JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, bir pipet elektroporasyon tekniğiile birleştiğinde indüklenebilir bir ifade sistemi kullanılarak primer alveoler epitel hücrelerinde bir transkript posttranskripsiyonel modülasyonu incelemek için kullanılabilecek bir araç salıyoruz.

Özet

Posttranskripsiyonel düzenlemenin incelenmesi, belirli bir haberci RNA'nın (mRNA) modülasyonunun ve hücre homeostazları ve metabolizması üzerindeki etkisini anlamak için temel dir. Gerçekten de, transkript ifadesindeki dalgalanmalar çeviri verimliliğini ve nihayetinde bir transkriptin hücresel aktivitesini değiştirebilir. Bu yöntemlerden bazılarıposttranskripsiyonel modülasyonun uygun şekilde incelenmesini engelleyen sınırlamalara sahip olsa da, mRNA'nın yarıömrünü araştırmak için çeşitli deneysel yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bir organizatör indüksiyon sistemi sentetik tetrasiklin-düzenlenmiş organizatörü kontrolü altında ilgi genifade edebilir. Bu yöntem, hücre homeostazını rahatsız etmeden herhangi bir deneysel koşul altında belirli bir mRNA'nın yarı-ömür tahminine olanak sağlar. Bu yöntemin en önemli dezavantajlarından biri, konvansiyonel transfeksiyon tekniklerine son derece dirençli izole birincil hücrelerde bu tekniğin kullanımını sınırlayan transfect hücrelerinin gerekliliğidir. Primer kültürdeki alveoler epitel hücreleri alveoler epitelin hücresel ve moleküler biyolojisini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Birincil alveoler hücrelerin benzersiz özellikleri ve fenotip bu hücrelerde ilgi genlerin posttranskripsiyonel modülasyonları çalışma için gerekli olun. Bu nedenle amacımız, primer kültürde alveoler epitel hücrelerine ilgi çeken mRNA'ların posttranskripsiyonel modülasyonlarını araştırmak için yeni bir araç geliştirmekti. Transkripsiyonel kontrollü plazmid ekspresyonu sistemini primer alveoler epitel hücrelerine yerleştirmek için hızlı ve etkili bir geçici transfeksiyon protokolü tasarladık. Bu klonlama stratejisi, yapı etiketlemek için viral bir epitop kullanarak, endojen mRNA'lar bu yapı ifade kolay ayrımcılık sağlar. Değiştirilmiş δδ sayısallaştırma döngüsü (Cq) yöntemi kullanılarak, transkriptin ifadesi yarı ömrünü ölçmek için farklı zaman aralıklarında ölçülebilir. Verilerimiz, primer alveoler epitel hücrelerinde çeşitli patofizyolojik koşullarda posttranskripsiyonel düzenlemenin incelenmesinde bu yeni yaklaşımın etkinliğini göstermektedir.

Giriş

mRNA'ların yarı ömrünü belirlemek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. MRNA etiketli pulse-chase bozunma tekniği, en az hücresel bozukluk ile mRNA'lar büyük bir havuzun eşzamanlı değerlendirilmesi için izin verir. Ancak, bu yaklaşım tek bir gen transkriptinin yarılanma ömrünün doğrudan tahmin edilmesine izin vermez ve büyüme faktörleri, ROS, alarminler veya inflamasyon1ile uyarılması nı takiben bir mRNA'nın posttransktranskripsiyonel modülasyonunu incelemek için uygulanamaz.

Aktinomisin D ve α-amanitin gibi transkripsiyon inhibitörlerinin kullanımı, zaman içinde mRNA bozunma kinetiğini ölçmek için nispeten basit bir yöntemdir. Önceki teknikler üzerinde bu yaklaşımın bir ana avantajı, (yani, nabız-kovalamaca) doğrudan belirli bir transkript yarı ömrü tahmin etmek ve farklı tedaviler in bozunma kinetik nasıl etkileyebileceğini karşılaştırmak yeteneğine dayanır. Ancak transkripsiyon inhibitörlerinin hücre fizyolojisi üzerindeki önemli zararlı etkisi2. Gerçekten de, bu ilaçlarla tüm hücre transkripsiyonu inhibisyonu, mikroRNA 'lar (miRNA'lar) gibi mRNA stabilitesinde rol oynayan anahtar elementlerin sentezini ve mRNA bozunması ve stabilitesi için önemli olan RNA bağlayıcı proteinlerin ekspresyonu ve sentezini perturbingin olumsuz yan etkisine sahiptir. Bu ilaçların gen transkripsiyonunun şiddetli pertürbasyonu bu nedenle artefactually transkript lerin bozulma eğrilerini değiştirebilir.

Organizatör indüksiyon sistemi belirli bir mRNA'nın yarı ömrünü ölçmek için üçüncü bir yaklaşımı temsil eder. Bu yöntem, transkripsiyon inhibitörlerini kullanan yöntemlere benzer şekilde belirli bir mRNA'nın bozulmasını ölçer. İki tip indüksiyon sistemi sıklıkla kullanılmaktadır: seruma bağlı c-fos promotörü3 ve Tet-Off indüklenebilir sistem4. C-fos sistemi ile hücre için toksik olabilecek transkripsiyon inhibitörlerinin kullanılmasına gerek yoktur. Ancak, bu yöntem hücre döngüsü senkronizasyonu gerektirir, hangiinterfaz5 sırasında bir transkript gerçek kararlılığının değerlendirilmesi engeller. Buna karşılık, Tet-Off sistemi sentetik tetrasiklin-düzenlenmiş organizatörü kontrolü altında ilgi geninin güçlü ifade sağlar (GOI). Bu sistem işlevsel olması için hücre içine cotransfected gereken iki elementin varlığını gerektirir. İlk plazmid (pTet-Off) düzenleyici protein tTA-Adv ifade, prokaryotik represör TetR oluşan bir hibrid sentetik transkripsiyon faktörü (Escherichia coli itibaren) viral protein HSV VP16 üç transkripsiyon transaktivasyon etki erimiş. GOI sentetik bir promotör kontrolü altında pTRE-Tight plazmid içine klonlanır (PSıkı),sitomegalovirüs minimal dizi oluşan (CMV) promotör tetO operatör dizisinin yedi tekrarları erimiş. PTight geninin transkripsiyonu TetR'in tetO ile etkileşimine bağlıdır. Tetrasiklin veya türevi, doksisiklin varlığında, TetR represörü tetO operatörü için yakınlık kaybeder, transkripsiyon bir kesilmesine yol açan4. Tet-Off sisteminin özellikleri ökaryotik hücrelerde spesifik mRNA ekspresyonunun incelenmesi için ideal bir model oluştururken, ökaryotik hücrede prokaryotik düzenleyici dizilerin yokluğuna sekonder olan potansiyel pleiotropik etkilerden kaçınılmalıdır6. Genellikle, iki kat kararlı Tet-Off hücre hatları (HEK 293, HeLa, ve PC12) kontrol edilebilir gen ekspresyonu7,8,9uygun erişim için regülatör ve yanıt plazmidlerin kopyalarını entegre etmek için bu sistem ile kullanılır .

Alveoler epitelin hücresel ve moleküler biyolojisini incelemek için kültürdeki alveoler epitel hücrelerinin çeşitli modelleri kullanılmıştır. Yıllardır, araştırmacılar yaygın insan veya kemirgenbirincil hücreleri10,11 yanı sıra insan A549 veya sıçan RLE-6TN hücreleri12,13gibi ölümsüzleştirilmiş hücre hatları kullandık. Genellikle daha az proliferatif ve kültür ve transfect daha zor olmasına rağmen, primer kültür alveoler epitel hücreleri fizyolojik ve patolojik koşullarda alveoler epitel fonksiyonu ve disfonksiyonu çalışma için altın standart olmaya devam etmektedir. Gerçekten de, A549 hücreleri gibi ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri birincil hücrelerin karmaşık özelliklerini ve fenotiplerini sergilemezken, birincil kültürdeki alveoler epitel hücreleri alveoler epitelin ana özelliklerini, özellikle de polarize ve sıkı bariyer oluşturma yeteneğini yeniden özetlez14,15. Ne yazık ki, bu hücreler çok zor Tet-Off gibi bir organizatör kaynaklı sistem kullanımı yapma, lipozomkullananlar gibi geleneksel transfeksiyon teknikleri, çok dayanıklıdır.

mRNA'ların posttranskripsiyonel modülasyonu, transkriptin gen ekspresyonunu hızla modüle etmek için en etkili yöntemlerden biridir16. MRNA 3' çevrilmemiş bölge (3' UTR) bu mekanizmada önemli bir rol oynar. 5' UTR'nin aksine, 3' UTR'nin uzunluğu ile bir organizmanın hücresel ve morfolojik karmaşıklıkları arasında üstel bir ilişki olduğu gösterilmiştir. Bu korelasyon, 3' UTR, mRNA kodlama bölgeleri gibi, evrim 17 boyunca giderek daha karmaşık posttranskripsiyonel modülasyon için izin doğal seçilim tabi olduğunu göstermektedir17. 3' UTR, transkriptin stabilitesini ve çevirisini etkileyen proteinler ve miRNA'lar için çeşitli bağlayıcı bölgeler içerir.

Bu çalışmada, transkript kararlılığının kontrolü için bir GOI 3 'UTR son derece korunmuş etki alanlarının rolünü araştırmak için bir araç geliştirdi. Alveoler epitel fizyolojisinde önemli bir rol oynayan epitel sodyum kanalı alfa alt ünitesi (αENaC) üzerinde yoğunlaştık18. Primer kültürdeki alveoler epitel hücreleri, diğer protokollerle transkripsiyon inhibitörlerinin kullanımına kıyasla hücre fizyolojisini ve metabolizmasını en az etkileyen bir sistemle 3' UTR'nin mRNA stabilitesinde rolünün incelenmesine olanak sağlayan Tet-Off sisteminin iki bileşeni ile başarılı bir şekilde transekse edildi. GoI ekspresyonunu endojen genin ekspresyonundan ayırt etmek için endojen bir epitop (V5) kullanarak bir klonlama stratejisi geliştirilmiştir. Yanıt ve düzenleyici plazmidler daha sonra pipet elektroporasyon tekniği kullanılarak alveoler epitel hücrelerine aktarıldı. Daha sonra, transkript infeksiytin ekspresyonu farklı zaman aralıklarında doksisiklin ile hücreleri kuluçka ile ölçüldü. Transkriptin yarılanma ömrü RT-qPCR tarafından normalizasyon için transfected tTA-Ad mRNA ürünü kullanılarak modifiye edilmiş bir Cq yöntemi ile değerlendirildi. Protokolümüz sayesinde, bir transkriptin transkripsiyonel modülasyonunu farklı koşullar altında incelemek ve çevrilmemiş bölgelerin katılımını daha ayrıntılı olarak tanımlamak için uygun bir yol sunuyoruz.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'nin yönergelerine göre yürütülmüş ve Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) Araştırma Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. İlgi genini ifade eden yanıt plazmidinin tasarımı ve üretimi (GOI)

  1. pTRE-Tight gibi indüklenebilir bir tetrasiklin-off vektörü kullanın.
  2. GOI'da dahili olarak bulunmayan MCS'deki kısıtlama sitelerini tanımlamak için GOI'nin ve vektörün birden fazla klonlama alanının (MCS) dizisini analiz edin.
  3. Daha önce açıklandığı gibi erkek Sprague-Dawley sıçan akciğerlerinden primer alveoler epitel hücreleri izole19,20.
  4. Fenol/kloroform ekstraksiyonu veya silika bazlı RNA spin kolonları kullanımı gibi standart bir yöntem kullanarak alveoler epitel hücrelerinden gelen toplam RNA'yı Standart bir yöntemle RNA ekstraksiyonu ile arındırın.
  5. Oligo(dT) ve yüksek sadakatli ters transkriptaz kullanarak mRNA'yı tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) ters yazınız.
  6. Yüksek sadakatli Taq polimeraz ve standart üst üste pcr tekniklerini kullanarak GOI'yi tasarlanmış astarlar kullanarak seçilen iki kısıtlama enzim tanıma alanı yla kuşatın.
    1. Ileri astar mRNA stabilitesine paralel olarak protein ekspresyonu çalışması için ifade düzeylerini artırmak için bir Kozak konsensus ribozom bağlama sitesi21 içerir. GOI'nin V5 epitopesini kodlayan bir dizi, transfected GOI'nin ekspresyonunu endojen ifadeden ayırt etmek için eklenmelidir (Tablo 1).
    2. Stop kodonundan sonra ters astarpoliadenilasyon sinyali içersin.
  7. Mutantlar, goi 3' UTR'nin 3' ucunu yavaş yavaş silen bir poliadenilasyon sitesini kodlayan ters astarlar kullanarak farklı 3' UTR bölgelerinin GOI'nin mRNA'sının stabilitesi üzerindeki etkilerini incelemek için sıralı silme ile oluşturulabilir (Şekil 6). Alternatif olarak, PCR yönelimli mutagenez 3 'UTR22ilgi belirli bir bölgeyi hedeflemek için kullanılabilir.
  8. Indüklenen vektörü ve kesici uç, daha önce seçilmiş restriksiyon enzimleri ile 1 saat boyunca uygun kuluçka sıcaklığında sindirin, ardından kendi kendine ligasyondan kaçınmak için 30 dk vektör reaksiyonu sırasında fosfataz ile tedavi edin.
  9. Sindirilmiş vektörü ve kesici uçları elektroforez ile %1-1,5 agarose jel (kesici uç büyüklüğüne bağlı olarak konsantrasyon) ayırın.
  10. Bir bıçak ve UV ışığı kullanarak, istenilen kesici uç ve vektör içeren DNA parçalarını toplayın.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
  11. Bir silika tabanlı PCR arıtma kiti kullanarak agarose jel toplanan segmentleri arındırın ve 260 nm spektrofotometri ile konsantrasyonu ölçmek.
  12. GI ve T4 DNA ligaz ile indüklanabilir vektör bir vektör kullanarak ligate:ligasyon olasılığını artırmak için 1:3 insert molar oranı. Reaksiyonu oda sıcaklığında (RT) 3 saat kuluçkaya yatırın.
  13. Ligasyon reaksiyonunu yetkin E. coli'ye (DH5α) dönüştürün.
    1. 100 μL'lik yetkin hücre içeren bir tüpe 1-10 ng vektör ve gen ekleyin. Hücreleri 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın ve 42 °C'de 45 s. Tüpü 2 dk buzüzerine yerleştirin ve 900 μL RT LB ortamı ekleyin. Hücreleri 37 °C'de 1 saat boyunca 225 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın.
    2. Dönüştürülmüş bakterileri seçmek için lb agar plakasına uygun bir antibiyotikle (örneğin, pTRE-Tight vektörü için 100 μg/mL ampillin) reaksiyonun 100 μL'sini yayın. Plakayı bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    3. Bir aşılama döngüsü veya 20 μL ucu kullanarak tek tek kolonileri seçin ve sallayarak 37 °C uygun antibiyotik içeren 5 mL LB orta gecede kuluçka. Dönüştürülmüş bakteriler gliserol stoklarında -80 °C'de 400:600 LB orta gliserol oranında saklanabilir.
  14. Plazmid DNA'sını silika bazlı plazmid kolonları kullanarak ayıklayın ve konsantrasyonu 260 nm'de spektrofotometri ile ölçün. GoI'nin restriksiyon analizi, oryantasyonu ve RT-PCR sırasında potansiyel olarak ortaya çıkan mutasyonların olmamasını sıralama ile onaylayın.

2. İlgi genini ifade eden yanıt plazmidinin (GOI) primer alveoler epitel hücrelerine aktarılması

  1. Sıçan akciğerlerinden tip II alveoler epitel hücrelerini izole edin.
  2. Hücreleri 100 mm Petri kaplarında 1 x 106 hücre/cm2 yoğunlukta, tam minimum gerekli ortam (komple MEM) ile tohumlayın. Komple MEM% 10 FBS, 0.08 mg / L tobramisin, Septra (3 μg / mL trimetoprim ve 17 μg / mL sulfamethoxazole), 0.2% NaHCO3,0.01 M HEPES (pH = 7.3) ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmektedir. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 24 saat eve kültürlendirin.
  3. Ertesi gün, yeni bir 12 kuyu plakaher kuyuya antibiyotik olmadan tam MEM 500 μL yerleştirin ve 30 dakika boyunca 37 °C'de plaka önceden ısıtın. Bu adımda, tetrasiklinleri kirletmeden veya inducibility müdahale etmek için çok düşük bir düzeyde fetal sığır serumu kullanmak önemlidir.
  4. Rt'de her kuyuda 1 μg GOI plazmid ve 1 μg düzenleyici vektör ekleyerek plazmid içeren 1,5 mL tüplerin indüklenebilir GOI (GOI plazmid) ve düzenleyici vektörü (örn. pTet-Off) hazırlayın. RNA bağlayıcı proteinler (RBP) ile birlikte ifade deneyleri için, 1 μg'lık kurucu vektör (örneğin, pcDNA3) RPB'yi ifade eden ve DNA karışımına eklenir (Şekil 7).
  5. Orta aspire ve yavaşça PBS ile hücreleri durulayın (kalsiyum ve magnezyum olmadan) 37 °C önceden ısıtılır.
  6. 37 °C'de önceden ısıtılmış %0,05 tripsin 5 mL ekleyin ve hücreler ayrılana kadar hücreleri kuluçkaya yatırın (2-4 dk). Antibiyotik olmadan tam MEM 10 mL ekleyerek tripsin nötralize.
  7. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpte toplayın, Petri kabını 4 mL orta ile yıkayın ve mümkün olduğunca çok sayıda hücre toplayın ve hücre süspansiyonuna 5 dk boyunca 300 x g'de santrifüj edin.
  8. Yavaşça aspire ve supernatant atın ve PBS 1 mL pelet resuspend. Hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın ve hesaplay.
  9. Hücreleri 300 x g'de 5 dk. Süpernatant'ı nazikçe aspire edin ve 4 x 107 hücre/mL konsantrasyonda resuspension tamponundaki peleti yeniden askıya alın. Adım 2.4'te hazırlanan 1,5 mL'lik tüpün hücrelerini kuyu başına 400.000 hücre konsantrasyonunda ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın.
  10. Tüpü elektroporasyon cihazına yerleştirin ve 3,5 mL elektrolitik tampon ile doldurun.
  11. Pistonun tamamına basarak bir pipete altın kaplama elektrot ucu yerleştirin. 1,5 mL'lik tüpün içeriğini hafifçe karıştırın ve pilleri pipetle dikkatlice aspire edin. Bu elektroporasyon sırasında elektrik arkneden ve azaltılmış transfeksiyon verimliliğiyol açacaktır gibi, ucu girmesini hava kabarcıkları önlemek için dikkatli olun.
  12. Bir tıklama sesi olana kadar pipeti elektroporasyon istasyonuna takın.
  13. 1.450 V ve 2 0 ms genişliğinde 2 darbe gerilimine karşılık gelen alveoler epitel hücreleri için uygun elektroporasyon protokolünü seçin ve dokunmatik ekranda Başlat tuşuna basın.
  14. Transfeksiyondan hemen sonra pipeti çıkarın ve hücreleri önceden 37 °C'ye önceden ısıtılmış antibiyotik olmadan tam MEM ile dolu bir kuyuya aktarın.
  15. Kalan örnekler için 2.11-2.14 adımlarını yineleyin.
  16. Hücreleri kuyu yüzeyine eşit olarak yaymak için plakayı hafifçe sallayın. Hücreleri 37 °C'de % 5 CO2'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. 2 gün sonra orta ortamı tam MEM ile antibiyotiklerle değiştirin.
  17. EGFP'nin ekspresyonunu floresan mikroskobu altında gözlemleyerek veya bir kontrol vektörü kullanarak akış sitometrisi ile transfeksiyonun başarısını doğrulayın(Şekil 1).
    NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve pcDNA3-EGFP gibi eGFP'yi ifade eden farklı bir plazmid kullanarak ek bir transfeksiyon adımı gerektirir.

3. GOI transkripsiyon inhibisyonunun indüksiyonu

NOT: Hücreler, mRNA stabilitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için doksisiklin indüksiyonundan önce istenilen tedavilerle ön tedavi edilebilir (Şekil 5).

  1. Deiyonize suda 1 mg/mL'lik doksisiklin stok çözeltisi hazırlayın. Stok çözeltisini ışıktan korunan -20 °C'de saklayın. Tetrasiklin türevi olan Doksisiklin, tetrasiklin yerine kullanılır, çünkü tetrasiklinden daha uzun bir yarı ömüre (2x) sahiptir. Ayrıca, doksisiklin daha düşük bir konsantrasyon tet operon23tam inaktivasyonu için gereklidir.
    NOT: Doksisiklin endojen GOI mRNA ekspresyonunu etkileyebilir. Bunu doğrulamak için, doksisiklin ile 24 saattedavinin alveoler hücreler üzerindeki etkisi GOI ekspresyonunda herhangi bir değişiklik olmadığını doğrulamak için test edilmelidir(Şekil 2).
  2. Tam MEM 72 h posttransfeksiyon da taze 1 μg/mL doksisiklin çözeltisi hazırlayın ve 37 °C'ye ısıtın.
  3. GOI'nin transkripsiyonuna inhibe etmek için orta yı kuyu başına 1 μg/mL doksisiklin içeren 1 mL tam MEM ile değiştirin.
  4. GOI'nin mRNA yarı ömrünü değerlendirmek için 15 dakika-6 saat arasında farklı süreler için 37 °C'de %5 CO2'de birden fazla kuyu kuluçkaya yatırın.
  5. Tedavinin sonunda, hücreleri buz gibi PBS ile yıkayın ve iyi başına 500 μL tampon ekleyerek ve hücreleri homojenize etmek için plakasal sallayarak ticari olarak kullanılabilir fenol-kloroform RNA ekstraksiyon kiti ile lyse.
  6. Üreticinin protokolüne göre RNA'yı izole edin. 230, 260 ve 280 nm spektrofotometri ile RNA verimini ve saflığını belirleyin. Sırasıyla 1,8 ve 2,0 oranları 260:230 ve 260:280 olan RNA örnekleri saf kabul edilir.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

4. GOI'nin mRNA stabilitesinin belirlenmesi

  1. Sonraki DNA amplifikasyonuna müdahale edebilecek plazmid DNA izlerini gidermek için toplam RNA'nın 1 μg'sini RNa içermeyen DNA I (amplifikasyon derecesi) ile tedavi edin.
    1. 0,2 mL'lik bir PCR tüpünde, toplam 1 000 RNA, 1 0x DNase I reaksiyon arabelleği, 1 μL DNaase I (1 U/μL) ve RNAe içermeyen suyu birleştirerek toplam 10 μL'lik bir hacim elde edin.
    2. 20 dakika RT'de reaksiyon uyguluyor.
    3. 10 μL reaksiyon karışımına 1 μL 25 mM EDTA ekleyerek ve reaksiyonu 70 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırarak DNAse I'yi etkisiz hale getirin.
  2. Ters transkripsiyon verimliliğini artırmak için oligo(dT) ve rasgele hexamer astarların karışımı ile ticari olarak kullanılabilen bir cDNA sentez kiti kullanarak DNA'ya tükenmiş toplam RNA'yı cDNA'ya ters yazınız.
    1. Kısaca, 20 μL toplam reaksiyon hacmi elde etmek için DNA tükenmiş toplam RNA karışımının 11 μL'sine 4 μL 5x reaksiyon karışımı, 1 μL ters transkriptaz ve 4 μL RNa içermeyen su ekleyin.
    2. 25 °C'de 5 dk, ardından 46 °C'de 20 dk reaksiyon uyguluyor ve 1 dk boyunca 95 °C'de kuluçkaya yatarak reaksiyonu inkübedin. Her reaksiyon 50 ng/μL cDNA ürünü verecektir.
    3. 20 μL reaksiyon karışımına 180 μL moleküler biyoloji sınıfı su ekleyerek cDNA reaksiyonunu 5 ng/μL konsantrasyonuna seyreltin. CDNA ürünlerini -80 °C'de saklayın veya hemen gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) yapmaya başlayın.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
  3. GOI'ye özgü ileri ve geri qPCR astarları tasarla.
    1. Hücrelerdeki GOI'nin endojen ekspresyonu nedeniyle astarlar, GOI ile birleşen V5 epitopunun 100-150 bp amplicon'unu güçlendirecek şekilde tasarlanmalıdır (Tablo 1).
    2. Dahili referans gen astarları da normalleştirme kontrolleri olarak kullanılmalıdır. Genellikle beta-aktin ve hipoksantin fosforibosiltransferaz 1 genleri gibi temizlik genleri referans genler olarak kullanılır. Ancak transfeksiyon veriminin değişimi nedeniyle bu indüksiyon sistemi ile bu sistem kullanılamaz. Bunun yerine, tTA-Reklam transkriptinin ifadesi normalleştirme amacıyla değerlendirilir, çünkü ifadesi sitomegalovirüs organizatörünün aktivitesi nedeniyle hücrelerde kurucudur. QPCR ile ölçülen ifadesinde herhangi bir varyasyon transfeksiyon verimliliği temsil edecek (astarlar: ileri 5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3' ve ters 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) ve transfected klonlar ifade normalleştirilmesi sağlayacaktır(Şekil 3).
  4. Bir SYBR Yeşil boya ana karışımı kullanarak triplicate her qPCR reaksiyon hazırlayın.
    1. Moleküler biyoloji sınıfı su kullanarak 5 ng/μL cDNA karışımını 1,25 ng/μL konsantrasyonuna seyreltin.
    2. 5 μL SYBR Yeşil boya ana karışımını (2x), 0,1 μL moleküler biyoloji sınıfı suyu, 0,45 μL 7,5 m ileri astar, 0,45 μL 7,5 m geri astar ve 4 μL 1,25 ng/μL cDNA birleştirerek 96 iyi bir plakada borulama yı karıştırın. Plaka kapağının kapalı olduğundan emin olmak ve kontaminasyon ve buharlaşmayı önlemek için optik yapışkan film kullanın.
    3. Reaksiyon karışımını kısa bir süre santrifüj le aşağı çevirin ve plakayı bir qPCR termocycler'a yerleştirin.
  5. V5 etiketli GOI ve tTA-Ad amplicon'ları aşağıdaki qPCR koşullarını kullanarak yükseltin: denatürasyon adımı olarak 10 dk için 95 °C, ardından 10 s için 95 °C 40 devir, 15 s için 58 °C ve 20 s için 72 °C. İstenilen amperatörlerin spesifik erime sıcaklıklarını değerlendirmek ve gürültü amplifikatör zirvelerinin yokluğunu sağlamak için amplifikasyon döngüleri yapıldıktan sonra yüksek çözünürlüklü bir erime eğrisi oluşturulmalıdır.
    1. Ters transkriptaz olmadan bir şablon olarak RNA ile qPCR gerçekleştirerek qRT-PCR için negatif kontroller ekleyin potansiyel plazmid DNA kontaminasyonu ve qPCR için bir kontrol olarak hizmet vermek için qPCR dahil hiçbir cDNA ile qPCR karışımı astar dimers veya eksikliği sağlamak için Kirletici.
    2. Optimal cDNA konsantrasyonu, astar verimliliği ve konsantrasyon, GOI'ye göre standart bir eğri testi ile optimize edilmelidir. Bunu yapmak için, tedavi edilmeyen hücrelerden cDNA kullanarak bir seri seyreltme gerçekleştirmek (doksisiklin olmadan kültürlü). Standart eğri cDNA seyreltme faktörünün kütüğüne göre Cq değerlerinin çizilmesiyle oluşturulur ve amplifikasyon verimliliği (E) aşağıdaki formül kullanılarak standart eğrinin eğimine göre hesaplanır:
      E = 10-1/eğim
      NOT: Amplifikasyon verimi yaklaşık 0,9 ila 1,05 olmalıdır. Aksi takdirde, astarlar yeniden tasarlanmalıdır.
  6. GoI'nin göreli ifade düzeylerini elde etmek ve goi'nin aynı hayvanın hücrelerindeki mRNA ifadesinin bir yüzdesi olarak ifadesini başlangıç noktasında (t = 0)(Şekil 4)olarak bildirmek için GOI'nin ifade değerlerini tTA-Ad ifadesine normalleştirerek karşılaştırmalı Cq yöntemini kullanarak qPCR verilerini analiz edin.
  7. Yarılanma ömrü, GOI mRNA bozunma eğrisinin oran sabitinden (K) aşağıdaki denklem kullanılarak belirlenir:
    t1/2 = ln 2/K.

Sonuçlar

Bu protokol, primer alveoler epitel hücrelerinde transkript stabilitesinin modülasyonunda αENaC 3' UTR'nin farklı bölümlerinin önemini değerlendirmek için transkripsiyonel kontrollü plazmid ekspresyonu sistemi oluşturmak için başarıyla kullanılmıştır.

Bu sistemin uygulanmasında ilk adım, transfect zor birincil kültürde alveoler epitel hücreleri için hızlı, kolay ve verimli transfeksiyon tekniği kurmak ...

Tartışmalar

Birincil kültürde alveoler epitel hücrelerinin düşük transfeksiyon oranı bu hücrelerde mRNA kararlılığını değerlendirmek için Tet-Off sisteminin kullanımı için ciddi bir sınırlama olmuştur. Ancak bu sınırlama pipet elektroporasyonu ile aşılarak %25-30 transfeksiyon verimi(Şekil 1 ve Şekil 3)26'yaizin verebilmiştir.

Transkript stabilitesinin ölçülmesi, belirli bir mRNA'nın modüla...

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Teşekkürler

Francis Migneault Quebec Solunum Sağlığı Ağı ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) akciğer eğitim programı, FRSQ'dan bir öğrencilik ve Faculté des Études Supérieures et'den bir öğrencilik tarafından sağlanan bir burs tarafından desteklendi. Doktora sonrası, Université de Montréal. Bu çalışma Gosselin-Lamarre Klinik Araştırma Başkanı ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri [YBMOP-79544] tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Actinomycin DSigma-AldrichA9415
AmpicillinSigma-AldrichA1593
Bright-LineHemacytometerSigma-AldrichZ359629
Chloroform - Molecular biology gradeSigma-AldrichC2432
ClaINew England BiolabsR0197S
CycloheximideSigma-AldrichC7698
DM IL LED Inverted Microscope with Phase ContrastLeica-
DNase I, Amplification GradeInvitrogen18068015
Doxycycline hyclateSigma-AldrichD9891-1G
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesiumWisent Bioproducts311-425-CL
Ethanol - Molecular biology gradeFisher ScientificBP2818100
Excella E25 ConsoleIncubatorShakerEppendorf1220G76
GlycerolSigma-AldrichG5516
HEPES pH 7.3Sigma-AldrichH3784
Heracell 240iThermoFisher Scientific51026420
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad Laboratories1708890
Isopropanol - Molecular biology gradeSigma-AldrichI9516
LB Broth (Lennox)Sigma-AldrichL3022
LB Broth with agar (Lennox)Sigma-AldrichL2897
L-glutamineSigma-AldrichG7513
Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10Sigma-AldrichL9143
MEM, powderGibco61100103
MicroAmp Optical 96-Well Reaction PlateApplied BiosystemsN8010560
MicroAmp Optical Adhesive FilmApplied Biosystems4360954
MSC-Advantage Class II Biological Safety CabinetsThermoFisher Scientific51025413
Mupid-exU electrophoresis systemTakara BioAD140
NanoDrop 2000cThermoFisher ScientificND-2000
Neon Transfection System 10 µL KitInvitrogenMPK1025
Neon Transfection System Starter PackInvitrogenMPK5000S
NheINew England BiolabsR0131S
One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coliInvitrogenC854003
pcDNA3 vectorThermoFisher ScientificV790-20
pcDNA3-EGFP plasmidAddgene13031
PlatinumTaqDNA Polymerase High FidelityInvitrogen11304011
pTet-Off Advanced vectorTakara Bio631070
pTRE-Tight vectorTakara Bio631059
Purified alveolar epithelial cellsn.a.n.a.
QIAEX II Gel Extraction KitQIAGEN20021
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12162
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27104
QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System SoftwareApplied Biosystemsn.a.
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well FastApplied Biosystems4485697
Recombinant Rat TNF-alpha ProteinR&D Systems510-RT-010
SeptraSigma-AldrichA2487
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)New England BiolabsM0371S
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725270
SuperScript IV Reverse TranscriptaseInvitrogen18090010
T4 DNA LigaseThermoFisher ScientificEL0011
Tet System Approved FBSTakara Bio631367
TobramycinSigma-AldrichT4014
TRIzol ReagentInvitrogen15596018
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300054
UltraPure AgaroseInvitrogen16500500
Water, Molecular biology GradeWisent Bioproducts809-115-EL

Referanslar

  1. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
  2. Ljungman, M. The transcription stress response. Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).
  3. Ross, J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).
  4. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
  5. Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
  6. Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
  7. Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
  8. Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).
  9. Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
  10. Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
  11. Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).
  12. Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
  13. Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
  14. Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).
  15. Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
  16. Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. Regulatory functions of 3'UTRs. Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).
  17. Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
  18. Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
  19. Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
  20. Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
  21. Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
  22. Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
  23. Gossen, M., Bujard, H., Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. . Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. , (2001).
  24. Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
  25. Migneault, F. . Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites. , (2015).
  26. Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
  27. Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
  28. Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).
  29. Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
  30. Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
  31. Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

GenetikSay 157ge ici transfeksiyonprimer k lt ralveoler epitel h crelerimRNA stabilitesi3 UTRdoksisiklinTet Offind kleyici ekspresyonu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır