JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo uno strumento che può essere utilizzato per studiare la modulazione posttranscriptionale di una trascrizione nelle cellule epiteliali alveolare primarie utilizzando un sistema di espressione inducibile accoppiato a una tecnica di elettroporazione pipetta.

Abstract

Studiare la regolazione posttranscrittivale è fondamentale per comprendere la modulazione di un dato RNA messaggero (mRNA) e il suo impatto sull'omeostasi cellulare e sul metabolismo. Infatti, le fluttuazioni nell'espressione della trascrizione potrebbero modificare l'efficienza della traduzione e, in ultima analisi, l'attività cellulare di una trascrizione. Sono stati sviluppati diversi approcci sperimentali per studiare l'emivita dell'mRNA, anche se alcuni di questi metodi hanno limitazioni che impediscono il corretto studio della modulazione posttranziale. Un sistema di induzione promotore può esprimere un gene di interesse sotto il controllo di un promotore sintetico regolato dalla tetraciclina. Questo metodo consente la stima dell'emivita di un dato mRNA in qualsiasi condizione sperimentale senza disturbare l'omeostasi cellulare. Uno dei principali inconvenienti di questo metodo è la necessità di traffecare le cellule, che limita l'uso di questa tecnica in cellule primarie isolate che sono altamente resistenti alle tecniche di trasfezione convenzionali. Le cellule epiteliali alveolar nella coltura primaria sono state ampiamente utilizzate per studiare la biologia cellulare e molecolare dell'epitelio alveolare. Le caratteristiche uniche e il fenotipo delle cellule alveolare primarie rendono essenziale studiare le modulazioni posttrantalionali dei geni di interesse in queste cellule. Pertanto, il nostro obiettivo era quello di sviluppare un nuovo strumento per studiare le modulazioni posttranscriptionali degli mRNA di interesse per le cellule epiteliali alveolar nella cultura primaria. Abbiamo progettato un protocollo di trasfezione transitoria veloce ed efficiente per inserire un sistema di espressione plasmid a controllo transciriptionally nelle cellule epiteliali alveolare primarie. Questa strategia di clonazione, usando un epito virale per etichettare il costrutto, consente la facile discriminazione dell'espressione costruttiva da quella degli mRNA endogeni. Utilizzando un metodo modificato del ciclo di quantificazione (Cq), l'espressione della trascrizione può quindi essere quantificata a intervalli di tempo diversi per misurarne l'emivita. I nostri dati dimostrano l'efficienza di questo nuovo approccio nello studio della regolazione posttrancriale in varie condizioni patologiche nelle cellule epiteliali alveolari primarie.

Introduzione

Sono state sviluppate diverse tecniche per determinare l'emivita degli mRNA. La tecnica di decadimento dell'impulso-chase, che utilizza mRNA etichettati, consente la valutazione simultanea di un grande pool di mRNA con disturbo cellulare minimo. Tuttavia, questo approccio non consente una stima diretta dell'emivita di una singola trascrizione genica e non può essere implementato per studiare la modulazione post-trascrizione di un mRNA in seguito alla stimolazione con fattori di crescita, ROS, alarmins o infiammazione1.

L'uso di inibitori della trascrizione, come l'actinomycin D e la z-amanitina, è un metodo relativamente semplice per misurare la cinetica da degradazione dell'mRNA nel tempo. Uno dei principali vantaggi di questo approccio rispetto a quello delle tecniche precedenti (cioè l'inseguimento a impulsi) si basa sulla capacità di stimare direttamente l'emivita di una determinata trascrizione e di confrontare il modo in cui i diversi trattamenti potrebbero influenzare la sua cinetica degradante. Tuttavia, il significativo impatto deleterio degli inibitori della trascrizione sulla fisiologia cellulare rappresenta un grave inconveniente dell'approccio2. Infatti, l'inibizione dell'intero trascrittoma cellulare con questi farmaci ha l'effetto collaterale negativo di perturare la sintesi di elementi chiave coinvolti nella stabilità dell'mRNA, come i microRNA (miRNA), nonché l'espressione e la sintesi delle proteine che legano l'RNA, che sono importanti per la degradazione e la stabilità dell'RNA. La grave perturbazione della trascrizione genica da parte di questi farmaci potrebbe quindi modificare artefatto le curve di degradazione delle trascrizioni.

Il sistema di induzione del promotore rappresenta un terzo approccio per misurare l'emivita di un mRNA specifico. Questo metodo misura la degradazione di un mRNA specifico in modo simile ai metodi che utilizzano inibitori della trascrizione. Vengono spesso utilizzati due tipi di sistemi di induzione: ilpromotore c-fos 3 indotto dal siero e il sistema inducibile Tet-Off4. Con il sistema c-fos, l'uso di inibitori della trascrizione che possono essere tossici per la cellula non è necessario. Tuttavia, questo metodo richiede la sincronizzazione del ciclo cellulare, che impedisce la valutazione della stabilità effettiva di una trascrizione durante l'interfase5. Al contrario, il sistema Tet-Off consente la forte espressione del gene di interesse (GOI) sotto il controllo di un promotore sintetico regolato dalla tetraciclina. Questo sistema richiede la presenza di due elementi che devono essere cotrastati nella cellula per essere funzionale. Il primo plasmide (pTet-Off) esprime la proteina regolatrice tTA-Adv, un fattore di trascrizione sintetica ibrido composto dal repressore procatotico TetR (da Escherichia coli) fuso a tre domini di trasattivazione della trascrizione dalla proteina virale HSV VP16. Il GOI è clonato nel plasmidp pTRE-Tight sotto il controllo di un promotore sintetico (PTight), che comprende la sequenza minima del promotore di citomegalovirus (CMV) fuso a sette ripetizioni della sequenza dell'operatore tetO. La trascrizione del gene a valle di PTight dipende dall'interazione di TetR con il tetO. In presenza di tetraciclina o della sua derivata, doxycycline, il repressore TetR perde la sua affinità per l'operatore tetO, portando ad una cessazione della trascrizione4. Le caratteristiche del sistema Tet-Off lo rendono un modello ideale per lo studio dell'espressione specifica dell'mRNA nelle cellule eucariotiche, evitando potenziali effetti pleiotropici che sono secondari all'assenza di sequenze regolatorie procariotiche nella cellula eucastica6. Di solito, doppiamente stabile Tet-Off linee cellulari (HEK 293, HeLa, e PC12) sono utilizzati con questo sistema per integrare copie del regolatore e plasmidi di risposta per un comodo accesso all'espressione genica controllabile7,8,9.

Diversi modelli di cellule epiteliali alveolare in coltura sono stati utilizzati per studiare la biologia cellulare e molecolare dell'epitelio alveolare. Per anni, i ricercatori hanno ampiamente utilizzato cellule primarie umane o roditori10,11 così come immortalato linee cellulari come a549 umano o ratto RLE-6TN cellule12,13. Anche se sono generalmente meno proliferale e più difficili da coltura e da transfettare, le cellule epiteliali alveolare nella coltura primaria rimangono il gold standard per lo studio della funzione e della disfunzione dell'epitelio alveolare in condizioni fisiologiche e patologiche. Infatti, le linee cellulari immortalate come le cellule A549 non presentano le caratteristiche complesse e i fenotipi delle cellule primarie, mentre le cellule epiteliali alveolari nella coltura primaria riassumono le principali proprietà dell'epitelio alveolare, in particolare la capacità di formare una barriera polarizzata e stretta14,15. Sfortunatamente, queste cellule sono molto resistenti alle tecniche di trasfezione convenzionali, come quelle che utilizzano liposomi, rendendo molto difficile l'uso di un sistema indotto dal promotore come il Tet-Off.

La modulazione posttranziale dei mRNA è uno dei metodi più efficaci per modulare rapidamente l'espressione genica di una trascrizione16. La regione non tradotta di mRNA 3' (3' UTR) svolge un ruolo importante in questo meccanismo. È stato dimostrato che, a differenza dell'UTR 5', esiste una correlazione esponenziale tra la lunghezza dell'UTR 3' e le complessità cellulari e morfologiche di un organismo. Questa correlazione suggerisce che l'UTR 3', come le regioni di codifica dell'mRNA, è stato sottoposto a selezione naturale per consentire una modulazione posttranscrittivale sempre più complessa nel corso dell'evoluzione17. L'UTR 3' contiene diversi siti di legame per proteine e miRNA che influenzano la stabilità e la traduzione della trascrizione.

Nel lavoro attuale, abbiamo sviluppato uno strumento per studiare il ruolo dei domini altamente conservati nell'UTR 3' di un GOI per il controllo della stabilità della trascrizione. Ci siamo concentrati sul canale epiteliale di sodio, sottounità alfa ( , che svolge un ruolo chiave nella fisiologia epiteliale alveolare18. Le cellule epiteliali alveolari nella coltura primaria sono state trascate con successo con i due componenti del sistema Tet-Off, il che consente di studiare il ruolo del 3' UTR nella stabilità dell'mRNA con un sistema che influisce minimamente sulla fisiologia cellulare e sul metabolismo rispetto all'uso di inibitori della trascrizione con altri protocolli. È stata sviluppata una strategia di clonazione per differenziare l'espressione del GOI da quella del gene endogeno utilizzando un epitopo non endogenamente espresso (V5). La risposta e i plasmidi normativi sono stati poi trasferiti nelle cellule epiteliali alveolare utilizzando una tecnica di elettroporazione pipetta. Successivamente, l'espressione della trascrizione è stata misurata incubando le cellule con doxycyclina a diversi intervalli di tempo. L'emivita della trascrizione è stata valutata da RT-qPCR con un metodo Cq modificato utilizzando il prodotto transfetto tTA-Ad mRNA per la normalizzazione. Attraverso il nostro protocollo, offriamo un modo conveniente per studiare la modulazione posttrancrionale di una trascrizione in diverse condizioni e definire il coinvolgimento delle regioni non tradotte in modo più dettagliato.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte secondo le linee guida del Canadian Council on Animal Care e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura degli animali del Centro di ricerca del Centro di Ricerca del Centro Ospedaliero de l'Université de Montréal (CRCHUM).

1. Progettazione e generazione del plasmide di risposta che esprime il gene di interesse (GOI)

  1. Utilizzare un vettore inducibile di tetraciclina, ad esempio pTRE-Tight.
  2. Analizzare la sequenza del GOI e del sito di clonazione multipla (MCS) del vettore per identificare i siti di restrizione nel servizio MCS che non sono presenti internamente nel GOI.
  3. Isolare le cellule epiteliali alveolare primarie dai polmoni di ratto Sprague-Dawley maschili come descritto in precedenza19,20.
  4. Purificare l'RNA totale dalle cellule epiteliali alveolare mediante l'estrazione dell'RNA utilizzando un metodo standard, come l'estrazione del fenolo/cloroformio o l'uso di colonne di spin dell'RNA a base di silice.
  5. Trascrivere in modo inverso l'mRNA in DNA complementare (cDNA) usando oligo(dT) e la trascrizione inversa ad alta fedeltà.
  6. Utilizzare la polimerasi Taq ad alta fedeltà e le tecniche PCR di sovrapposizione standard per affiancare il GOI con due siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione selezionati utilizzando primer progettati.
    1. Chiedi al primer in avanti di contenere un sito di legame di consensoKozak 21 per migliorare i livelli di espressione per studiare l'espressione proteica in parallelo con la stabilità dell'mRNA. Una sequenza che codifica l'epitopo V5 a monte del GOI deve essere inclusa per distinguere l'espressione del GOI trasinfezione dall'espressione endogena (Tabella 1).
    2. Chiedi al primer inverso di contenere un segnale di poliadenilazione dopo lo stop codon.
  7. I mutanti possono essere generati mediante delezione sequenziale per studiare gli effetti di diverse regioni UTR 3' sulla stabilità dell'mRNA del GOI utilizzando primer invertiti che codificano un sito di poliadenazione che elimina gradualmente la fine 3' dell'UTR(Figura 6). In alternativa, la mutagenesi diretta da PCR può essere utilizzata per indirizzare una specifica regione di interesse nell'UTR223' .
  8. Digerire il vettore inducibile e l'inserto con gli enzimi di restrizione scelti in precedenza alla temperatura di incubazione appropriata per 1 h, seguiti dal trattamento con fosfana durante la reazione vettoriale per 30 min per evitare l'auto-legamento.
  9. Separare il vettore digerito e i segmenti di inserto per elettroforesi in un gel di agarose 1-1,5% (concentrazione a seconda delle dimensioni dell'inserto).
  10. Utilizzando una lama e una luce UV, raccogliere i frammenti di DNA contenenti l'inserto e il vettore desiderato da ligated.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.
  11. Purificare i segmenti raccolti dal gel di agarose utilizzando un kit di purificazione PCR a base di silice e misurare la concentrazione per spettrofotometria a 260 nm.
  12. Ligate il GOI e il vettore inducibile con legamento del DNA T4 utilizzando un rapporto molare vector:insert di 1:3 per aumentare la probabilità di legatura. Incubare la reazione a temperatura ambiente (RT) per 3 h.
  13. Trasformare la reazione di legatura in competente E. coli (DH5).
    1. Aggiungere 1-10 ng di vettore e gene a un tubo contenente 100 -L di cellule competenti. Incubare le cellule sul ghiaccio per 30 min e poi le cellule di shock termico a 42 s. per 45 s. Mettere il tubo sul ghiaccio per 2 min e aggiungere 900 L di mezzo RT LB. Incubare le cellule per 1 h a 37 s con agitazione a 225 giri/min.
    2. Stendere 100 l della reazione su una piastra di agar LB con un antibiotico adatto (ad esempio, 100 ampicillina g/mL per il vettore pTRE-Tight) per selezionare i batteri trasformati. Incubare la piastra per una notte a 37 gradi centigradi.
    3. Selezionare le singole colonie utilizzando un ciclo di inoculazione o una punta di 20 -L e incubare durante la notte in mezzo 5 mL LB contenente l'antibiotico adatto a 37 gradi centigradi con agitazione. I batteri trasformati possono essere immagazzinati in scorte di glicerolo a -80 gradi centigradi ad un rapporto di 400:600 di LB medio a glicerolo.
  14. Estrarre il DNA plasmide utilizzando colonne di plasmico a base di silice e misurare la concentrazione per spettrofotometria a 260 nm. Confermare l'inserimento del GOI mediante l'analisi delle restrizioni e il suo orientamento e l'assenza di mutazioni potenzialmente introdotte durante RT-PCR mediante sequenziamento.

2. Trasfezione del plasmide di risposta che esprime il gene di interesse (GOI) in cellule epiteliali alveolar primarie

  1. Isolare le cellule epiteliali alveolare di tipo II dai polmoni del ratto.
  2. Semina le cellule ad una densità di 1 x 106 celle/cm2 in 100 mm piatti Petri con mezzo essenziale minimo completo (MEM completo). MEM completo è MEM integrato con 10% FBS, 0.08 mg/L tobramycin, Septra (3 g/mL trimethoprim e 17 zollo-mL sofamethoxazole), 0.2% NaHCO3, 0.01 M HEPES (pH - 7.3), e 2 mM L-glutamine. Colture le cellule per 24 h a 37 gradi centigradi in 5% CO2 in un'incubatrice umidificata.
  3. Il giorno successivo, mettere 500 l una di MEM completa senza antibiotico in ogni pozzo di una nuova piastra da 12 pozze e preriscaldare la piastra a 37 gradi centigradi per 30 minuti. Durante questo passaggio, è importante utilizzare siero bovino fetale privo di tetracicline contaminanti o con un livello troppo basso per interferire con l'inducibilità.
  4. Preparare tubi da 1,5 mL contenenti il plasmide con il GOI inducibile (plasmide GOI) e il vettore regolatore (ad esempio, pTet-Off) aggiungendo 1 g di plasmide GOI e 1 g di vettore regolatore per pozzo a RT. Per gli esperimenti di coespressione con le proteine leganti l'RNA (RBP), al mix di DNA(Figura 7)viene aggiunto uno g di un vettore costitutivo (ad esempio, pcDNA3) che esprime l'RPB di interesse al mix di DNA ( Figura 7 ).
  5. Aspirare il mezzo e sciacquare delicatamente le cellule con PBS (senza calcio e magnesio) preriscaldato a 37 gradi centigradi.
  6. Aggiungere 5 mL di 0,05% di metapsina preriscaldata a 37 gradi centigradi e incubare le cellule fino a quando le cellule non vengono staccate (2-4 min). Neutralizzare la prova aggiungendo 10 mL di MEM completo senza antibiotici.
  7. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 50 mL, lavare la piastra Petri con 4 mL di mezzo per raccogliere il maggior numero possibile di cellule rimanenti, quindi centrificare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 min.
  8. Aspirare delicatamente e scartare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di PBS. Contare e calcolare il numero di celle utilizzando un emocitometro.
  9. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min. Aspirare delicatamente il supernatante e riutilizzare il buffer di sospensione del pellet ad una concentrazione di 4 x 107 celle / mL. Aggiungere le cellule del tubo da 1,5 mL preparate al punto 2,4 con una concentrazione di 400.000 cellule per pozzo e mescolarle delicatamente pipetting su e giù.
  10. Posizionare il tubo nel dispositivo di elettroporazione e riempirlo con 3,5 mL di tampone elettrolitico.
  11. Inserire una punta di elettrodo placcato oro in una pipetta premendo completamente il pistone. Mescolare delicatamente il contenuto del tubo da 1,5 mL e aspirare con cura le cellule con la pipetta. Fare attenzione a evitare che le bolle d'aria entrino nella punta, in quanto ciò causerà l'arco elettrico durante l'elettroporazione e porterà a una diminuzione dell'efficienza della trasfusione.
  12. Inserire la pipetta nella stazione di elettroporazione fino a quando non c'è un suono di clic.
  13. Selezionare il protocollo di elettroporazione appropriato per le celle epiteliali alveolare, corrispondente a una tensione a impulsi di 1.450 V e 2 impulsi con una larghezza di 20 ms, quindi premere Start sul touchscreen.
  14. Subito dopo la trasfezione, rimuovere la pipetta e trasferire le cellule in un MEM completo precedentemente riempito senza antibiotico che è stato preriscaldato a 37 gradi centigradi.
  15. Ripetere i passaggi da 2,11 a 2,14 per i campioni rimanenti.
  16. Scuotere delicatamente la piastra per stendere le cellule in modo uniforme sulla superficie del pozzo. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi nel 5% di CO2 in un'incubatrice umidificata. Dopo 2 giorni, sostituire il mezzo con MEM completo con antibiotici.
  17. Confermare il successo della trasfezione osservando l'espressione di eGFP al microscopio a fluorescenza o per citometria di flusso utilizzando un vettore di controllo (Figura 1).
    NOTA: questo passaggio è facoltativo e richiede una fase di trasfezione aggiuntiva utilizzando un diverso plasmide che esprime eGFP, ad esempio pcDNA3-EGFP.

3. Induzione dell'inibizione della trascrizione del GOI

NOTA: Le cellule possono essere pretrattate con i trattamenti desiderati prima dell'induzione della doxyciclina per valutarne l'impatto sulla stabilità dell'mRNA (Figura 5).

  1. Preparare una soluzione di stock doxycycline di 1 mg/mL in acqua deionizzata. Conservare la soluzione di riserva a -20 gradi centigradi, protetta dalla luce. La doxyciclina, derivata da tetraciclina, viene utilizzata al posto della tetraciclina perché ha un'emivita più lunga (2x) della tetraciclina. Inoltre, è necessaria una minore concentrazione di doxycycline per la completa inattivazione del tet operon23.
    NOTA: La doxycyclina potrebbe influenzare l'espressione mRNA del GOI endogeno. Per verificare questo, l'effetto di un trattamento di 24 ore con doxycyclina sulle cellule alveolar deve essere testato per confermare l'assenza di eventuali cambiamenti nell'espressione GOI (Figura 2).
  2. Preparare una soluzione doxycycline fresca di 1 g/mL in completa meM 72 h post-trasfezione e scaldarla a 37 gradi centigradi.
  3. Sostituire il mezzo con 1 mL di MEM completo contenente 1 g/mL di doxycyclina per bene per inibire la trascrizione del GOI.
  4. Incubare più pozzi a 37 gradi centigradi nel 5% di CO2 per diverse quantità di tempo da 15 min-6 h per valutare l'emivita dell'mRNA del GOI.
  5. Alla fine del trattamento, lavare le cellule con PBS ghiacciato e visualizzarle con un kit di estrazione dell'RNA fenolo-cloroformio disponibile in commercio aggiungendo 500 L di tampone per pozzo e agitando la piastra per omogeneizzare le cellule.
  6. Isolare l'RNA in base al protocollo del produttore. Determinare la resa e la purezza dell'RNA mediante spettrofotometria a 230, 260 e 280 nm. I campioni di RNA con rapporti 260:230 e 260:280 di 1,8 e 2,0, rispettivamente, sono considerati puri.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

4. Determinazione della stabilità dell'mRNA del GOI

  1. Trattare 1 g di RNA totale con DNAse I (grado amplificazione) privo di RNAse per rimuovere qualsiasi traccia di DNA plasmide che potrebbe interferire con la successiva amplificazione del DNA.
    1. In un tubo PCR da 0,2 mL, unire 1 g di RNA totale, 1 -L di 10 volte buffer di reazione DNase I, 1 -L di DNAse I (1 U/L) e acqua senza RNAse per ottenere un volume totale di 10 L.
    2. Incubare la reazione a RT per 20 min.
    3. Disattivare il DNeAe I aggiungendo 1 OL di 25 mM di EDTA al mix di reazione da 10 litri e incubando la reazione a 70 gradi centigradi per 10 min.
  2. Transizza l'RNA totale impoverito dal DNA in cDNA utilizzando un kit di sintesi cDNA disponibile in commercio con una miscela di oligo(dT) e primer esalofi casuali per migliorare l'efficienza della trascrizione inversa.
    1. Aggiungete in breve 4 l di mix di reazione da 5 x, 1 luna di trascrizione inversa e 4 luna di acqua priva di RNAse a 11 l del mix di RNA totale impoverito di DNA per ottenere un volume di reazione totale di 20 L. Mescolare bene la reazione perpiperla su e giù.
    2. Incubare la reazione per 5 minuti a 25 gradi centigradi, seguita da 20 minuti a 46 gradi centigradi, quindi inattivare la reazione incubandola a 95 gradi centigradi per 1 min. Ogni reazione produrrà 50 ng/L di prodotto cDNA.
    3. Diluire la reazione cDNA a una concentrazione di 5 ng/L aggiungendo 180 l'acqua di biologia molecolare al mix di reazione 20 . Conservare i prodotti cDNA a -80 gradi centigradi o procedere immediatamente all'esecuzione di PCR quantitativo in tempo reale (qPCR).
      NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.
  3. Progettare i primer qPCR in avanti e indietro specifici per il GOI.
    1. A causa dell'espressione endogena del GOI nelle celle, i primer devono essere progettati per amplificare un amplificatore da 100-150 bp dell'epitopo V5 accoppiato al GOI (Tabella 1).
    2. I primer genici di riferimento interno devono essere utilizzati anche come controlli di normalizzazione. Di solito, i geni delle pulidi, come i geni beta-actina e ipoxanthine fosfororaltransferyase 1, vengono utilizzati come geni di riferimento. Tuttavia, questi non possono essere utilizzati con questo sistema di induzione a causa della variazione dell'efficienza di trasfezione. Invece, l'espressione della trascrizione tTA-Ad viene valutata ai fini della normalizzazione, perché la sua espressione è costituitiva nelle cellule a causa dell'attività del promotore del citomegalovirus. Qualsiasi variazione nella sua espressione misurata da qPCR sarà rappresentativa dell'efficienza della trasfezione (primer: forward 5'-GCC TGA CGA CAGA CAA GGA AAC TC-3' e reverse 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) e consentirà la normalizzazione dell'espressione dei cloni transfettati (Figura 3).
  4. Preparare ogni reazione qPCR in triplice copia utilizzando un mix di master colorante verde SYBR.
    1. Diluire il mix di cDNA 5 ng/L l a una concentrazione di 1,25 ng/L utilizzando acqua di biologia molecolare.
    2. Unire 5 gradi di Miscela Master di Coloranti Verde (2x), 0,1 l di acqua di biologia molecolare, 0,45 l di 7,5 M di primer in avanti, 0,45 L di 7,5 M di primer inverso e 4 gradi di 1,25 ng/L cDNA per ottenere un volume di reazione totale di 10,5 M ben da pipettaggio e giù in un piatto di 96 PC. Utilizzare pellicola adesiva ottica per garantire che il coperchio della piastra sia sigillato e per evitare la contaminazione e l'evaporazione.
    3. Abbassare brevemente il mix di reazione mediante centrifugazione e posizionare la piastra in un termociclista qPCR.
  5. Amplificare gli amplificatori GOI e tTA-Ad con tag V utilizzando le seguenti condizioni qPCR: 95 s per 10 min come fase di denaturazione, seguiti da 40 cicli di 95 gradi centigradi per 10 s, 58 gradi centigradi per 15 s e 72 gradi centigradi per 20 s. Una curva di fusione ad alta risoluzione deve essere generata dopo l'esecuzione dei cicli di amplificazione per valutare le temperature di fusione specifiche degli amplificatori desiderati e per garantire l'assenza di picchi di amplificatori rumore.
    1. Includere controlli negativi per il qRT-PCR eseguendo qPCR con RNA come modello senza trascrizione inversa per fungere da controllo per la potenziale contaminazione del DNA plasmide e qPCR senza cDNA aggiunto al mix qPCR per garantire la mancanza di dimeri primer o Contaminanti.
    2. La concentrazione ottimale di cDNA, l'efficienza del primer e la concentrazione devono essere ottimizzate secondo il GOI da un analisi della curva standard. A tale scopo, eseguire una diluizione seriale utilizzando cDNA da cellule non trattate (coltivate senza doxyciclina). La curva standard viene generata tracciando i valori Cq rispetto al registro del fattore di diluizione cDNA e l'efficienza di amplificazione (E) viene calcolata in base alla pendenza della curva standard utilizzando la seguente formula:
      E - 10-1/pendenza
      NOTA: l'efficienza di amplificazione dovrebbe essere di circa 0,9 a 1,05. In caso contrario, i primer devono essere riprogettati.
  6. Analizzare i dati qPCR utilizzando il metodo Cq comparativo normalizzando i valori di espressione del GOI in base all'espressione di tTA-Ad per ottenere i livelli di espressione relativi del GOI e per segnalare la sua espressione come percentuale dell'espressione mRNA del GOI nelle celle dello stesso animale al punto di partenza (t ) (Figura 4).
  7. L'emivita è determinata dalla costante di frequenza (K) della curva di degradazione dell'mRNA GOI utilizzando la seguente equazione:
    t1/2 - ln 2/K.

Risultati

Questo protocollo è stato utilizzato con successo per generare un sistema di espressione plasmid etransriptionally controllata Tet-Off per valutare l'importanza di diverse porzioni dell'UTR di ENaC 3' nella modulazione della stabilità della trascrizione nelle cellule epiteliali alveolar primarie.

Il primo passo nell'implementazione di questo sistema è stato quello di stabilire una tecnica di trasfezione rapida, facile ed effi...

Discussione

Il basso tasso di trasfezione delle cellule epiteliali alveolari nella coltura primaria è stata una grave limitazione per l'uso del sistema Tet-Off per valutare la stabilità dell'mRNA in queste cellule. Tuttavia, questa limitazione è stata superata dall'elettroporazione delle pipette, consentendo un'efficienza di trasfezione del 25-30%(Figura 1 e Figura 3)26.

La misurazione della stabilità della trascrizion...

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Riconoscimenti

Francis Migneault è stato sostenuto da una borsa di studio fornita dal Quebec Respiratory Health Network e dal programma di formazione polmonare del Canadian Institutes of Health Research (CIHR), da uno studente del FRSQ e da una borsa di studio della Faculté des'tudes Supérieures et Post-dottorato, Université de Montréal. Questo lavoro è stato sostenuto dalla cattedra Gosselin-Lamarre nella ricerca clinica e dai Canadian Institutes of Health Research [YBMOP-79544].

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Actinomycin DSigma-AldrichA9415
AmpicillinSigma-AldrichA1593
Bright-LineHemacytometerSigma-AldrichZ359629
Chloroform - Molecular biology gradeSigma-AldrichC2432
ClaINew England BiolabsR0197S
CycloheximideSigma-AldrichC7698
DM IL LED Inverted Microscope with Phase ContrastLeica-
DNase I, Amplification GradeInvitrogen18068015
Doxycycline hyclateSigma-AldrichD9891-1G
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesiumWisent Bioproducts311-425-CL
Ethanol - Molecular biology gradeFisher ScientificBP2818100
Excella E25 ConsoleIncubatorShakerEppendorf1220G76
GlycerolSigma-AldrichG5516
HEPES pH 7.3Sigma-AldrichH3784
Heracell 240iThermoFisher Scientific51026420
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad Laboratories1708890
Isopropanol - Molecular biology gradeSigma-AldrichI9516
LB Broth (Lennox)Sigma-AldrichL3022
LB Broth with agar (Lennox)Sigma-AldrichL2897
L-glutamineSigma-AldrichG7513
Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10Sigma-AldrichL9143
MEM, powderGibco61100103
MicroAmp Optical 96-Well Reaction PlateApplied BiosystemsN8010560
MicroAmp Optical Adhesive FilmApplied Biosystems4360954
MSC-Advantage Class II Biological Safety CabinetsThermoFisher Scientific51025413
Mupid-exU electrophoresis systemTakara BioAD140
NanoDrop 2000cThermoFisher ScientificND-2000
Neon Transfection System 10 µL KitInvitrogenMPK1025
Neon Transfection System Starter PackInvitrogenMPK5000S
NheINew England BiolabsR0131S
One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coliInvitrogenC854003
pcDNA3 vectorThermoFisher ScientificV790-20
pcDNA3-EGFP plasmidAddgene13031
PlatinumTaqDNA Polymerase High FidelityInvitrogen11304011
pTet-Off Advanced vectorTakara Bio631070
pTRE-Tight vectorTakara Bio631059
Purified alveolar epithelial cellsn.a.n.a.
QIAEX II Gel Extraction KitQIAGEN20021
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12162
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27104
QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System SoftwareApplied Biosystemsn.a.
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well FastApplied Biosystems4485697
Recombinant Rat TNF-alpha ProteinR&D Systems510-RT-010
SeptraSigma-AldrichA2487
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)New England BiolabsM0371S
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725270
SuperScript IV Reverse TranscriptaseInvitrogen18090010
T4 DNA LigaseThermoFisher ScientificEL0011
Tet System Approved FBSTakara Bio631367
TobramycinSigma-AldrichT4014
TRIzol ReagentInvitrogen15596018
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300054
UltraPure AgaroseInvitrogen16500500
Water, Molecular biology GradeWisent Bioproducts809-115-EL

Riferimenti

  1. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
  2. Ljungman, M. The transcription stress response. Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).
  3. Ross, J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).
  4. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
  5. Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
  6. Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
  7. Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
  8. Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).
  9. Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
  10. Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
  11. Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).
  12. Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
  13. Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
  14. Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).
  15. Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
  16. Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. Regulatory functions of 3'UTRs. Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).
  17. Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
  18. Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
  19. Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
  20. Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
  21. Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
  22. Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
  23. Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. . Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. , (2001).
  24. Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
  25. Migneault, F. . Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites. , (2015).
  26. Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
  27. Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
  28. Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).
  29. Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
  30. Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
  31. Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

GeneticaNumero 157trasfezione transitoriacoltura primariacellule epiteliali alveolaristabilit dell mRNA3 UTRdoxycyclinaTet Offespressione inducibile

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati