1 차적인 폐포 상피 세포에 있는 mRNA 전사체의 안정성의 조사를 위한 능률적으로 통제된 플라스미드 발현 시스템

요약

여기서, 우리는 파이펫 전기화 기술에 결합된 유도성 발현 시스템을 이용하여 1차 폐포 상피 세포에서 전사체의 전사체의 후전사 변조를 연구하는데 사용될 수 있는 도구를 제시한다.

초록

사후 전사 조절을 연구하는 것은 주어진 메신저 RNA (mRNA)의 변조와 세포 항상성 및 대사에 미치는 영향을 이해하는 데 기본적입니다. 실제로, 전사체 발현의 변동은 번역 효율성과 궁극적으로 전사체의 세포 활성을 수정할 수 있다. 몇몇 실험적인 접근은 이 방법의 몇몇이 사후 전사 변조의 적당한 연구 결과 방지하는 한계가 있더라도 mRNA의 반감기를 조사하기 위하여 개발되었습니다. 프로모터 유도 시스템은 합성 테트라사이클린 조절 프로모터의 제어 하에 관심 있는 유전자를 발현할 수 있다. 이 방법은 세포 항상성을 방해하지 않고 임의의 실험 조건 하에서 주어진 mRNA의 반감기 추정을 허용한다. 이 방법의 한 가지 주요 단점은 기존의 형질 감염 기술에 매우 저항력이있는 고립 된 1 차 세포에서이 기술의 사용을 제한하는 트랜스 펙트 세포의 필요성입니다. 1 차적인 문화에서 폐포 상피 세포는 폐포 상피의 세포 및 분자 생물학을 공부하기 위하여 광범위하게 이용되었습니다. 1 차적인 폐포 세포의 유일한 특성 그리고 표현형은 이 세포에 있는 관심 있는 유전자의 사후 전사 변조를 공부하는 것이 필수적입니다. 따라서, 우리의 목표는 1 차적인 배양에 있는 폐포 상피 세포에 있는 관심있는 mRNAs의 사후 전사 변조를 조사하기 위하여 새로운 공구를 개발하는 것이었습니다. 우리는 1 차적인 폐포 상피 세포로 전사로 통제된 plasmid 발현 시스템을 삽입하기 위하여 빠르고 능률적인 과도 형질 감염 프로토콜을 디자인했습니다. 이 복제 전략은 바이러스 성 에피토프를 사용하여 구문에 태그를 붙이면 내인성 mRNAs의 구성발식을 쉽게 차별할 수 있습니다. 수정된 ΔΔ 정량화 주기(Cq) 방법을 사용하여, 전사체의 발현은 그 반감기를 측정하기 위해 상이한 시간 간격으로 정량화될 수 있다. 우리의 데이터는 1 차적인 폐포 상피 세포에 있는 각종 병리생리학 조건에 있는 사후 전사 적 조절을 공부에 있는 이 새로운 접근의 효율성을 보여줍니다.

서문

mRNA의 반감기를 결정하기 위하여 몇몇 기술이 개발되었습니다. 표지된 mRNAs를 이용하는 펄스 추적 붕괴 기술은, 최소한의 세포 소요를 가진 mRNAs의 큰 풀의 동시 평가를 허용합니다. 그러나, 이러한 접근법은 단일 유전자 전사체의 반감기에 대한 직접적인 추정을 허용하지 않으며 성장 인자, ROS, alarmins, 또는 염증^1을가진 자극에 따른 mRNA의 사후 전사 변조를 연구하기 위해 구현될 수 없다.

actinomycin D 및 α-amanitin과 같은 전사 억제제의 사용은 시간이 지남에 따라 mRNA 분해 역학을 측정하는 비교적 간단한 방법입니다. 이전 기술에 비해이 방법의 한 가지 주요 장점, (즉, 펄스 추적) 직접 주어진된 성적 증명서의 반감기를 추정 하 고 다른 치료 그것의 저하 역학에 영향을 미칠 수 있는 방법을 비교 하는 능력에 의존. 그러나, 세포 생리학에 대한 전사 억제제의 유의한 해로운 영향은 접근법^2의주요 단점을 나타낸다. 실제로, 이들 약물을 사용하는 전체 세포 전사체의 억제는 마이크로RNA(miRNA)와 같은 mRNA 안정성에 관여하는 주요 원소의 합성을 교란시키는 부정적인 부작용뿐만 아니라 MRNA 결합 단백질의 발현 및 합성뿐만 아니라 mRNA 분해 및 안정성에 중요한 영향을 미친다. 이 약에 의하여 유전자 전사의 가혹한 교란은 그러므로 실제로 전사체의 분해 곡선을 수정할 수 있었습니다.

프로모터 유도 시스템은 특정 mRNA의 반감기를 측정하는 제3 접근법을 나타낸다. 이 방법은 전사 억제제와 유사한 방식으로 특정 mRNA의 분해를 측정합니다. 유도 시스템의 2가지 유형이 자주 사용된다: 혈청 유도 c-fos 프로모터³ 및 Tet-Off 유도시스템^4. c-fos 시스템으로, 세포에 유독할 수 있는 전사 억제제의 사용은 필요하지 않습니다. 그러나, 이 방법은 세포 주기 동기화가 필요하며, 이는 상 간⁵동안 전사체의 실제 안정성의 평가를 방지한다. 대조적으로, Tet-Off 시스템은 합성 테트라사이클린 조절 프로모터의 제어 하에 관심 유전자(GOI)의 강력한 발현을 허용한다. 이 시스템은 작동하기 위하여 세포로 cotransfected되어야 하는 2개의 요소의 존재를 요구합니다. 제1 플라스미드(pTet-Off)는 바이러스 성 단백질 HSV VP16로부터 3개의 전사 트랜스활성화 도메인으로 융합된 원핵핵억제제 TetR(대장균으로부터)으로 구성된 혼종 합성 전사 인자인 tTA-Adv를 발현한다. 상기 GOI는 테토오 연산자 서열의 7회 반복으로 융합된 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 최소 서열을 포함하는 합성 프로모터(P_Tight)의제어 하에 pTRE-Tight 플라스미드내로 복제된다. P_타이트의 유전자 하류의 전사는 tetO와 의 TetR의 상호작용에 의존한다. 테트라 사이클린 또는 그 유도체, 독시 사이클린이있는 경우, TetR 억압자는 tetO 연산자에 대한 친화력을 잃어 전사^4의중단으로 이어진다. Tet-Off 시스템의 특성은 진핵 세포에서 의 핵경상 조절 서열의 부재에 이차적인 잠재적 인 pleiotropic 효과를 피하면서 진핵 세포에서 특정 mRNA 발현의 연구에 이상적인^모델6. 일반적으로, 이중으로 안정적인 Tet-Off 세포주(HEK 293, HeLa 및 PC12)는 조절가능한 유전자^발현에편리하게 접근할 수 있도록 조절기 및 반응 플라스미드의 사본을 통합하기 위해 이 시스템과 함께 사용된다^7,8,9.

배양에서 폐포 상피 세포의 몇몇 모형은 폐포 상피의 세포 그리고 분자 생물학을 공부하기 위하여 이용되었습니다. 수년 동안, 연구자들은 인간 또는 설치류^{1차 세포10,11뿐만} 아니라 인간 A549 또는 쥐 RLE-6TN^{세포(12,13)와}같은 불멸의 세포주를 광범위하게 활용하였다. 그들은 일반적으로 덜 증식 하 고 배양 하 고 transfect, 1 차 배양에서 폐포 상피 세포 기능 및 생리 및 병 리 조건에서 폐 포 상피의 기능 및 기능 장애의 연구에 대 한 골드 표준 남아. 실제로, A549 세포와 같은 불멸화된 세포주는 1차 세포의 복합적인 특성 및 표현형을 나타내지 않는 반면, 1차 배양에서 폐포 상피 세포는 폐포 상피의 주요 특성을 재구성하는 반면, 특히 편광 및 단단한^{장벽(14,15)을}형성하는 능력이 있다. 불행히도, 이들 세포는 리포솜을 활용하는 것과 같은 종래의 형질감염 기술에 매우 내성이 있어 Tet-Off와 같은 프로모터 유도 시스템의 사용이 매우 어렵다.

mRNAs의 후전사 변조는^{전사체(16)의}유전자 발현을 빠르게 조절하는 가장 효과적인 방법 중 하나이다. mRNA 3' 번역되지 않은 영역 (3' UTR)은 이 기계장치에 있는 중요한 역할을 합니다. 5' UTR과 달리 3' UTR의 길이와 유기체의 세포 및 형태학적 복잡성 사이에 기하급수적인 상관 관계가 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 상관관계는 mRNA 코딩 영역과 같은 3' UTR이 진화^17전반에걸쳐 점점 더 복잡한 후전사 변조를 허용하도록 자연선택을 거쳤음을 시사한다. 3' UTR은 전사체의 안정성 및 번역에 영향을 미치는 단백질 및 miRNAs에 대한 여러 결합 부위를 포함합니다.

본 작품에서는 전사체 안정성을 제어하기 위한 GOI의 3' UTR에서 고도로 보존된 도메인의 역할을 조사하는 도구를 개발했습니다. 우리는 폐포 상피 생리학에 중요한 역할을 하는 상피 나트륨 채널, 알파 소단위(αENaC)에 초점을 맞췄습니다^18. 1 차 적인 배양에서 폐포 상피 세포는 성공적으로 다른 프로토콜과 전사 억제제의 사용에 비해 세포 생리학 및 신진 대사에 최소한의 영향을 미치는 시스템으로 mRNA 안정성에서 3'UTR의 역할의 연구를 허용하는 Tet-Off 시스템의 두 가지 구성 요소로 과도하게 형질 감염되었다. 비내인성 발현 에피토프(V5)를 사용하여 내인성 유전자의 발현과 GOI의 발현을 분화하기 위한 복제 전략이 개발되었다. 반응 및 조절 플라스미드는 피펫 전기화 기술을 사용하여 폐포 상피 세포로 옮겨졌다. 이어서, 전사체의 발현은 상이한 시간 간격으로 독시사이클린으로 세포를 배양시킴으로써 측정하였다. 전사체의 반감기는 정규화를 위해 형질감염된 tTA-Ad mRNA 생성자를 사용하여 변형된 Cq 방법을 사용하여 RT-qPCR에 의해 평가되었다. 우리의 프로토콜을 통해, 우리는 다른 조건에서 성적 증명서의 사후 변조를 공부하고 더 자세히 번역되지 않은 영역의 참여를 정의하기위한 편리한 방법을 제공합니다.

프로토콜

모든 동물 절차는 동물 관리에 대한 캐나다 위원회의 지침에 따라 수행되었으며 센터 병원 디 l'Université 드 몬트리올 (CRCHUM)의 연구 센터의 기관 동물 관리위원회의 승인을 받았습니다.

1. 관심 있는 유전자를 발현하는 반응 플라스미드의 설계 및 생성(GOI)

1. pTRE-Tight와 같은 유도가능한 테트라사이클린 오프 벡터를 사용합니다.
2. 벡터의 GOI 및 다중 복제 부위(MCS)의 서열을 분석하여 GOI내부에 존재하지 않는 MCS내의 제한 부위를 식별한다.
3. 앞서^19,20에기재된 바와 같이 수컷 스프라그-다울리 쥐 폐로부터 1차 폐포 상피 세포를 분리한다.
4. 페놀/클로로폼 추출 또는 실리카 계 RNA 스핀 컬럼의 사용과 같은 표준 방법을 사용하여 RNA 추출에 의해 폐포 상피 세포로부터의 총 RNA를 정제한다.
5. 리고고(dT) 및 고충실도 역전사를 사용하여 mRNA를 상보적 DNA(cDNA)로 역전시.
6. 고충실도 Taq 폴리머라제와 표준 중첩 PCR 기술을 사용하여 설계된 프라이머를 사용하여 선택된 두 개의 제한 효소 인식 사이트로 GOI측면을 활용합니다.
   1. 상기 전진 프라이머는 mRNA 안정성과 병행하여 단백질 발현을 연구하기 위해 발현 수준을 개선하기 위해 코작 컨센서스 리보솜 결합^{부위(21)를} 함유한다. GOI의 V5 에피토프 상류를 코딩하는 서열은 형질감염된 GOI의 발현을 내인성 발현으로부터 구별하기 위해 포함되어야한다(표 1).
   2. 역방향 프라이머에 정지 코돈 후 폴리아데닐화 신호를 포함시키는다.
7. 돌연변이체는 GOI 3' UTR의 3' 말단을 서서히 삭제하는 폴리아데닐레이션 부위를 인코딩하는 역프라이머를 사용하여 GOI의 mRNA의 안정성에 상이한 3' UTR 영역의 효과를 연구하기 위해 순차적 결실에 의해 생성될 수있다(도 6). 대안적으로, PCR 지시 돌연변이 발생은 3' UTR^22에서관심 있는 특정 영역을 표적으로 하는데 사용될 수 있다.
8. 유도성 벡터및 삽입을 1시간 동안 적절한 인큐베이션 온도에서 이전에 선택된 제한 효소로 소화하고, 자기 결찰을 피하기 위해 벡터 반응 동안 인산파아제를 30분 동안 처리하였다.
9. 1-1.5% 아가로즈 겔(삽입의 크기에 따라 농도)에서 전기 영동에 의해 소화된 벡터 및 삽입 세그먼트를 분리한다.
10. 블레이드 및 UV 광을 사용하여, 결찰될 원하는 삽입 및 벡터를 포함하는 DNA 단편을 수집한다.
    참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
11. 실리카 계 PCR 정제 키트를 사용하여 아가로즈 겔로부터 수집된 분들을 정화하고 260 nm에서 분광광도법에 의한 농도를 측정하였다.
12. 골치울 확률을 높이기 위해 1:3의 벡터:삽입 몰 비를 사용하여 T4 DNA 리가아제와 GOI 및 유도성 벡터를 리게이트. 3 시간 동안 실온 (RT)에서 반응을 배양하십시오.
13. 결찰 반응을 유능한 대장균(DH5α)으로 변환합니다.
    1. 유능한 세포의 100 μL을 포함하는 관에 벡터와 유전자의 1-10 ng를 추가합니다. 세포를 얼음 위에 30분 동안 배양한 다음 42°C에서 45초동안 열 충격 세포를 2분 동안 얼음 위에 놓고 RT LB 배지 900 μL을 추가합니다. 37°C에서 1시간 동안 세포를 배양하고 225 rpm에서 흔들어.
    2. LB 한천 플레이트에 반응의 100 μL을 적당한 항생제(예를 들어, pTRE-Tight 벡터에 대한 100 μg/mL 암피실린)를 확산시켜 형질전환된 박테리아를 선택한다. 37 °C에서 밤새 플레이트를 배양합니다.
    3. 접종 루프 또는 20 μL 팁을 사용하여 개별 콜로니를 선택하고 37°C에서 적절한 항생제를 함유하는 5 mL LB 배지에서 밤새 배양하여 흔들어 보라고 한다. 형질전환된 박테리아는 -80°C에서 LB 배지의 400:600의 비율로 글리세롤 스톡에 저장될 수 있다.
14. 실리카 계 플라스미드 컬럼을 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하고 260 nm에서 분광광도에 의한 농도를 측정합니다. 제한 분석 및 그 방향과 시퀀싱을 통해 RT-PCR 동안 잠재적으로 도입된 돌연변이의 부재를 통해 GOI의 삽입을 확인합니다.

2. 관심 유전자를 1 차 폐포 상피 세포로 발현하는 반응 플라스미드의 형질전환

1. 쥐 폐에서 타입 II 폐포 상피 세포를 분리합니다.
2. 1x10⁶ 세포/cm2의 밀도로 세포를 100 mm 페트리 접시에 완전한 최소 필수 배지(완전한 MEM)로 시드합니다. 완전한 MEM은 10% FBS, 0.08 mg/L 토브라마이신, 셉트라(3 μg/mL 트리메토프림 및 17 μg/mL 설파메톡사졸), 0.2% NaHCO_3,0.01 M HEPES(pH= 7.3), 및 2 mM L-글루타민으로 보충된다. 가습된 인큐베이터에서 5%_CO2에서 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양하였다.
3. 다음날, 새로운 12웰 플레이트의 각 웰에 항생제 없이 완전한 MEM의 500 μL을 놓고 37°C에서 30분 동안 플레이트를 미리 데우는다. 이 단계에서는 테트라사이클린을 오염시가지 않거나 유도성을 방해하기에는 너무 낮은 수준으로 태아 소 혈청을 사용하는 것이 중요합니다.
4. 유도성 GOI(GOI 플라스미드) 및 조절 벡터(예를 들어, pTet-Off)를 함유하는 플라스미드를 함유하는 1.5 mL 튜브를 RT에서 잘 당 1 μg의 GOI 플라스미드 및 1 μg의 조절 벡터를 첨가하여 준비한다. RNA 결합 단백질(RBP)을 통한 공동 발현 실험의 경우, 관심 있는 RPB를 발현하는 구성 벡터(예를 들어, pcDNA3)의 1 μg가 DNA 혼합에 첨가된다(도7).
5. 배지를 흡인하고 37°C에서 미리 데운 PBS(칼슘과 마그네슘 제외)로 세포를 부드럽게 헹구십시오.
6. 37°C에서 미리 온데 넣은 0.05% 트립신 5 mL를 추가하고 세포가 분리될 때까지 세포를 배양합니다(2-4 분). 항생제 없이 완전 한 MEM의 10 mL를 추가 하 여 트립신을 중화.
7. 50 mL 튜브에서 세포 현탁액을 수집하고, 가능한 한 많은 나머지 세포를 수집하기 위해 매체의 4 mL로 페트리 접시를 세척 한 다음 5 분 동안 300 x g에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다.
8. 상급자를 부드럽게 흡인하고 폐기하고 1 mL의 PBS에서 펠릿을 다시 놓습니다. 혈세포계를 사용하여 셀 수를 계산하고 계산합니다.
9. 세포를 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상급자를 부드럽게 흡인하고 4 x 10⁷ 세포 / mL의 농도로 재서스펜션 버퍼에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 2.4단계에서 제조된 1.5 mL 튜브에서 세포를 잘 당 400,000개의 농도로 첨가하고 위아래로 파이펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
10. 튜브를 전기 화기 장치에 놓고 3.5 mL의 전해 버퍼로 채웁니다.
11. 피스톤을 완전히 눌러 파이펫에 금도금 전극 팁을 삽입합니다. 1.5 mL 튜브의 내용물부분을 부드럽게 혼합하고 피펫으로 세포를 조심스럽게 흡인합니다. 기포가 팁에 유입되는 것을 방지하려면 전기 다공성 중에 전기 아크가 발생하고 형질 전환 효율이 저하될 수 있으므로 주의해야 합니다.
12. 딸깍 소리가 나야 할 때까지 전기 개루 스테이션에 파이펫을 삽입합니다.
13. 1,450V 및 2펄스의 펄스 전압에 대응하는 폐포 상피 전지에 적합한 전기 천공 프로토콜을 선택하고 터치 스크린에서 시작을 누릅니다.
14. 형질감염 직후, 피펫을 제거하고 37°C로 미리 온난화된 항생제 없이 이전에 완전한 MEM으로 채워진 우물로 세포를 옮니다.
15. 나머지 샘플에 대해 2.11-2.14 단계를 반복합니다.
16. 접시를 부드럽게 흔들어 세포를 잘 표면에 고르게 펴줍니다. 가습 된 인큐베이터에서 5 %_CO2에서 37 °C에서 세포를 배양합니다. 2 일 후 배지를 완전한 MEM으로 항생제로 교체하십시오.
17. 형광 현미경 하에서 또는 대조군 벡터를 이용하여 유세포측정법에 의한 eGFP의 발현을 관찰함으로써 형질전환의 성공을 확인한다(도1).
    참고: 이 단계는 선택사항이며 pcDNA3-EGFP와 같은 eGFP를 발현하는 다른 플라스미드를 사용하는 추가적인 형질감염 단계가 필요하다.

3. GOI의 전사 억제의 유도

참고: 세포는 mRNA 안정성에 미치는 영향을 평가하기 위해 독시 사이클린 유도 전에 원하는 치료법으로 전처리될 수있다(그림 5).

1. 탈이온수에서 1 mg/mL의 독시 사이클린 스톡 솔루션을 준비합니다. 스톡 용액을 빛으로부터 보호된 -20°C에 보관하십시오. 테트라사이클린 유도체인 독시사이클린은 테트라사이클린보다 반감기(2배)가 더 길기 때문에 테트라사이클린 대신에 사용됩니다. 더욱이, 테트 ^{오페론(23)의}완전한 불활성화를 위해서는 더 낮은 농도의 독시사이클린이 요구된다.
   참고: 독시사이클린은 내인성 GOI의 mRNA 발현에 영향을 미칠 수 있다. 이를 확인하기 위해 폐포 세포에 대한 독시 사이클린을 함유한 24시간 치료의 효과를 GOI 발현의 변화가 없는지 확인하기 위해 시험해 보아야한다(그림 2).
2. 완전한 MEM 72 시간 후 변환에 신선한 1 μg / mL 독시 사이클린 용액을 준비하고 37 ° C로 따뜻하게.
3. 배지를 GOI의 전사를 억제하기 위해 잘 당 1 μg/mL 독시사이클린을 함유하는 완전한 MEM의 1 mL로 대체한다.
4. GOI의 mRNA 반감기를 평가하기 위해 15 분-6 시간에서 시간의 상이한 양에 대해 5%_CO2에서 37°C에서 다중 웰을 배양한다.
5. 처리가 끝나면, 얼음 차가운 PBS로 세포를 세척하고 잘 당 500 μL의 버퍼를 추가하고 세포를 균질화하기 위해 플레이트를 흔들어 시판 되는 페놀 클로로포름 RNA 추출 키트로 세포를 용해시한다.
6. 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA를 분리합니다. 230, 260 및 280 nm에서 분광광도법에 의해 RNA 수율 및 순도를 결정합니다. 각각 1.8과 2.0의 260:230 및 260:280 비율을 가진 RNA 견본은 순수한 것으로 간주됩니다.
   참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.

4. GOI의 mRNA 안정성 결정

1. RNAE가 없는 DNAse I(증폭 등급)으로 총 RNA 1 μg를 치료하여 후속 DNA 증폭을 방해할 수 있는 플라스미드 DNA의 흔적을 제거합니다.
   1. 0.2 mL PCR 튜브에서 총 RNA 1 μg, 10x DNase I 반응 완충제 1 μL, DNaase I (1 U/μL) 및 RNAE없는 물을 결합하여 총 부피를 10 μL로 얻습니다.
   2. RT에서 20 분 동안 반응을 배양하십시오.
   3. DNAse I를 10 μL 반응 믹스에 25 mM EDTA의 1 μL을 첨가하고 10 분 동안 70 °C에서 반응을 배양시킴으로써 DNAse I를 비활성화합니다.
2. DNA 고갈된 총 RNA를 시판되는 cDNA 합성 키트를 사용하여 올리고(dT) 및 랜덤 hexamer 프라이머를 혼합하여 cDNA로 역-전사하여 역전사 효율을 향상시킨다.
   1. 간단히, 5x 반응 믹스의 4 μL, 역염산염의 1 μL, 및 DNA 고갈 된 총 RNA 혼합물의 11 μL에 RNAE없는 물의 4 μL을 추가하여 20 μL의 총 반응 량을 얻을 수 있습니다.
   2. 25°C에서 5분 동안 반응을 배양한 다음 46°C에서 20분 후, 95°C에서 1분 동안 배양하여 반응을 비활성화하였다. 각 반응은 cDNA 생성물의 50 ng/μL를 산출할 것이다.
   3. 20 μL 반응 믹스에 분자 생물학 등급의 물 180 μL을 추가하여 5 ng/μL의 농도로 cDNA 반응을 희석시다. cDNA 제품을 -80°C에 저장하거나 즉시 실시간 정량적 PCR(qPCR)을 수행합니다.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
3. GOI에 특화된 qPCR 프라이머를 전진 및 후진 설계합니다.
   1. 세포에서 GOI의 내인성 발현으로 인해, 프라이머는 GOI에 결합된 V5 에피토프의 100-150 bp 앰플리온을 증폭하도록 설계되어야한다(표 1).
   2. 내부 기준 유전자 프라이머는 또한 정규화 제어로 사용되어야 합니다. 일반적으로 베타액틴 및 저산소증 인산성 인산성 인산성 트랜스퍼라제 1 유전자와 같은 하우스키핑 유전자가 기준 유전자로 사용된다. 그러나, 이들은 형질전환 효율의 변화로 인해 이 유도 시스템과 함께 사용될 수 없다. 대신, tTA-Ad 전사체의 발현은 시토메갈로바이러스 프로모터의 활성으로 인해 세포에서 그 발현이 구성되기 때문에 정상화의 목적을 위해 평가된다. qPCR에 의해 측정된 임의의 발현의 변화는 형질감염 효율(프라이머: 포워드 5'-GCC TGA CGA CAA CAA AAC TC-3' 및 역5'-AGT GAT TAT TGT CC-3; 129 bp 앰플리콘)을 나타내며, 형질감염 클론의 발현의 정상화를 허용할것이다(그림 3).
4. SYBR 그린 염료 마스터 믹스를 사용하여 삼중항으로 각 qPCR 반응을 준비한다.
   1. 분자 생물학 등급의 물을 사용하여 5 ng/μL cDNA 혼합물을 1.25 ng/μL의 농도로 희석합니다.
   2. 5 μL의 SYBR 그린 염료 마스터 믹스 (2x), 분자 생물학 등급의 물 0.1 μL, 7.5 μM 포워드 프라이머의 0.45 μL, 7.5 μM 역프라이머의 0.45 μL, 4 μL의 1.25 ng/μL cDNA를 결합하여 10 μL의 총 반응량을 10 μL및 파이프에 잘 섞어 얻을 수 있습니다. 광학 접착제 필름을 사용하여 플레이트 커버가 밀봉되었는지 확인하고 오염 및 증발을 방지하십시오.
   3. 원심분리에 의해 반응 믹스를 짧게 스핀다운하고 플레이트를 qPCR 열자전거러에 놓습니다.
5. V5 태그가 달린 GOI 및 tTA-Ad 앰플리콘을 다음과 같은 qPCR 조건을 사용하여 증폭: 변성 단계로 10분 동안 95°C, 10초동안 95°C의 40사이클, 15초에 58°C, 20초동안 72°C. 증폭 사이클이 수행된 후 원하는 앰플리온의 특정 용융 온도를 평가하고 노이즈 앰플리온 피크가 없는지 확인하기 위해 고해상도 용융 곡선이 생성되어야 합니다.
   1. qPCR 에 첨가되지 않은 cDNA없이 잠재적 인 플라스미드 DNA 오염 및 qPCR에 대한 대조군역할을 하는 역전사 없이 RNA를 템플릿으로 수행함으로써 qRT-PCR에 대한 음성 제어를 포함시켜 프라이머 이머의 부족을 보장하거나 오염 물질.
   2. 표준 곡선 분석에 의해 GOI에 따라 최적의 cDNA 농도, 프라이머 효율 및 농도를 최적화해야 합니다. 이렇게하려면, 치료되지 않은 세포에서 cDNA를 사용하여 직렬 희석을 수행 (독시 사이클린없이 배양). 표준 곡선은 cDNA 희석 계수의 로그에 대해 Cq 값을 플로팅하여 생성되며, 증폭 효율(E)은 다음 공식을 사용하여 표준 곡선의 기울기에 따라 계산됩니다.
      E = 10^-1/경사
      참고: 증폭 효율은 약 0.9 ~ 1.05이어야 합니다. 그렇지 않으면 프라이머를 다시 디자인해야 합니다.
6. 비교 Cq 방법을 사용하여 qPCR 데이터를 분석하여 GOI의 발현 값을 tTA-Ad의 발현으로 정상화하여 GOI의 상대적인 발현 수준을 얻고, 시작점(t=0)에서 동일한 동물로부터 의 세포에서 GOI의 mRNA 발현의 백분율로 그 발현을보고하였다(t=0)(도 4).
7. 반감기는 다음 방정식을 사용하여 GOI mRNA 분해 곡선의 속도 상수(K)로부터 결정됩니다.
   t_1/2 = ln 2/K.

결과

이 프로토콜은 1차 폐포 상피 세포에서 전사성 안정성의 변조에서 αENaC 3' UTR의 상이한 부분의 중요성을 평가하기 위해 Tet-Off 전사적으로 제어된 플라스미드 발현 시스템을 생성하는 데 성공적으로 사용되었다.

이 시스템의 구현의 첫 번째 단계는 치포 상피 세포를 위한 빠르고 쉽고 효율적인 형질감염 기술을 확립하는 것이었...

토론

1차 배양에서 폐포 상피 세포의 낮은 형질감염속도는 이들 세포에서 mRNA 안정성을 평가하기 위해 Tet-Off 시스템의 사용에 대한 심각한 제한이었다. 그러나, 이러한 한계는 파이펫 전기개공에 의해 극복되었고, 25-30% 형질감염 효율을 허용하였다(도1 및 도 3)^26.

전사체 안정성의 측정은 주어진 mRNA의 변조와 세포 항상...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actinomycin D	Sigma-Aldrich	A9415
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A1593
Bright-LineHemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Chloroform - Molecular biology grade	Sigma-Aldrich	C2432
ClaI	New England Biolabs	R0197S
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast	Leica	-
DNase I, Amplification Grade	Invitrogen	18068015
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium	Wisent Bioproducts	311-425-CL
Ethanol - Molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818100
Excella E25 ConsoleIncubatorShaker	Eppendorf	1220G76
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
HEPES pH 7.3	Sigma-Aldrich	H3784
Heracell 240i	ThermoFisher Scientific	51026420
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad Laboratories	1708890
Isopropanol - Molecular biology grade	Sigma-Aldrich	I9516
LB Broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022
LB Broth with agar (Lennox)	Sigma-Aldrich	L2897
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10	Sigma-Aldrich	L9143
MEM, powder	Gibco	61100103
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate	Applied Biosystems	N8010560
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems	4360954
MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets	ThermoFisher Scientific	51025413
Mupid-exU electrophoresis system	Takara Bio	AD140
NanoDrop 2000c	ThermoFisher Scientific	ND-2000
Neon Transfection System 10 µL Kit	Invitrogen	MPK1025
Neon Transfection System Starter Pack	Invitrogen	MPK5000S
NheI	New England Biolabs	R0131S
One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli	Invitrogen	C854003
pcDNA3 vector	ThermoFisher Scientific	V790-20
pcDNA3-EGFP plasmid	Addgene	13031
PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity	Invitrogen	11304011
pTet-Off Advanced vector	Takara Bio	631070
pTRE-Tight vector	Takara Bio	631059
Purified alveolar epithelial cells	n.a.	n.a.
QIAEX II Gel Extraction Kit	QIAGEN	20021
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12162
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27104
QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software	Applied Biosystems	n.a.
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast	Applied Biosystems	4485697
Recombinant Rat TNF-alpha Protein	R&D Systems	510-RT-010
Septra	Sigma-Aldrich	A2487
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	New England Biolabs	M0371S
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories	1725270
SuperScript IV Reverse Transcriptase	Invitrogen	18090010
T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	EL0011
Tet System Approved FBS	Takara Bio	631367
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596018
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500
Water, Molecular biology Grade	Wisent Bioproducts	809-115-EL