有效转录控制质粒表达系统，用于研究原发性奥子拉皮细胞中mRNA笔录稳定性

摘要

在这里，我们提出了一个工具，可以用来研究原脑外皮细胞中笔录的后笔次调制，方法是使用可诱导的表达系统耦合到移液器电穿孔技术。

摘要

研究转录后调节对于理解给定信使RNA（mRNA）的调制及其对细胞平衡和代谢的影响至关重要。事实上，笔录表达的波动可以改变笔录的翻译效率，并最终改变笔录的细胞活动。已经开发了几种实验方法来研究mRNA的半衰程，尽管其中一些方法有局限性，无法对后笔后调制进行适当的研究。促进剂诱导系统可以在合成四环素调节促进剂的控制下表达感兴趣的基因。该方法允许在任何实验条件下对给定mRNA进行半衰期估计，而不会干扰细胞平衡。这种方法的一个主要缺点是转染细胞的必要性，这限制了在对传统转染技术高度抗性的分离原发细胞中使用这种技术。原发培养中的阿尔维拉尔上皮细胞已广泛用于研究阿尔维拉尔上皮细胞和分子生物学。原性球状细胞的独特特性和表型使得研究这些细胞中感兴趣的基因的转录后调制至关重要。因此，我们的目标是开发一种新的工具，以研究在原发培养中，对阿尔维拉尔上皮细胞感兴趣的mRNA的后笔后调制。我们设计了一种快速高效的瞬态转染方案，将转录控制的质粒表达系统插入原发性上皮细胞。这种克隆策略，使用病毒表位来标记构造，允许从内源性mRNA的构造表达式容易区分。使用经过修改的+量化周期 （Cq） 方法，可以以不同的时间间隔对笔录的表达式进行量化，以测量其半衰。我们的数据证明了这种新方法在研究原发性外皮细胞中各种病理生理条件下的后转后调节方面的效率。

引言

已经开发出几种技术来确定mRNA的半衰程。脉冲-追逐衰减技术，利用标记的mRNA，允许同时评估一个大池的mRNA，最小的细胞扰动。然而，这种方法不允许直接估计单个基因转录的半衰期，不能实施研究mRNA在刺激后与生长因子，ROS，报警，或炎症¹的后转后调制。

使用转录抑制剂，如行为霉素D和β-阿马尼特，是一种相对简单的方法，测量mRNA降解动力学随着时间的推移。与以前的技术（即脉冲追逐）相比，这种方法的一个主要优点依赖于直接估计给定笔录的半衰程并比较不同处理如何影响其降解动力学的能力。然而，转录抑制剂对细胞生理学的显著有害影响是方法²的一个主要缺点。事实上，用这些药物抑制整个细胞转录素具有干扰mRNA稳定性关键元素（如微RNA（miRNA））的合成，以及RNA结合蛋白的表达和合成，这对mRNA降解和稳定性非常重要。"因此，这些药物对基因转录的严重扰动可以实际改变转录器的降解曲线。

启动器诱导系统是测量特定 mRNA 半衰程的第三种方法。此方法测量特定 mRNA 的降解方法与使用转录抑制剂的方法类似。经常使用两种类型的诱导系统:血清诱导的c-fos促进剂³和Tet-Off诱导系统^4。使用 c-fos 系统时，无需使用对细胞有毒的转录抑制剂。但是，此方法需要细胞周期同步，从而阻止在相位⁵期间评估笔录的实际稳定性。相反，Tet-Off系统允许在合成四环素调节促进剂的控制下强烈表达感兴趣的基因（GOI）。此系统需要存在两个元素，必须共同转换到细胞中才能正常工作。第一个质粒（pTet-off）表示调节蛋白tTA-Adv，一种混合合成转录因子，由原核抑制剂TetR（来自大肠杆菌）融合到病毒蛋白HSV VP16的三个转录转活域。GOI在合成启动子（P_Tight）的控制下克隆成pTRE-Tight质粒，包括微小病毒（CMV）促进剂的最小序列，并融合到ttO运算符序列的七次重复。P_Tight下游基因的转录取决于TetR与TtO的相互作用。在四环素或其衍生物多西环素的存在下，TetR抑制器失去对ttO运算符的亲和力，导致转录⁴停止。Tet-Off系统的特点使其成为研究真核细胞中特定mRNA表达的理想模型，同时避免潜在的普列益效应，这种效应与真核细胞⁶中缺乏原核调控序列是次要的。通常，双稳定Tet-off细胞系（HEK 293，HeLa和PC12）用于集成调节器和响应质粒的副本，以方便获得可控基因表达^7，8，9。

培养中的藻菌上皮细胞的几种模型被用来研究阿尔维拉尔上皮细胞的细胞和分子生物学。多年来，研究人员广泛利用了人类或啮齿动物原细胞^10、11以及不朽的细胞系，如人类A549或大鼠RLE-6TN细胞^12、13。虽然它们通常繁殖较少，更容易培养和转染，但原生培养中的奥维拉尔上皮细胞仍然是研究生理和病理条件下奥维拉尔上皮功能和功能障碍的黄金标准。事实上，不朽的细胞系，如A549细胞，没有表现出原细胞的复杂特性和表型，而原发培养物中的球状上皮细胞重述了食位细胞上皮的主要特性，特别是形成偏振和紧密屏障^{的能力14，15。}不幸的是，这些细胞对传统的转染技术非常耐受，例如使用脂体，使得使用启动器诱导系统（如Tet-Off）非常困难。

mRNA的后转后调制是快速调节转录¹⁶基因表达的最有效方法之一。mRNA 3' 未翻译区域 （3' UTR） 在这一机制中起着重要的作用。已经表明，与5'UTR不同，3'UTR的长度与生物体的细胞和形态复杂性之间存在指数相关性。这种相关性表明，3'UTR，像mRNA编码区域一样，一直受到自然选择，以便在整个进化过程中进行越来越复杂的后转后调制^17。3' UTR包含几个蛋白质和miRNA结合位点，影响笔录的稳定性和翻译。

在目前的工作中，我们开发了一个工具，用于调查高度保守的域在 GOI 3' UTR 中控制笔录稳定性的作用。我们专注于上皮钠通道，α亚基（#ENaC），在上皮生理学中起着关键作用^18。在原发培养中，Alveolar上皮细胞成功地与Tet-Off系统的两个组件进行瞬态转染，这使得可以研究与使用转录抑制剂与其他协议相比，3'UTR在mRNA稳定性中的作用。开发了一种克隆策略，使用非内源表达表皮（V5）将GOI的表达与内源基因的表达区分开来。然后，使用移液器电穿孔技术将反应和调节质粒转移到电体上皮细胞中。随后，通过以不同时间间隔孵育多西环素细胞来测量笔录的表达。RT-qPCR使用经过转染的tTA-Ad mRNA产物对笔录的半衰程进行了评价，并采用经过改造的Cq方法进行规范化。通过我们的协议，我们为研究不同条件下成绩单的后笔调制和更详细地定义未翻译区域的参与提供了一种便捷的方法。

研究方案

所有动物程序都是根据加拿大动物护理理事会的指导方针进行的，并经蒙特利尔大学中心研究中心机构动物护理委员会批准。

1. 表达感兴趣的基因的响应质粒的设计与生成（GOI）

1. 使用可诱导的四环素关闭矢量，如 pTRE-Tight。
2. 分析向量的 GOI 和多个克隆站点 （MCS） 的顺序，以标识在 GOI 内部不存在的 MCS 中的限制站点。
3. 分离原发性肺泡上皮细胞从雄性斯普拉格-道利大鼠肺，如先前描述的^19，20。
4. 使用标准方法（如酚类/氯仿提取或使用基于二氧化硅的RNA自旋柱）提取从藻类上皮细胞中纯化总RNA。
5. 使用寡聚（dT）和高保真反向转录酶将mRNA反向转录成互补DNA（cDNA）。
6. 使用高保真Taq聚合酶和标准重叠PCR技术，使用设计引物，用两个选定的限制性酶识别位点来对GOI进行侧翼。
   1. 有前引底器含有Kozak共识核糖体结合位点²¹以提高表达水平，以研究蛋白质表达与mRNA稳定性并行。必须包含编码 GOI 上游 V5 表皮的序列，以区分转染 GOI 的表达式和内源表达式（表 1）。
   2. 在停止 codon 后，让反向底漆包含多反解信号。
7. 突变体可以通过顺序删除生成，以研究不同3'UTR区域对GOImRNA稳定性的影响，使用反向底漆编码多反解位，逐渐删除GOI 3'UTR的3'末端（图6）。或者，PCR定向诱变可用于瞄准3'UTR²²中感兴趣的特定区域。
8. 在适当的孵化温度下消化诱导载体和插入物，在适当的孵育温度下为1小时，随后在病媒反应30分钟内用磷酸酶进行治疗，以避免自我连接。
9. 将消化的矢量分开，通过电泳将分段插入 1-1.5% 的琼脂胶凝胶中（浓度取决于刀片大小）。
10. 使用刀片和紫外线，收集包含所需插入和矢量的DNA片段进行连接。
    注: 协议可以在这里暂停。
11. 使用基于二氧化硅的PCR纯化试剂盒从琼脂凝胶中净化收集的片段，并通过260nm的分光光度测量浓度。
12. 使用载体:插入摩尔比1:3，增加连接概率，用T4 DNA连接物对GOI和诱导载体进行连接。在室温 （RT） 下孵育反应 3 小时。
13. 将结扎反应转化为合格的大肠杆菌（DH5+）。
    1. 将1-10纳克的载体和基因添加到含有100μL的合格细胞的管子中。将细胞孵育在冰上30分钟，然后在42°C下将热休克细胞孵化45秒。将管子放在冰上2分钟，加入900μL的RT LB介质。在37°C下孵育细胞1小时，在225 rpm时摇动。
    2. 使用合适的抗生素（例如，pTRE-Tight载体的100微克/mL安培霉素）在LB加盘上传播100 μL的反应，以选择转化的细菌。在37°C下孵化板过夜。
    3. 使用接种回路或 20 μL 尖端选择单个菌落，并在 5 mL LB 介质中孵育过夜，在 37 °C 下摇动适当的抗生素。转化后的细菌可储存在-80°C的甘油中，LB介质与甘油的比率为400:600。
14. 使用硅基质粒柱提取质粒DNA，并在260nm的分光光度测量浓度。通过限制分析及其方向确认 GOI 的插入，以及 RT-PCR 期间通过测序可能引入的突变。

2. 将表达感兴趣基因（GOI）的反应质粒转染到原发性上皮细胞中

1. 将II型肺泡上皮细胞与大鼠肺部分离。
2. 以1 x 10⁶细胞/厘米²的密度在100毫米培养皿中播种细胞，具有完整的最小必要介质（完整的MEM）。完整的MEM是MEM补充10%FBS，0.08毫克/升托布拉霉素，塞普特拉（3微克/米左三米酮和17微克/米硫酸盐氧西索），0.2%NaHCO 3，0.01M HEPES（pH = 7.3），和2 mM L-谷氨酰胺。在加湿培养箱中，在37°C下在5%的_CO2中培养细胞24小时。
3. 第二天，在新的12孔板的每个孔中放置500μL的完整MEM，并在37°C预热30分钟。在此步骤中，使用无污染四环素或水平过低、无法干扰诱导性的胎儿牛血清非常重要。
4. 通过在RT上每口井添加1μg的GOI质粒和1μg的调节载体，准备含有可诱导GOI（GOI质粒）和调节载体（例如pTet-off）的1.5 mL管。对于与RNA结合蛋白（RBP）共同表达实验，在DNA混合物中添加了表示感兴趣的RPB的组成载体（例如pcDNA3）的1μg（如图7）。
5. 吸气介质，用PBS（不含钙和镁）在37°C预热时轻轻冲洗细胞。
6. 加入5 mL 0.05%胰蛋白素，在37°C预热，并孵育细胞，直到细胞分离（2-4分钟）。通过添加10 mL的完整MEM，不含抗生素，中和胰蛋白酶。
7. 将细胞悬浮液收集在50 mL管中，用4 mL的介质清洗培养皿，以收集尽可能多的剩余细胞，然后将细胞悬浮液在300 x g下离心5分钟。
8. 轻轻吸气并丢弃上清液，并在 1 mL PBS 中重新悬浮颗粒。使用血细胞计计数和计算细胞数。
9. 将细胞在300 x g下离心5分钟。轻轻吸气上清液，以4 x 10⁷细胞/mL的浓度在重新悬浮液中重新悬浮颗粒。从步骤 2.4 中制备的 1.5 mL 管中加入细胞，每口井浓度为 400，000 个细胞，并通过上下移液轻轻混合。
10. 将管子放入电镀装置中，并填充3.5 mL的电解缓冲液。
11. 通过完全按下活塞，将镀金电极尖端插入移液器中。轻轻混合 1.5 mL 管的内容，并小心地将细胞与移液器吸气。小心防止气泡进入尖端，因为这将导致电弧在电镀过程中，并导致转染效率下降。
12. 将移液器插入电镀站，直到发出咔嗒声。
13. 为电体上皮细胞选择适当的电穿孔协议，与1，450 V的脉冲电压和2个宽度为20 ms的脉冲相对应，然后按触摸屏上的"开始"。
14. 转染后立即取出移液器，将细胞转移到以前充满完整MEM的井中，而没有抗生素，抗生素已预热至37°C。
15. 对其余样品重复步骤 2.11-2.14。
16. 轻轻摇动板，使细胞均匀地扩散到井面上。在加湿培养箱中以5%的_CO2在37°C下孵育细胞。2天后，用抗生素用完整的MEM代替介质。
17. 通过观察荧光显微镜下eGFP的表达或使用控制载体的流细胞学，确认转染成功（图1）。
    注:此步骤是可选的，需要使用表达 eGFP 的不同质粒（如 pcDNA3-EGFP）进行额外的转染步骤。

3. 诱导GOI的转录抑制

注:细胞可以在多西环引入前用所需的治疗进行预处理，以评估其对mRNA稳定性的影响（图5）。

1. 在去离子水中制备1mg/mL的多氧环素库存溶液。将库存溶液存放在 -20°C，防止光线照射。多西环素，四环素衍生物，是使用而不是四环素，因为它的半衰程长（2倍）比四环素。此外，需要低浓度的多西环素完全失活^23。
   注:多西环素可能影响内源性GOI的mRNA表达。为了验证这一点，应测试24小时用多西环素治疗对卵泡细胞的影响，以确认GOI表达中没有任何变化（图2）。
2. 在全MEM 72 h转染后制备新鲜的1μg/mL多氧环素溶液，并将其加热到37°C。
3. 将介质更换为1 mL的完整MEM，每口井含有1μg/mL多氧环素，以抑制GOI的转录。
4. 在37°C下以5%CO₂孵育多口井，时间从15分钟-6小时的不同时间，以评估GOI的mRNA半衰程。
5. 在治疗结束时，用冰冷的PBS清洗细胞，然后通过每孔加入500μL的缓冲液和摇动板使细胞均质，用市售的酚-氯仿RNA提取试剂盒将其压榨。
6. 根据制造商的协议分离RNA。通过230、260和280nm的分光光度测定RNA的收率和纯度。RNA样本的260:230和260:280的比例分别为1.8和2.0，被认为是纯的。
   注: 协议可以在这里暂停。

4. 确定 GOI 的 mRNA 稳定性

1. 使用无RNA酶DNA酶I（扩增等级）处理1μg的总RNA，去除任何可能干扰后续DNA扩增的质粒DNA痕迹。
   1. 在0.2 mL PCR管中，结合1μg的总RNA、10x DNase I反应缓冲液1μL、1 μL的DNA酶I（1 U/μL）和无RNA酶水，以获得总体积10μL。
   2. 在RT孵化反应20分钟。
   3. 通过在10μL反应混合物中加入1μL的25 mM EDTA，在70°C下孵育反应10分钟，停用DNAse I。
2. 使用商业上可用的cDNA合成试剂盒将脱氧核糖核酸总RNA逆转录入cDNA，并混合了寡利（dT）和随机hexamer引物，以提高反向转录效率。
   1. 简单地说，将4 μL的5倍反应混合物、1 μL的逆转录酶和4μL的无RNA酶水添加到脱氧核糖核酸总RNA混合物的11μL中，以获得总反应量20μL。
   2. 在25°C下孵育反应5分钟，在46°C下孵育20分钟，然后在95°C下孵育反应1分钟，使反应失去活性。每个反应将产生50纳克/μL的cDNA产物。
   3. 通过在20μL反应混合物中加入180μL的分子生物学级水，将cDNA反应稀释到5纳克/μL的浓度。将 cDNA 产品储存在 -80°C，或立即执行实时定量 PCR （qPCR）。
      注: 协议可以在这里暂停。
3. 设计特定于 GOI 的正向和反向 qPCR 引漆。
   1. 由于GOI在细胞中的内源性表达，底漆必须设计为放大与GOI耦合的V5表位上的100-150bp放大（表1）。
   2. 内部参考基因引物也必须用作规范化对照。通常，内务基因，如β-actin和低氧磷酸酯转移酶1基因，被用作参考基因。然而，由于转染效率的变化，这些不能用于此感应系统。相反，tTA-Ad 笔录的表达式被评估为规范化的目的，因为它的表达在细胞中是构成的，因为巨细胞病毒促进剂的活动。qPCR 测量其表达的任何变化将代表转染效率（引物:前5'-GCC TGA CGA CAA GGA GGA AAC TC-3'和反向 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3;129 bp amplicon），并允许转染克隆的表达规范化（图3）。
4. 使用 SYBR 绿色染料母体混合在三联中制备每个 qPCR 反应。
   1. 使用分子生物学级水将5纳克/μL cDNA混合物稀释至1.25纳克/μL的浓度。
   2. 结合5μL SYBR绿色染料主混合物（2倍），0.1μL分子生物学级水，0.45 μL 7.5μM正向底漆，0.45 μL 7.5μM反向底漆，4 μL 1.25纳克/μL cDNA，通过移液在96孔PCR板中上下移液获得总反应量10μL。使用光学粘合膜确保板盖密封，并防止污染和蒸发。
   3. 通过离心短暂旋转反应混合物，并将板放入 qPCR 热循环器中。
5. 使用以下 qPCR 条件放大 V5 标记的 GOI 和 tTA-Ad 放大器:95 °C 为 10 分钟作为变性步骤，然后是 40 个循环 95°C，10 秒，58 °C 表示 15 s，72 °C 为 20 秒。执行放大周期后，必须生成高分辨率熔化曲线，以评估所需安培的特定熔融温度，并确保无噪声放大峰。
   1. 包括qRT-PCR的负对照，通过将RNA作为模板，将RNA作为模板，而不产生逆转录酶，作为潜在质粒DNA污染和qPCR的控制，而不向qPCR混合物中添加cDNA，以确保缺少底漆二分或污染物。
   2. 必须根据 GOI 的标准曲线测定优化最佳 cDNA 浓度、引底效率和浓度。为此，使用未经处理的细胞（培养不含多西环素）的cDNA进行连续稀释。标准曲线是通过根据 cDNA 稀释因子的日志绘制 Cq 值生成的，放大效率 （E） 使用以下公式根据标准曲线的斜率计算:
      E = 10^-1/斜率
      注: 放大效率应约为 0.9 到 1.05。否则，必须重新设计引素。
6. 使用比较Cq方法分析qPCR数据，将GOI的表达式值与tTA-Ad的表达式规范化，以获得GOI的相对表达水平，并将其表达式作为GOI在起始点（t = 0）的细胞中的mRNA表达式的百分比报告（图4）。
7. 使用以下方程从 GOI mRNA 降解曲线的速率常数 （K） 确定半衰程:
   t_1/2 = ln 2/K。

结果

该协议已成功用于生成Tet-off转录转录控制的质粒表达系统，以评估βENaC 3' UTR不同部分在主性外皮细胞的分录稳定性调制中的重要性。

该系统实施的第一步是建立一种快速、简单、高效的转染技术，用于初级培养中难以转染的食管上皮细胞。如图1所示，移液器电穿孔技术允许25-30%的转染效率，如荧光显?...

讨论

原培养中奥维拉尔上皮细胞转染率低，是使用Tet-Off系统评估这些细胞mRNA稳定性的严重限制。然而，这一限制通过移液器电穿孔而克服，允许25-30%的转染效率（图1和图3）26。

笔录稳定性的测量对于理解给定mRNA的调制及其对细胞平衡和代谢的影响至关重要。GOI生物利用度的变化可能会改变翻译效率，并直接影响细?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actinomycin D	Sigma-Aldrich	A9415
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A1593
Bright-LineHemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Chloroform - Molecular biology grade	Sigma-Aldrich	C2432
ClaI	New England Biolabs	R0197S
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast	Leica	-
DNase I, Amplification Grade	Invitrogen	18068015
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium	Wisent Bioproducts	311-425-CL
Ethanol - Molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818100
Excella E25 ConsoleIncubatorShaker	Eppendorf	1220G76
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
HEPES pH 7.3	Sigma-Aldrich	H3784
Heracell 240i	ThermoFisher Scientific	51026420
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad Laboratories	1708890
Isopropanol - Molecular biology grade	Sigma-Aldrich	I9516
LB Broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022
LB Broth with agar (Lennox)	Sigma-Aldrich	L2897
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10	Sigma-Aldrich	L9143
MEM, powder	Gibco	61100103
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate	Applied Biosystems	N8010560
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems	4360954
MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets	ThermoFisher Scientific	51025413
Mupid-exU electrophoresis system	Takara Bio	AD140
NanoDrop 2000c	ThermoFisher Scientific	ND-2000
Neon Transfection System 10 µL Kit	Invitrogen	MPK1025
Neon Transfection System Starter Pack	Invitrogen	MPK5000S
NheI	New England Biolabs	R0131S
One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli	Invitrogen	C854003
pcDNA3 vector	ThermoFisher Scientific	V790-20
pcDNA3-EGFP plasmid	Addgene	13031
PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity	Invitrogen	11304011
pTet-Off Advanced vector	Takara Bio	631070
pTRE-Tight vector	Takara Bio	631059
Purified alveolar epithelial cells	n.a.	n.a.
QIAEX II Gel Extraction Kit	QIAGEN	20021
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12162
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27104
QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software	Applied Biosystems	n.a.
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast	Applied Biosystems	4485697
Recombinant Rat TNF-alpha Protein	R&D Systems	510-RT-010
Septra	Sigma-Aldrich	A2487
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	New England Biolabs	M0371S
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories	1725270
SuperScript IV Reverse Transcriptase	Invitrogen	18090010
T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	EL0011
Tet System Approved FBS	Takara Bio	631367
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596018
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500
Water, Molecular biology Grade	Wisent Bioproducts	809-115-EL