neutralizzazione buffer (TNS) in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi. Immediatamente prima di impostare la coltura, togliere la matrice della membrana del seminterrato scongelato dal frigorifero e mettere la fiala sul ghiaccio.
3. Raffreddare le piastre di coltura dei tessuti su un dispositivo di raffreddamento della piattaforma metallica posto sul ghiaccio. Posizionare i tubi di centrifuga su una cremagliera di raffreddamento metallica sul ghiaccio.
4. Utilizzando le cellule TUM622 ottenute dal passaggio 1.1.7, calcolare il numero desiderato di celle necessarie per la placcatura. Tipicamente, 15,000-30,0000 cellule sono necessari per pozzo di una piastra di 24 pozzetti. La densità più bassa è più adatta per l'imaging e la quantificazione, mentre una maggiore densità è preferibile quando si raccolgono cellule per l'estrazione dell'RNA o il gonfiore occidentale.
5. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga raffreddato (ogni tubo contenente cellule per placcatura triplicato) e girare verso il basso a 300 x g in un secchio appeso centrifuga a 4 gradi centigradi per 5 min.
6. Aspirare il supernatante con una pipetta aspirante attaccata a una punta non filtrata (20 gradi l), lasciando circa 100 ll del mezzo nel tubo (usare marcature sul tubo come guida).
7. Toccare delicatamente sul lato del tubo per sloggiare e dissociare il pellet prima di restituirlo al rack di raffreddamento.
8. Utilizzando le pipette pre-raffreddate da 2 mL, mescolare delicatamente la matrice coniando su e giù un paio di volte mantenendo la fiala a contatto con il ghiaccio. Pipetta ad una velocità uniforme e moderata in modo che nessuna bolla venga introdotta nella matrice durante questa procedura.
9. Trasferire il volume appropriato della matrice in ogni tubo di centrifuga. Per i triplicati di placcatura in una piastra di 24 pozze, aggiungere 1,1 mL di matrice di membrana seminterrato ad ogni tubo.
10. Utilizzando punte pre-raffreddate, pipette la matrice in ogni tubo su e giù circa 10 volte per fare una sospensione cellulare uniforme.
11. Trasferire 310 litri di sospensione cellulare/matrice in ogni pozzo di una piastra pre-raffreddata di 24 pozze. La pipetta viene posizionata ad un angolo di 90 gradi rispetto alla superficie della piastra e alle sospensioni aggiunte al centro del pozzo. Le sospensioni dovrebbero stendere e coprire l'intero pozzo senza dover inclinare la piastra.
12. Per facilitare l'analisi dell'immunofluorescenza a valle, piastra la sospensione cella/matrice in parallelo in vetrini a 2 bengeni. Trasferire 100 l di sospensione cella/matrice al centro di un pozzo di 2 pozze scorrevoli camera (vedere Tabella dei materiali). Ciò consente alla matrice di formare una struttura a cupola con un volume molto più piccolo.
13. Riportare la piastra e la camera scivolare di nuovo in un incubatore di coltura dei tessuti e incubare per 30 min per consentire alla matrice di solidificare. Esaminare la piastra/diapositiva al microscopio luminoso per assicurarsi che le singole cellule siano distribuite uniformemente all'interno della matrice (4x o 10x).
14. Aggiungere 1 mL di coltura 3D preriscaldato mezzo completo in ogni pozzo e 1,5 mL di mezzo di coltura 3D per ogni pozzetto dello scivolo camera poi riportarli all'incubatrice.

3. Coculturing 3D di TUM622 Cellule e CAF nella matrice extracellulare

1. Preparare le sospensioni delle celle di TUM622 e CAF secondo la sezione 2.
2. Contare la densità cellulare CAF prendendo 10 - L di sospensione cellulare e mescolandola con 10 - L di trypan blu.
3. Aggiungete 10 l della miscela a ciascuna delle due camere su un emacytometro per contare e calcolare la densità cellulare.
   NOTA: i CAF hanno forme irregolari e non possono essere conteggiati con precisione su un contatore di celle automatico.
4. Co-incorporamento di cellule e CAF TUM622 nella matrice della membrana del seminterrato
   1. In base alle informazioni sulla densità delle celle, calcolare il numero desiderato di celle utilizzate per la placcatura. I FILE CAF vengono semizzati con un rapporto 2:1 delle cellule TUM622. Ad esempio, per 30.000 celle TUM622 seeded, 60.000 CAF sono co-incorporati.
   2. Trasferire il volume appropriato di TUM622 e le sospensioni cellulari CAF nello stesso tubo centrifuga e seguire i passaggi 2.5-2.11 per la placcatura in piastre di 24 pozze. Per l'immunofluorescenza, trasferire 60 gradi di TUM622/CAF mescolati ai vetrini della camera come descritto al punto 2.12).
5. Coculturaing TUM622 con CAF sovrapposti nella matrice della membrana del seminterrato (vedere Tabella dei materiali)
   1. Configurare la monocultura di TUM622 in base ai passaggi 2.5-2.13.
   2. Trasferire il doppio del numero di sospensioni CAF (rispetto al numero di tuM622 cellule semi) in un tubo di centrifuga e girare verso il basso a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente.
   3. Aspirare il supernatante e risospendere i CAF in 1 mL di media di coltura 3D.
   4. Trasferire la sospensione di 1 mL di CAF nel pozzo contenente le celle TUM622 incorporate.

4. Raccolta TUM622 Acini per l'estrazione di RNA/proteine e la selezione delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS)

1. Preparare il buffer di lavaggio e il buffer di raccolta cellulare secondo il protocollo del kit di raccolta delle cellule 3D il giorno precedente e raffreddare durante la notte a 4 gradi centigradi.
2. Tenere le piastre su un refrigeratore di piastra e altri reagenti sul ghiaccio prima di iniziare il processo di estrazione.
3. Aspirati supporti da pozzi di coltura 3D senza toccare la matrice e lavare delicatamente il pozzo 3 volte con 1 mL di lavaggio tampone.
4. Aspirare il lavaggio finale e aggiungere 1 mL di tampone di raccolta cellulare ad ogni pozzo.
5. Utilizzare una punta di pipetta p1000 per raschiare la matrice da ogni pozzo.
6. Pipetta su e giù per dissociare ulteriormente la matrice.
7. Trasferire 1 mL della miscela su un tubo conico pre-freddo da 15 mL. Aggiungere un altro buffer di 1 mL di raccolta allo stesso pozzo.
8. Ripetere i passaggi da 4,5 a 4,7 e trasferire tutto lo stesso mix in un tubo conico da 15 mL.
9. Far a doccapare i tubi e la roccia a 4 gradi centigradi per 30 min.
10. Riempire ogni tubo con PBS ghiacciato fino a 10 mL e quindi centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
11. Aspirare il supernatante senza toccare il pellet. Il supernatante deve contenere frammenti di matrice, ma gli sferoidi devono essere raccolti tutti nella parte inferiore del tubo.
12. Aggiungere PBS ghiacciato per un secondo lavaggio. Invertire il tubo un paio di volte per dissociare il pellet. Girare verso il basso a 300 x g per 5 min.
13. Durante la filatura, preparare il buffer di lisi per la raccolta di proteine e RNA.
14. Aspirare attentamente il supernatante e aggiungere il buffer di lisi per la lavorazione a valle per raccogliere proteine o RNA. In alternativa, le celle potrebbero essere risospese per l'analisi del flusso/ordinamento FACS o il passaggio seriale.

5. Immunofluorescenza di TUM622 Acini

1. Preparare il buffer di immunofluorescenza (IF buffer: PBS con 0,1% di albumina del siero bovino (BSA), 0,2% Triton X-100 e 0.05% Tween-20), buffer di blocco primario (buffer IF con 10% siero di capra), buffer di blocco secondario (buffer di blocco primario con 20 g/mL anti-mouse F(ab')₂₎
2. Media aspirata da vetrini a 2 camere, risciacquare una volta con PBS e impostare lo scivolo sul dispositivo di raffreddamento della piastra metallica sul ghiaccio. Lo scivolo della camera deve rimanere sul dispositivo di raffreddamento della piastra metallica per il resto del protocollo.
3. Aggiungere pre-raffreddato 4% PFA per fissare gli acini e incubare sul ghiaccio per 20 min.
4. Rimuovere il 4% di PFA e lavare tre volte con 2 mL di PBS pre-raffreddato ciascuno per 5 min con dondolo delicato su un rocker.
5. Aspirate PBS e permeabilize con 1,5 mL di 0,5% Triton X-100 in PBS (pre-chilled) per 20 min. Alla fine di questa procedura, la struttura a cupola si allenterà.
6. Aspirare delicatamente il buffer di permeabilizzazione dalla diapositiva della camera per evitare la perdita del campione. Ciò si ottiene aggiungendo una punta fine (20 gradi centigradi) alla pipetta aspirante e premendo la punta verso l'angolo della camera.
7. Lavare tre volte con 2 mL di PBS pre-raffreddato ciascuno per 5 min con dondolo delicato su un rocker.
8. Bloccare il campione con il buffer di blocco primario sul ghiaccio per 1 h.
9. Rimuovere il buffer di blocco primario e aggiungere buffer di blocco secondario e il blocco per 30 min.
10. Aggiungere gli anticorpi primari nel buffer di blocco primario e incubare durante la notte a 4 gradi centigradi.
    NOTA: La concentrazione degli anticorpi qui utilizzati dovrebbe essere superiore al normale utilizzata per le cellule coloranti nella coltura 2D. La maggior parte degli anticorpi primari utilizzati in questo studio sono diluiti a 1:100 diluizione (vedi Tabella dei materiali).
11. Rimuovere gli anticorpi primari e lavare il campione 3 volte con 2 mL di tampone IF freddo.
    NOTA: I campioni potrebbero essere allentati, prestare particolare attenzione quando si aspira.
12. Incubare i campioni negli anticorpi secondari diluiti nel buffer di blocco primario per 1 h a RT. Gli anticorpi secondari preferiti devono essere adsorbiti altamente incrociati per ridurre la colorazione dello sfondo. La maggior parte degli anticorpi secondari utilizzati in questo studio sono diluiti a 1:200 diluizione.
13. Rimuovere gli anticorpi secondari e lavare il campione 3 volte con 2 mL di tampone IF freddo.
    NOTA: I campioni potrebbero essere allentati, prestare particolare attenzione quando si aspira.
14. Aggiungere PBS con DAPI (1:1,000 diluizione) durante l'ultimo lavaggio per macchiare il nucleo. L'esecuzione di altri 2 lavamenti in PBS.
15. Immagina i campioni su un microscopio confocale entro 3 giorni.
    NOTA: a causa delle dimensioni degli organoidi e dei limiti della distanza di lavoro dell'obiettivo, i campioni sono di solito immagini a un ingrandimento 10x o 20x.

6. Preparazione di campioni di cultura 3D per l'immunostochimica

1. Mezzo aspirato da due vetrini camera e risciacquare una volta con PBS.
2. Fissare le colture 3D nel 4% PFA a 37 gradi durante la notte.
3. Rimuovere il 4% di PFA, colture surround con 2,5 mL di gel campione di istologia (vedi Tabella dei materiali) e posizionare lo scivolo a 4 gradi centigradi per solidificare per almeno 1 h.
4. Trasferire campioni circondati con gel campione istologico a cassette di tessuto e lavorati in un processore di campioni di tessuto automatizzato durante la notte.
5. Incorporare i campioni in cera di paraffina e prepararsi per la sezionamento¹².

7. 3D Cytotoxicity Saggio per lo screening composto (Esempio per una piastra da 96 pozzetto)

1. Mettere una piastra di 96 pozze su un refrigeratore di piastra, un serbatoio da 25 mL su un refrigeratore e un tubo conico da 15 mL sul ghiaccio prima di iniziare l'esperimento.
2. Preparare le sospensioni a matrice cellulare delle cellule TUM622 in un tubo conico in polipropilene pre-raffreddato da 15 mL aggiungendo il volume appropriato della matrice della membrana del seminterrato alle cellule. La densità desiderata per le cellule TUM622 è di 10.000 celle per 70-75 - L della matrice della membrana del seminterrato. Pipette su e giù un paio di volte per consentire anche la miscelazione di cellule all'interno della matrice.
3. Spostare la piastra con piastra più fredda e serbatoio con un refrigeratore serbatoio lontano dal ghiaccio ad una superficie asciutta per evitare il contatto della matrice della membrana seminterrato con ghiaccio durante il trasferimento.
4. Trasferire la miscela di cellule a matrice nel serbatoio di raffreddamento senza creare bolle.
5. Utilizzando una pipetta multicanale meccanica (10-300 ) , trasferire 70-75 celle di miscela in ogni pozzo appropriato di una piastra di 96 pozze.
6. Incubare la piastra a 37 e il 5% di CO₂ per 30 min per solidificare la matrice della membrana del seminterrato.
7. Aggiungete 100 l di supporti in tutte le file e riportare la piastra all'incubatrice.
8. Iniziare il dosing composto il giorno successivo o più tardi a seconda dell'obiettivo dell'esperimento.
9. Gli sferoidi possono essere ri-nutriti e re-dopanti ogni 2-3 giorni per un massimo di 10 giorni, rimuovendo i supporti spesi con un collettore di vuoto di 8 o 12 pozze tramite e sostituendo con supporti freschi con o senza composti desiderati.
10. Il numero di sferoidi TUM622 potrebbe essere quantificato utilizzando imager 3D secondo il protocollo del produttore.

Risultati

TUM622 e CAF nelle impostazioni cultura 2D
Figura 1 presenta la morfologia tipica delle cellule TUM622 e CAF nella coltura 2D. Le cellule TUM622 sono arrotondate con grandi nuclei, mentre i CAF sono piatti e allungati. Le cellule TUM622 possono raggiungere l'80%-90% di confluenza nella coltura. Un'ulteriore proliferazione porta a più, ma le cellule più piccole aggregate in colonie che non entrano in contatto diretto. Al contrario, i CAF ...

Discussione

I tumori sono tessuti eterogenei composti da cellule tumorali coesistenti fianco a fianco con cellule stromali come fibroblasti associati al cancro, cellule endoteliali e cellule immunitarie all'interno dell'ECM. Insieme, questi diversi componenti si incrociano e influenzano il microambiente tumorale, svolgendo un ruolo attivo nel guidare la tumorigenesi, un processo che comporta cambiamenti progressivi nell'architettura tumorale. Idealmente, un modello in vitro di sviluppo del tumore dovrebbe essere in grado di catturar...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bronchial Epithelial Growth Medium	Lonza	CC-3170	BEGM
Cell Strainer 40um	ThermoFisher	352340	For passing TUM622 cells
Cleaved Caspase 3 antibody	Cell Signaling Technology	9661 (RRID:AB_2341188)	Rabbit
CoolRack CFT30	Biocision	BCS-138	For 3D culture
CoolSink XT96F	Biocision	BCS-536	For 3D culture
Cultrex 3D Cell Harvesting Kit	Bio-Techne	3448-020-K
Cultrex (preferred for co-culture)	Bio-Techne	3443-005-01	For 3D culture
CXCR4 antibody	Abcam	Ab124824 (RRID:AB_10975635)	Rabbit
E-cadherin antibody	BD Biosciences	610182 (RRID:AB_397581)	Mouse
GelCount	Oxford Optronix		For Acini counts and measurements
GM130 antibody	BD Biosciences	610822 (RRID:AB_398141)	Mouse
Goat Serum	Vector Labs	S1000 (RRID:AB_2336615)	For Immunofluorescence
Heat-inactivated FBS	Gibco	10082-147	For CAFs
Histology sample gel	Richard Allan Scientific	HG-4000-012	For Immunofluorescence
Integrin alpha 6 antibody	Millipore Sigma	Mab1378 (RRID:AB_2128317)	Rat
Involucrin antibody	Abcam	Ab68 (RRID:AB_305656)	Mouse
Ki67 antibody	Abcam	Ab15580 (RRID:AB_443209)	Rabbit
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System	Nalge Nunc International	155379 (2)	For 3D culture
Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System	Nalge Nunc International	155409 (8)	For 3D culture
L-Glutamine	Gibco	25030-081	For CAFs
Matrigel (preferred for mono-culture)	Corning	356231	For 3D culture
p63 antibody	Cell Signaling Technology	13109 (SRRID:AB_2637091)	Rabbit
Pen/Strep	Gibco	15140-122	For CAFs
ReagentPack Subculture Reagents	Lonza	CC-5034	For TUM622 cell dissociation
RPMI	ThermoFisher	11875-093	For CAFs
Sox2 antibody	Cell Signaling Technology	3579 (RRID:AB_2195767)	Rabbit
TrypLE Express	Gibco	12604-021	For CAF dissociation
Vi-Cell	Bechman Coulter		Automatic cell counter
Vimentin antibody	Abcam	Ab92547 (RRID:AB_10562134)	Rabbit
β-catenin antibody	Cell Signaling Technology	2677s (RRID:AB_1030943)	Mouse