JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים כלי שניתן להשתמש בו כדי ללמוד את אפנון posttranscript של תעתיק בתאי אפיתל הראשי מכתשיים באמצעות מערכת ביטוי inducible בשילוב טכניקה אלקטרופורציה פיפטה.

Abstract

לימוד הרגולציה הפוסט-טראומטית הוא יסוד להבנת האפנון של שליח מסוים RNA (mRNA) והשפעתה על הומאוסטזיס התאים וחילוף החומרים. ואכן, תנודות הביטוי בתעתיק יכולות לשנות את יעילות התרגום ולבסוף את הפעילות התאית של תעתיק. כמה גישות ניסיוני פותחו כדי לחקור את מחצית החיים של mRNA למרות חלק מהשיטות הללו יש מגבלות המונעות את המחקר הנכון של אפנון הפוסטסקריפט. מערכת השראה היזם יכול לבטא גן של עניין תחת השליטה של מיזם סינתטי מוסדר טטרציקלין. שיטה זו מאפשרת שערוך מחצית חיים של mRNA נתון תחת כל מצב ניסיוני ללא מטריד הומאוסטזיס התא. חיסרון משמעותי אחד של שיטה זו הוא הצורך בתאי העברה, אשר מגביל את השימוש בטכניקה זו בתאים ראשוניים מבודדים העמידים מאוד בפני טכניקות העברה קונבנציונליות. מכתשיים תאים אפיתל בתרבות הראשית שימשו בהרחבה כדי ללמוד את הביולוגיה התאית והמולקולרית של האפיתל מכתיום. המאפיינים הייחודיים והפנוטיפים של תאי הכתשיים הראשוניים הופכים אותו לחיוני לחקר מודולרופהפוסט של גנים המעניינים בתאים אלה. לכן, המטרה שלנו הייתה לפתח כלי הרומן כדי לחקור את מודולונות הפוסט של mRNAs של עניין בתאי האפיתל מכתשיים בתרבות הראשית. עיצבנו פרוטוקול מהיר ויעיל של הזיהום החולף כדי להכניס מערכת הבעה מבוקרת בשיטת פלססקריפט לתאי האפיתל הראשוניים. אסטרטגיית שיבוט זו, המשתמשת באפירופה ויראלית כדי לתייג את המבנה, מאפשרת את האפליה הקלה של בניית הביטוי מתוך זה של mRNAs האנדוגניים. באמצעות מחזור ΔΔ שונה (Cq) שיטה, ביטוי התמליל יכול להיות כימות במרווחי זמן שונים כדי למדוד את מחצית החיים שלו. הנתונים שלנו להפגין את היעילות של הגישה הרומן הזה בחקר הרגולציה הפוסט בתנאים שונים פתופסולוגית בתאי האפיתל הראשי מכתשיים.

Introduction

מספר טכניקות פותחו כדי לקבוע את מחצית החיים של mRNAs. טכניקת ריקבון הדופק מרדף, אשר משתמשת mRNAs, מאפשר הערכה סימולטני של בריכה גדולה של mRNAs עם הפרעה תאית מינימלית. עם זאת, גישה זו אינה מאפשרת הערכה ישירה של מחצית החיים של תעתיק גן יחיד ולא ניתן ליישם כדי ללמוד את אפנון הפוסטסקריפט של מערכת הגירוי הבאה של mRNA עם גורמי גדילה, ROS, מדאיג, או דלקת1.

השימוש במעכבי תעתיק, כגון אקטינומיצין D ו-α-אמטין, היא שיטה פשוטה יחסית למדידת קינטיקה של השפלה mRNA לאורך זמן. אחד היתרונות העיקריים של גישה זו על זה של טכניקות קודמות, (כלומר, דופק-מרדף) מסתמך על היכולת להעריך במישרין את מחצית החיים של תעתיק נתון ולהשוות איך טיפולים שונים יכול להשפיע על הקינטיקה השפלה שלה. עם זאת, ההשפעה המשמעותית משמעותית של מעכבי התעתיק על הפיזיולוגיה של התא מייצגת חיסרון משמעותי של הגישה2. אכן, עיכוב של התא כולו ההמרה עם תרופות אלה יש תופעת לוואי שלילית של perturbing את הסינתזה של אלמנטים מרכזיים המעורבים ביציבות mRNA, כגון microRNAs (miRNAs), כמו גם את הביטוי וסינתזה של חלבונים כריכת RNA, אשר חשובים עבור השפלה ויציבות mRNA. ההפרעות החמורות של תמלול הגנים על-ידי תרופות אלו עלולות לשנות את עקומות ההשפלה של התעתיקים.

מערכת אינדוקציה היזם מייצג גישה שלישית כדי למדוד את מחצית החיים של mRNA ספציפי. שיטה זו מודדת את ההשפלה של mRNA ספציפי באופן דומה לשיטות המשתמשות במעכבי תעתיק. שני סוגים של מערכות אינדוקציה משמשים לעתים קרובות: סרום המושרה c-fos אמרגן3 ואת מערכת inducible Off4. עם מערכת c-fos, השימוש מעכבי שעתוק כי יכול להיות רעיל לתא אין צורך. עם זאת, שיטה זו מחייבת סנכרון של מחזור התא, המונע את הערכת היציבות בפועל של תעתיק במהלך השלב הפנימי5. לעומת זאת, מערכת ט-Off מאפשרת ביטוי חזק של גן העניין (הארה) תחת השליטה של מקדם מוסדר טטרציקלין מוסדרים. מערכת זו מחייבת נוכחות של שני רכיבים שחייבים להיות מזוהמים בתא כדי להיות פונקציונלי. באמצע הפלסטיק הראשון (pTet-Off) מבטא את החלבון הרגולטורי tTA-עו"ד, מקדם שעתוק סינתטי היברידית מורכב של prokaryotic מדיכוי TetR (מ Es, האננכיה coli) התמזגו שלושה תחומים ההפעלה הפעלה של חלבון ויראלי HSV VP16. הגוי משוכפל לתוך pTRE-צר באמצע תחת שליטה של מיזם סינתטי (Pהדוק), הכולל את הרצף המינימלי של cytomegalovirus (cmv) יזם התמזגו שבעה חוזר של רצף המפעיל teto. תמלול של הגן במורד של Pהדוק תלוי באינטראקציה של tetr עם tetr. בנוכחותו של טטרציקלין או הנגזרת שלה, דוקסיציקלין, מאבדת מחדש את הזיקה שלה למפעיל Tetr, המוביל להפסקת שעתוק4. המאפיינים של מערכת ט-Off להפוך אותו למודל אידיאלי למחקר של ביטוי mrna ספציפי בתאי איקריוטית תוך הימנעות השפעות pleiotropic פוטנציאלי משני העדר רצפים prokaryotic הרגולציה בתא איקריוטית6. בדרך כלל, שורות התאים היציבים כפליים (hek 293, הלה וPC12) משמשות עם מערכת זו כדי לשלב עותקים של הרגולטור והתגובה של פלמידים עבור גישה נוחה לביטוי גנטי בשליטה7,8,9.

מספר דגמים של תאים אפיתל מכתשיים בתרבות שימשו כדי ללמוד את הביולוגיה התאית והמולקולרית של האפיתל מכתיום. במשך שנים, החוקרים מנוצל באופן נרחב בתאים אנושיים או מכרסמים הראשי10,11 , כמו גם קווים מונצח תאים כגון A549 אנושי או עכברוש rle-6tn תאים12,13. למרות שהם בדרך כלל פחות מתרבים וקשה יותר לתרבות לבין transfect, מכתשיים תאי האפיתל בתרבות הראשית להישאר בתקן הזהב למחקר של תפקוד ותפקוד של האפיתל מכתשי בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. אכן, שורות תא מונדמות כגון תאים A549 לא מציגים את המאפיינים המורכבים ופנוטיפים של תאים ראשוניים, ואילו מכתשיים תאי אפיתל בתרבות העיקרית לאחר מכן את המאפיינים העיקריים של האפיתל מכתשי, במיוחד את היכולת ליצור מחסום מקוטב והדוק14,15. למרבה הצער, תאים אלה עמידים מאוד טכניקות החצייה המקובלת, כגון אלה ניצול ליפוזומים, מה שהופך את השימוש של היזם המושרה מערכת כגון ט-Off מאוד קשה.

אפנון הפוסטסקריפט של mRNAs היא אחת השיטות האפקטיביות ביותר למודוללי במהירות את ביטוי הגנים של תעתיק16. אזור ה-mRNA 3 ' בלתי מתורגם ' (3 ' UTR) ממלא תפקיד חשוב במנגנון זה. זה הוכח כי, בניגוד ל 5 ' UTR, יש קורלציה אקספוננציאלית בין אורך של 3 ' UTR ואת המורכבות הסלולר ו מורפולוגית של אורגניזם. מתאם זה מרמז כי 3 ' UTR, כמו אזורי קידוד mRNA, כבר נתון בחירה טבעית כדי לאפשר אפנון מורכב יותר ויותר של הפוסטסקריפט במהלך האבולוציה17. 3 ' UTR מכיל מספר אתרים מחייבים עבור חלבונים ו miRNAs המשפיעים על היציבות והתרגום של התעתיק.

בעבודה הנוכחית, פיתחנו כלי כדי לחקור את התפקיד של תחומים שמרו במידה רבה ב-3 ' UTR של הגוי על שליטה של התעתיק. התמקדנו בערוץ נתרן האפיתל, יחידת יחידת (αENaC), אשר ממלאת תפקיד מפתח בבית מכתשי הפיזיולוגיה האפיתל18. מכתשיים תאים אפיתל בתרבות הראשית היו בהצלחה משני הצדדים עם שני המרכיבים של מערכת ט-Off, אשר מאפשר ללמוד את התפקיד של 3 ' UTR ביציבות mRNA עם מערכת כי המינימלי משפיע הפיזיולוגיה של התא ואת חילוף החומרים בהשוואה לשימוש של מעכבי שעתוק עם פרוטוקולים אחרים. אסטרטגיית שיבוט פותחה כדי להבדיל את הביטוי של הגוי מתוך הגן האנדוסוגגני באמצעות אפירופה בלתי מפותח (V5). התגובה והפלמידים של התקנות הועברו לאחר מכן לתוך מכתשיים תאי האפיתל באמצעות טכניקת פיפורציה חשמלית. לאחר מכן, הביטוי של התעתיק נמדד על-ידי דגירה של התאים עם דוקסיציקלין במרווחי זמן שונים. מחצית החיים של התמליל הוערך על-ידי RT-qPCR עם שיטת Cq ששונתה באמצעות מוצר העברה של טה-אד mRNA לנורמליזציה. באמצעות הפרוטוקול שלנו, אנו מציעים דרך נוחה ללימוד האפנון הפוסט-ממדי של תעתיק בתנאים שונים והגדרת המעורבות של האזורים הבלתי מתורגמים ביתר פירוט.

Protocol

כל ההליכים בעלי החיים נערכו על פי ההנחיות של המועצה הקנדית על טיפול בעלי חיים ואושרו על ידי ועדת הטיפול המוסדי בעלי חיים של מרכז המחקר של מרכז אשפוז באוניברסיטת מונטריאול (CRCHUM).

1. עיצוב והדור של התגובה הפלבמיד לבטא את גן העניין (הארה)

  1. השתמש וקטור inducible טטרציקלין-off, כגון pTRE-הדוק.
  2. לנתח את הרצף של ה-הארה והאתר הכפול (MCS) של הווקטור כדי לזהות את אתרי ההגבלה ב-MCS שאינם נמצאים בפנים בתוך הגוי.
  3. בידוד תאים האפיתל הראשי מכתשיים מ זכר הג-דאולי עכברוש הריאות כמתואר בעבר19,20.
  4. לטהר את ה-RNA הכולל מתאי האפיתל מכתשיים על ידי חילוץ RNA בשיטה סטנדרטית, כגון מיצוי פנול/כלורופורם או שימוש בעמודות ספין מבוססות-RNA של סיליקה.
  5. הפוך-תעתור את mRNA ל-DNA משלים (cDNA) באמצעות oligo (dT) ו באיכות גבוהה היפוך הטרנסקריפטאז.
  6. השתמש באמינות גבוהה Taq פולימראז ו חפיפה סטנדרטית טכניקות PCR כדי לאגף את הגוי עם שני אתרים שנבחרו זיהוי אנזימים הגבלה באמצעות התחל מעוצב.
    1. יש את התחל הקדמי להכיל את קוזק הקונצנזוס ריבוכמה באתר מחייב21 כדי לשפר את רמות הביטוי כדי ללמוד ביטוי חלבון במקביל עם יציבות mrna. יש לכלול בקידוד רצף את האפיופ של ה-V5 במעלה הזרם של הגוי כדי להבחין בביטוי של הגוי המנוכר מביטוי האנדוגניים (שולחן 1).
    2. . לאחר העצירה הנגדית
  7. מוטנטים יכולים להיווצר על ידי מחיקה סדרתית לחקור את ההשפעות של 3 אזורים UTR שונים על היציבות של mRNA של הגוי באמצעות להפוך את קידוד התחל באתר פוליאדלציה בהדרגה מוחקת את 3 ' הקצה של הגוי 3 ' UTR (איור 6). לחילופין, ניתן להשתמש במוטגנזה בבימויו של PCR כדי למקד אזור מסוים של עניין ב-3 ' UTR22.
  8. לעכל את הווקטור inducible ואת התוספת עם אנזימי הגבלה שנבחרו בעבר בטמפרטורת הדגירה המתאימה עבור 1 h, ואחריו טיפול עם פוספספטאז במהלך התגובה וקטורית עבור 30 דקות כדי למנוע הכנסה עצמית.
  9. הפרד את הווקטור מתעכל ומקטעי הוספה על ידי אלקטרופורזה ב 1-1.5% agarose ג'ל (ריכוז בהתאם לגודל של הכנס).
  10. באמצעות להב ואור UV, לאסוף את שברי ה-DNA המכיל את ההכנסה הרצויה וקטור להיות ligated.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
  11. לטהר את מקטעים שנאספו ג'ל agarose באמצעות ערכת הטיהור PCR המבוססת על סיליקה ולמדוד את הריכוז על ידי ספקטרופוטומטר ב 260 nm.
  12. Ligate הגוי ואת וקטור inducible עם T4 DNA לליגאז באמצעות וקטור: להוסיף יחס טוחנת של 1:3 כדי להגדיל את ההסתברות של הארכה. דגירה את התגובה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 3 h.
  13. הפוך את התגובה הנגדית לתוך E. coli המוסמכת (DH5α).
    1. הוסף 1-10 ng של וקטור גן לצינור המכיל 100 μL של תאים המוסמכים. דגירה את התאים על הקרח 30 דקות ולאחר מכן חום בהלם תאים ב 42 ° c עבור 45 s. מניחים את השפופרת על הקרח עבור 2 דקות ולהוסיף 900 μL של מדיום RT ליברות. דגירה את התאים עבור 1 h ב 37 ° צ' עם טלטול ב 225 סל ד.
    2. התפשטות 100 μL של התגובה על צלחת ליברות אגר עם אנטיביוטי מתאים (למשל, 100 μg/mL אמפיצילין עבור וקטור pTRE-הדוק) כדי לבחור את החיידקים שעברו טרנספורמציה. מודקת את הצלחת הלילה ב 37 ° c.
    3. בחר מושבות בודדות באמצעות לולאת חיסון או 20 μL טיפ ו-דגירה לילה ב 5 mL LB בינונית המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה ב 37 ° c עם טלטול. חיידקים שהפך יכול להיות מאוחסן מניות גליצרול ב-80 ° c ביחס של 400:600 של LB בינונית כדי גליצרול.
  14. לחלץ את ה-DNA פלמיד באמצעות מבוססי סיליקה בעמודות באמצע ולמדוד את הריכוז על ידי ספקטרופוטומטר ב 260 nm. אשר את החדרת הגוי על ידי ניתוח הגבלה והתמצאות והיעדר מוטציות שעשויות להיות מוכוונות במהלך RT-PCR ברצף.

2. התמרה של העירוי של התגובה המבטאת את גן העניין (הארה) לתאי אפיתל מכתשיים ראשוניים

  1. לבודד סוג II מכתשיים תאים אפיתל מריאות חולדה.
  2. הזרע את התאים בצפיפות של 1 x 106 תאים/cm2 ב 100 mm מנות פטרי עם מדיום מינימום חיוני מינימלי (להשלים לזכור). להשלים מחברים הוא מקרן בתוספת עם 10% fbs, 0.08 mg/L tobramycin, septra (3 μg/ml ילדים ו -17 μg/ml סולפאמתוקסאזול), 0.2% נחקו3, 0.01 M hepes (pH = 7.3), ו 2 מ"מ L-גלוטמין. מתרבות התאים 24 שעות ב 37 ° c ב 5% CO2 בחממה לחות.
  3. ביום למחרת, מקום 500 μL של הגברת המלאה ללא אנטיביוטיקה בכל באר של 12 היטב צלחת חדש ולחמם את הצלחת ב 37 ° c עבור 30 דקות. במהלך שלב זה, חשוב להשתמש סרום העוברי העובר ללא מזהם טטרציקווים או עם רמה נמוכה מדי כדי להפריע התעשייה.
  4. להכין צינורות 1.5 mL המכיל את הפלס1 עם inducible גוי (הגוי באמצע) ואת וקטור הרגולציה (g., pTet-Off) על ידי הוספת 1 μg של ה-פלבין הגוי ו 1 μg של וקטור הרגולציה לכל טוב ב RT. עבור ניסויים בהבעה עם חלבונים כריכת RNA (RBP), 1 μg של וקטור קונסטיטוטיבי (g., pcDNA3) המבטא את RBP של עניין נוסף לתמהיל DNA (איור 7).
  5. מנושף את המדיום ושטוף בעדינות את התאים עם ה-PBS (ללא סידן ומגנזיום) שחומם ב37 מעלות צלזיוס.
  6. הוסף 5 מ ל של 0.05% טריפסין מראש ב 37 ° c ו מודדת את התאים עד התאים מנותקים (2-4 דקות). לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 10 מ ל ללא אנטיביוטיקה מלאה.
  7. לאסוף את ההשעיה התא בצינור 50 mL, לשטוף את צלחת פטרי עם 4 מ ל של בינוני כדי לאסוף כמה שיותר תאים הנותרים ככל האפשר, ולאחר מכן צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 300 x g עבור 5 דקות.
  8. והשהה מחדש את הגלולה ב-1 מ ל של PBS. הרוזן וחשב את מספר התאים באמצעות הומוציטומטר.
  9. צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות בעדינות ומכה את הסופרנטאנט ומשהה מחדש את הגלולה במאגר מחדש בריכוז של 4 x 107 תאים/mL. הוסף את התאים מצינור 1.5 mL מוכן בשלב 2.4 בריכוז של 400,000 תאים לכל טוב ובעדינות לערבב אותם על ידי ליטוף למעלה ולמטה.
  10. מניחים את הצינור במכשיר האלקטרופורציה וממלאים אותו ב3.5 mL של מאגר אלקטרוליטי.
  11. הכניסו טיפ מצופה זהב לתוך פיפטה על ידי לחיצה מלאה על הבוכנה. בעדינות לערבב את התוכן של שפופרת 1.5 mL ולטפל בזהירות את התאים עם הפיפטה. היזהרו למנוע בועות אוויר להזין את הקצה, כמו זה יגרום הובלה חשמלית במהלך אלקטרופורציה ולגרום לירידה ביעילות הזיהום.
  12. הכנס את הפיפטה לתחנת החשמל עד שיהיה צליל לחיצה.
  13. בחר את פרוטוקול אלקטרופורציה המתאים לתאי האפיתל מכתשיים, המתאים מתח הדופק של 1,450 V ו 2 פולסים עם רוחב של 20 ms, ולחץ על התחל על מסך המגע.
  14. מיד לאחר החצייה, להסיר את הפיפטה ולהעביר את התאים היטב מילא בעבר עם הגברת המלאה ללא אנטיביוטיקה כי כבר מראש עד 37 ° c.
  15. חזור על שלבים 2.11-2.14 עבור הדגימות הנותרות.
  16. טלטל בעדינות את הצלחת כדי לפזר את התאים באופן שווה על פני השטח היטב. מודיית את התאים ב 37 ° c ב 5% CO2 בתוך החממה לחות. לאחר יומיים, החלף את המדיום בעזרת הגברת המלאה באנטיביוטיקה.
  17. אשר את הצלחת התרגום על ידי התבוננות בביטוי של eGFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית או על ידי זרימה cy, לנסות באמצעות וקטור שליטה (איור 1).
    הערה: שלב זה הוא אופציונלי ודורש צעד נוסף של העברה באמצעות פלסטלינה שונה המבטא eGFP, כגון pcDNA3-EGFP.

3. אינדוקציה של השעתוק של הגוי

הערה: ניתן לטפל בתאים מראש עם הטיפולים הרצויים לפני השראתי כדי להעריך את השפעתם על יציבות mRNA (איור 5).

  1. להכין מניות דוקסיציקלין פתרון של 1 מ"ג/mL במים מוכי. אחסן את פתרון המניה ב-20 ° c מוגן מפני אור. דוקסיציקלין, הנגזרת טטרציקלין, משמש במקום טטרציקלין כי יש לו יותר מחצית חיים (2x) מאשר טטרציקלין. יתרהמזאת,יש צורך בריכוז נמוך יותר של דוקסיציקלין לצורך הפעלה מלאה של המבצע ט' .
    הערה: דוקסיציקלין יכול להשפיע על ביטוי mRNA של האנדודוגני. כדי לוודא זאת, יש לבדוק את השפעת הטיפול באמצעות דוקסיציקלין על תאים מכתשיים כדי לאשר את היעדר השינויים בביטוי הגוי (איור 2).
  2. הכינו פתרון חדש מבית 1 μg/mL בשנת ה72 המלאה של הקרן וחמם אותו ל 37 ° c.
  3. החלף את המדיום עם 1 מ ל של זיכרון מלא המכיל 1 מיקרומטר μg/mL כדי לעכב את התמלול של הגוי.
  4. דגירה מספר בארות ב 37 ° c ב 5% CO2 עבור כמויות שונות של זמן מ 15 דקות-6 h כדי להעריך את mrna מחצית החיים של הגוי.
  5. בסוף הטיפול, לשטוף את התאים עם הקרח קר PBS ו lyse אותם עם ערכת החילוץ כלורופורם מסחרית פנול-הכלורופורם-RNA על ידי הוספת 500 μL של מאגר לכל טוב וטלטול את הצלחת כדי המגון את התאים.
  6. בודד את ה-RNA לפי פרוטוקול היצרן. לקבוע את התשואה RNA וטוהר על ידי ספקטרופוטומטר ב 230, 260, ו 280 nm. דגימות RNA עם 260:230 ו 260:280 יחסי של 1.8 ו 2.0, בהתאמה, נחשבים טהורים.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

4. קביעת יציבות mRNA של הגוי

  1. לטפל 1 μg של RNA כולל עם RNAse-חינם DNAse I (כיתה הגברה) כדי להסיר כל סימן של DNA פלמיד שיכול להפריע הגברה הבאים DNA.
    1. בצינור 0.2 mL PCR, לשלב 1 μg של הכולל RNA, 1 μL של 10x DNase מאגר התגובה, 1 μL של DNAse I (1 U/μL), ו RNAse-מים ללא תשלום כדי להשיג נפח כולל של 10 μL.
    2. מודקון את התגובה ב RT עבור 20 דקות.
    3. ביטול הפקודה DNAse אני על ידי הוספת 1 μL של 25 mM EDTA ל 10 μL התגובה ערבוב ו דגירה את התגובה ב 70 ° c עבור 10 דקות.
  2. הפוך-תעתור את ה-RNA הכולל של DNA לתוך cDNA באמצעות מסחרית זמינה cDNA ערכת סינתזה עם תערובת של oligo (dT) ו התחל הספר אקראי כדי לשפר את הפוך את היעילות תמלול.
    1. בקצרה, להוסיף 4 μL של מיקס התגובה 5x, 1 μL של היפוך הטרנססקריפט, ו 4 μL של RNAse-מים ללא תשלום 11 μL של ה-DNA הכולל לערבב RNA כדי להשיג נפח התגובה הכולל של 20 μL. לערבב את התגובה היטב על ידי ליטוף אותו למעלה ולמטה
    2. מודסת את התגובה עבור 5 דקות ב 25 ° c, ואחריו 20 דקות ב 46 ° c, ולאחר מכן להשבית את התגובה על ידי דגירה אותו ב 95 ° c עבור 1 דקות. כל תגובה תניב 50 ng/μL של מוצר cDNA.
    3. לדלל את התגובה cDNA לריכוז של 5 ng/μL על ידי הוספת 180 μL של מים ביולוגיים מולקולריים ברמה 20 μL התגובה ערבוב. אחסן את מוצרי cDNA ב-80 ° צ' או להמשיך מיד לבצע PCR כמותי בזמן אמת (qPCR).
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
  3. העיצוב הקדמי והפוך qPCR ספציפיים לגוי.
    1. בשל הביטוי האנדוגני של הגוי בתאים, התחל צריך להיות מתוכנן כדי להגביר את 100-150 bp האמפר של האפיפי של V5 בשילוב עם הגוי (שולחן 1).
    2. יש להשתמש בצבעי יסוד גנים בעלי התייחסות פנימית גם כפקדי נורמליזציה. בדרך כלל, גנים משק הבית, כגון בטא actin ו-היפוקסאתה פוספוליבואז 1 גנים, משמשים התייחסות גנים. עם זאת, לא ניתן להשתמש באלה עם מערכת אינדוקציה זו עקב וריאציה של יעילות הזיהום. במקום זאת, הביטוי של התעתיק tTA-Ad מוערך לצורך נורמליזציה, משום שהביטוי שלו הוא קונסטיטוטיבי בתאים עקב הפעילות של מקדם cytomegalovirus ירוס. כל שינוי בביטוי שנמדד על ידי qPCR יהיה נציג היעילות של התרגום (התחל: קדימה 5 '-מנות TGA CGA הסוכנות GGA AAC TC 3 ' והפוך 5 '-AGT GGG תאת גת המאלף TGA CC-3; 129 bp amplicon) ויאפשר נורמליזציה של הביטוי של שיבוטים מנוכר (איור 3).
  4. הכינו כל תגובת qPCR ב טרילקאט באמצעות מיקס מאסטר בצבע ירוק SYBR.
    1. לדלל את 5 ng/μL cDNA מיקס לריכוז של 1.25 ng/μL באמצעות מים ביולוגיים מולקולריים ברמה.
    2. לשלב 5 μL של שילוב מאסטר בצבע ירוק SYBR (2x), 0.1 μL של מים מולקולריים בביולוגיה מולקולרית, 0.45 μL של 7.5 μM הקדמי, 0.45 μL של 7.5 הפוכה לאחור, ו 4 μL של 1.25 ng/μL cDNA כדי לקבל נפח התגובה הכולל של 10 μL. Mix היטב על ידי ליטוף למעלה ולמטה ב 96 הצלחת היטב PCR. השתמש בסרט דבק אופטי כדי לוודא שמכסה הלוחית חתום וכלה במניעת זיהום והתאיידות.
    3. לסובב את מיקס התגובה בקצרה על ידי צנטריפוגה ולמקם את הצלחת ב-qPCR תרמוטרטרנר.
  5. הגבר את ה-V5-מתויג הגברה ו-tTA-Ad באמצעות התנאים הבאים של qPCR: 95 ° c במשך 10 דקות כצעד דנטורציה, ואחריו 40 מחזורים של 95 ° צ' עבור 10 s, 58 ° c עבור 15 s, ו 72 ° c עבור 20 s. עקומת ההיתוך ברזולוציה גבוהה חייב להיווצר לאחר מחזורי הגברה מבוצעים כדי להעריך את טמפרטורת ההיתוך הספציפית של הגברה הרצוי כדי להבטיח את העדר של רעש אמפליקון פסגות.
    1. כלול שולטת שלילית עבור רביעיית ה-PCR על-ידי ביצוע qPCR עם RNA כתבנית ללא היפוך הטרנסקריפטאז לשמש כפקד על זיהום דנ א פוטנציאלי הפלסטיק ו-qPCR ללא cDNA הוסיף לערבב qPCR כדי להבטיח את העדר בולטות או זהמים.
    2. הריכוז האופטימלי cDNA, פריימר יעילות, וריכוז חייב להיות ממוטב על פי הגוי על ידי שיטת עיקול סטנדרטי. לשם כך, בצע דילול סדרתי באמצעות cDNA מתאים לא מטופל (תרבותי ללא דוקסיציקלין). העקומה הסטנדרטית נוצרת על-ידי התוויית ערכי Cq כנגד היומן של גורם הדילול Cq, ויעילות ההגברה (E) מחושבת בהתאם לשיפוע של העקומה הסטנדרטית באמצעות הנוסחה הבאה:
      E = 10-1/שיפוע
      הערה: יעילות הגברה צריכה להיות כ 0.9 עד 1.05. אחרת, יש לעיצוב מחדש של התחל.
  6. נתח את נתוני ה-qPCR באמצעות שיטת Cq השוואתית על-ידי נרמול ערכי הביטויים של הגוי לביטוי של tTA-Ad כדי להשיג את רמות הביטוי היחסיות של הגוי ולדווח על ביטויו כאחוז מהביטוי mRNA של הגוי בתאים מאותה חיה בנקודת ההתחלה (t = 0) (איור 4).
  7. מחצית החיים נקבע מתוך קבוע הקצב (K) של עקומת השפלה של הגוי mRNA באמצעות המשוואה הבאה:
    t1/2 = בתוך 2/K.

תוצאות

פרוטוקול זה נעשה שימוש בהצלחה כדי ליצור מערכת הבעה מבוקרת מבחינה מבצעית באמצעות פלסטלינה כדי להעריך את החשיבות של חלקים שונים של αENaC 3 ' UTR באפנון של יציבות תעתיק בתאי האפיתל הראשי מכתשיים.

הצעד הראשון ביישום של מערכת זו היה ליצור טכניקת ה?...

Discussion

שיעור הגידול הנמוך של מכתשי תאים אפיתל בתרבות העיקרית כבר מגבלה רצינית לשימוש מערכת ט-Off כדי להעריך את יציבות mRNA בתאים אלה. עם זאת, מגבלה זו היתה להתגבר על ידי הפיפטה אלקטרופורציה, המאפשר 25-30% יעילות הזיהום (איור 1 ואיור 3)26.

המדידה ?...

Disclosures

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

Acknowledgements

פרנסיס מיגס נתמך על ידי מלגת שסופקו על-ידי רשת בריאות הנשימה של קוויבק והמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR), תוכנית הכשרה לריאות של המכון הימי, מסעדת FRSQ ו-"משלוח של המוני המוני". . הפוסטדואלס, אוניברסיטת מונטריאול עבודה זו נתמכת על ידי כיסא הגוסליס-למררה במחקר קליני והמוסדות הקנדים לחקר הבריאות [במגב-79544].

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Actinomycin DSigma-AldrichA9415
AmpicillinSigma-AldrichA1593
Bright-LineHemacytometerSigma-AldrichZ359629
Chloroform - Molecular biology gradeSigma-AldrichC2432
ClaINew England BiolabsR0197S
CycloheximideSigma-AldrichC7698
DM IL LED Inverted Microscope with Phase ContrastLeica-
DNase I, Amplification GradeInvitrogen18068015
Doxycycline hyclateSigma-AldrichD9891-1G
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesiumWisent Bioproducts311-425-CL
Ethanol - Molecular biology gradeFisher ScientificBP2818100
Excella E25 ConsoleIncubatorShakerEppendorf1220G76
GlycerolSigma-AldrichG5516
HEPES pH 7.3Sigma-AldrichH3784
Heracell 240iThermoFisher Scientific51026420
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad Laboratories1708890
Isopropanol - Molecular biology gradeSigma-AldrichI9516
LB Broth (Lennox)Sigma-AldrichL3022
LB Broth with agar (Lennox)Sigma-AldrichL2897
L-glutamineSigma-AldrichG7513
Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10Sigma-AldrichL9143
MEM, powderGibco61100103
MicroAmp Optical 96-Well Reaction PlateApplied BiosystemsN8010560
MicroAmp Optical Adhesive FilmApplied Biosystems4360954
MSC-Advantage Class II Biological Safety CabinetsThermoFisher Scientific51025413
Mupid-exU electrophoresis systemTakara BioAD140
NanoDrop 2000cThermoFisher ScientificND-2000
Neon Transfection System 10 µL KitInvitrogenMPK1025
Neon Transfection System Starter PackInvitrogenMPK5000S
NheINew England BiolabsR0131S
One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coliInvitrogenC854003
pcDNA3 vectorThermoFisher ScientificV790-20
pcDNA3-EGFP plasmidAddgene13031
PlatinumTaqDNA Polymerase High FidelityInvitrogen11304011
pTet-Off Advanced vectorTakara Bio631070
pTRE-Tight vectorTakara Bio631059
Purified alveolar epithelial cellsn.a.n.a.
QIAEX II Gel Extraction KitQIAGEN20021
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12162
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27104
QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System SoftwareApplied Biosystemsn.a.
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well FastApplied Biosystems4485697
Recombinant Rat TNF-alpha ProteinR&D Systems510-RT-010
SeptraSigma-AldrichA2487
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)New England BiolabsM0371S
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725270
SuperScript IV Reverse TranscriptaseInvitrogen18090010
T4 DNA LigaseThermoFisher ScientificEL0011
Tet System Approved FBSTakara Bio631367
TobramycinSigma-AldrichT4014
TRIzol ReagentInvitrogen15596018
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300054
UltraPure AgaroseInvitrogen16500500
Water, Molecular biology GradeWisent Bioproducts809-115-EL

References

  1. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
  2. Ljungman, M. The transcription stress response. Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).
  3. Ross, J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).
  4. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
  5. Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
  6. Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
  7. Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
  8. Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).
  9. Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
  10. Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
  11. Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).
  12. Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
  13. Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
  14. Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).
  15. Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
  16. Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. Regulatory functions of 3'UTRs. Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).
  17. Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
  18. Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
  19. Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
  20. Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
  21. Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
  22. Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
  23. Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. . Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. , (2001).
  24. Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
  25. Migneault, F. . Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites. , (2015).
  26. Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
  27. Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
  28. Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).
  29. Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
  30. Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
  31. Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157mRNA3 UTROffinducible

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved