בידוד, תרבות, והשראה של הרכס העצבי המקורי אדיפוז-תאי גזע שמקורם ברקמת אדיפוז

Summary

אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד, התרבות, והאינדוקציה האדיגנית של הרכס העצבי (NCADSCs) מתוך רקמת השומן של ה-Wnt-1 יצורים^+/-; Rosa26^Rfp/+ עכברים. NCADSCs יכול להיות מקור נגיש בקלות של ADSCs עבור מידול אדיפוגנזה או ליפוגנזה ב מבחנה.

Abstract

כמות מוגזמת של רקמת אדיפוז מסביב לכלי הדם (רקמת השומן הפריקולרית, המוכרת גם כ-PVAT), קשורה לסיכון גבוה למחלות לב וכלי דם. ADSCs שמקורם ברקמות שונות מציגות תכונות נפרדות, ואלה מ-PVAT מ לא התאפיין היטב. במחקר שנערך לאחרונה, דיווחו כי חלק ADSCs ברקמת השומן של האבי העורקים (PAAT) לרדת מן התאים ציצה עצבית (NCCs '), אוכלוסייה ארעית של תאים נודדים שמקורם האקטועור.

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול עבור בידוד חלבון פלורסנט אדום (RFP) מתויג NCCs מ PAAT של Wnt-1 היצורים^+/-; Rosa26^Rfp/+ עכברים וגרימת בידול האדיגניים שלהם בתוך מבחנה. בקצרה, שבר כלי הדם סטרומה (SVF) הוא הושעה אנזימטי של PAAT, ו-RFP⁺ ציצה עצבית הנגזרת ADSCs (NCADSCs) מבודדים על ידי מיון תא המופעל על ידי הזריחה (facs). NCADSCs להבדיל לתוך שניהם adipocytes חום ולבן, יכול להיות cryopreserved, ולשמור על פוטנציאל האדיגניים שלהם עבור ~ 3 – 5 מעברים. הפרוטוקול שלנו יכול ליצור ADSCs שופע מתוך PVAT ל עבור דוגמנות PVAT ע או ליפוגנזה בתוך מבחנה. לפיכך, NCADSCs אלה יכולים לספק מערכת רבת-ערך לחקר המתגים המולקולריים המעורבים בבידול PVAT מ.

Introduction

השכיחות של השמנת יתר היא גוברת ברחבי העולם, אשר מגביר את הסיכון של מחלות כרוניות קשורות, כולל מחלות לב וכלי דם, סוכרת¹. PVAT מ המקיף כלי דם הוא מקור עיקרי של גורמים האנדוקריניים האנדוקרינית המעורבים בפונקציה vascuלטורה. מחקרים קליניים מראים כי תוכן ה-pvat הגבוה הוא גורם סיכון עצמאי של מחלות לב וכלי דם^2,3, והפונקציה הפתולוגית שלו תלויה בפנוטיפ של בתאי הגזע שנגזר האדיפוז (ADSCs)⁴.

למרות הקווים של התאים ADSC כמו murine 3T3-L1, 3T3-F442A, ו OP9 הם מודלים סלולריים שימושיים כדי ללמוד adipogenesis או ליפוגנזה⁵, מנגנוני הרגולציה של אדיפוגנזה שונים בין קווי התא תאים ראשוניים. ADSCs ב סטרומה תא כלי דם (SVF) מבודד ישירות מרקמות אדיפוז והמושרה להבדיל לתוך adipocytes סביר להניח ביותר בשנת vivo אדיפוגנזה וליפוגנזה⁶. עם זאת, שבריאת, ציפה, ואת הווריאציות גודל וimmunophenotypes של ADSCs להפוך את הבידוד הישיר שלהם מאתגרת. בנוסף, הליכי הבידוד השונים יכולים גם להשפיע באופן משמעותי על היכולת הפוטנציאלית של^{התאים האלה, ובכך}מדגישים את הצורך בפרוטוקול השומר על תקינות adsc.

רקמת אדיפוז מסווגת בדרך כלל כרקמת השומן הלבנה המורפולוגית והפונקציונלית (וואט), או רקמת השומן החום (BAT)⁸, אשר מנמלים בנפרד ADSCs⁹. בעוד ADSCs בודד מן הואגונאדאל ומוואטים תת עורית התאפיין במחקרים קודמים^9,10,11,12, פחות ידוע לגבי ADSCs מ-pvat כי מורכב בעיקר מבת¹³.

במחקר שנערך לאחרונה, מצאנו שחלק מADSCs התושב ברקמת השומן של אבי העורקים (paat) נגזרים מתאי ציצה עצבית (nccs ק), אוכלוסייה ארעית של תאים של מהגרים מהגרים שמקורם בעור של^14,15. Wnt1-עכברים טרנסגניים שימשו למעקב של מעקב העצבים העצבי תא^16,17. חצינו Wnt1-היצורים⁺ עכברים עם Rosa26^rfp/+ עכברים ליצור Wnt-1 היצורים^+/-; Rosa26^rfp/+ עכברים, שבו nccs ו צאצאיהם מסומנים עם חלבון פלורסנט אדום (rfp) ומסומנים בקלות בvivo ובמבחנה¹⁵. כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד ציצה עצבית הנגזרת ADSCs (NC-נגזר ADSCs, או NCADSCs) מהעכבר PAAT ולגרום NCADSCs להבדיל לתוך adipocytes לבן או adipocytes חום.

Protocol

פרוטוקול בעלי החיים נבדק ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'יאו טונג שנגחאי.

1. הדור של Wnt-1 היצורים^+/-; Rosa26^Rfp/+ עכברים

1. הצלב Wnt-1 היצורים^+/- עכברים¹⁶ עם Rosa26^rfp/+ עכברים¹⁸ כדי ליצור wnt-1 יצורים^+/-; Rosa26^Rfp/+ עכברים. עכברים הבית תחת 12 h מחזור אור/כהה במתקן ללא פתוגן ב 25 ° צ' ו 45% לחות עד שהם 4 – 8 שבועות.

2. חיתוך הפביט

הערה: ראה איור 1.

1. לחטא את כל כלי הניתוח (למשל, מספריים כירורגי, מלקחיים סטנדרטיים, מספריים יקרוכירורגית ומלקחיים) על ידי אוטוקלינג ב 121 ° c עבור 30 דקות.
2. להכין את העיכול בינונית (גלוקוז גבוה בינוני הנשר השונה של Dulbecco [HDמאמ] המכיל 2 מ"ג/mL קולגן סוג I). הכן את מדיום התרבות (HDMEM המכיל 10% סרום בקר עוברי [FBS] ו 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין [PS]). לחטא באמצעות מסנן מזרק 0.22 יקרומטר לפני השימוש.
3. לחטא את התרבות התאית באמצעות UV, אתנול, סינון, או קיטור, לפי הצורך.
4. הכינו צלחת פטרי עם תמיסת מלוחים מאוזנת של הנקס (HBSS) ו-15 מ"ל שפופרת חרוטי עם 10 מ ל של HBSS שיושלם עם 1% v/v של פתרון PS. . שמור על שניהם בקרח
5. . והקריבו על ידי^{נקע בצוואר} הרחם לטבול את הגופים בגביע מלא 75% אלכוהול (200 mL) עבור 5 דקות כדי לעקר את פני העור.
6. חותכים ומפרידים את העור על הבטן וחותכים לאורך קו האמצע הגחוני מהאגן אל הצוואר. לפתוח את הבטן ולהזיז את הכבד כדי לחשוף את הסרעפת¹⁹.
7. חותכים את הסרעפת ואת הצלעות משני צדי קו האמצע וחושפים את הלב ואת הריאות באמצעות קילוף הצלעות לאחור.
8. הסר את הריאה בלוטת התימוס ולחלץ את PAAT יחד עם העורקים והלב.
9. לחתוך את אבי העורקים בשורש אבי העורקים. כדי להסיר את הלב בצע חתך בין קשת אבי העורקים לבין עורק האבי הראש והפרד בזהירות את רקמת השומן שמסביב לשני המבנים והעורקים השמאליים והימניים המשותפים מהקיר האחורי של החזה. העבירו את הרקמה למאגר הקרח הקר של HBSS בצלחת פטרי.
10. באמצעות מלקחיים סטריליים, להסיר את החלק הגדול של ואצלב (למשל, העורקים, עורקים העורק המשותף, ועוד ועוד ועוד) והfascia ככל האפשר, ולהעביר את הרקמה האדיפוז לתוך 2 מ"ל Eppendorf צינורות מכילים 0.5 mL קר ice-HBSS מאגר על הקרח.

3. בידוד של ה-SVF

לאסוף את PAAT של 5-6 עכברים לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה אחד 2 mL המכיל 1 mL העיכול טרי מדיום בינונית ומיץ את הרקמה באמצעות מספריים כירורגי בצינור Eppendorf בטמפרטורת החדר (RT).

1. העבר את המיקס לצינורות 50 mL המכילים 9 מ ל של מדיום העיכול. הומוגון לסדר את הרקמות על ידי ליטוף למעלה ולמטה עם הצינורות 1 מ"ל.
2. מודדקת את הצינורות ב 37 ° צ' עם טלטול קבוע ב 100 rpm עבור 30-45 דקות ולבדוק כל 5 – 10 דקות כדי למנוע עיכול יתר. זה קריטי לשיפור הכדאיות התאית והתשואה.
   הערה: העיכול הטוב של רקמת הרקמה יביא לרקמה הומוגנית והצהובה הנראית לעין בלתי על התערכה בעדינות בצינור.
3. להפסיק את העיכול על ידי הוספת 5 מ ל HDמאמ המכיל 10% FBS ו 1% v/v PS ב RT ולערבב היטב על ידי ליטוף.
4. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 500 x g עבור 5 דקות ב-RT. ה-SVF יהיה גלוי כגלולה חומה. בזהירות מרעיף את adipocytes צף decant את supernatant הנותרים מבלי להפריע SVF. מפזר את הגלולה svf ב 10 מ ל של תרבות בינונית ולסנן דרך מסננת תא 70 יקרומטר.
5. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 500 x g עבור 5 דקות, להסיר את supernatant, ולהשהות בעדינות את הגלולה ב 5 מ ל של מאגר הליזה אריתרופואריציט ב 15 מ"ל שפופרת חרוטי עבור 10 דקות ב RT.
6. להפסיק את התגובה על ידי הוספת 10 mL של 1 x PBS המכיל 1% FBS. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c, להסיר את supernatant, ולהשעות מחדש את הגלולה ב 10 מ ל של 1 x PBS המכיל 1% fbs.
7. צנטריפוגה את התאים שוב ב 500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-5 מ ל של מדיום התרבות ב-15 מ ל בשפופרת חרוט ב-4 ° c.
8. לאחר סיבוב הסופי של צנטריפוגה (500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c), להשהות מחדש את התאים הפלטאד ב 5 מ ל של מאגר facs (PBS המכיל 10% fbs, 100 יחידות/ML-DNA אני, ו 1% v/v PS) על הקרח, ולספור את התאים עם הומוציטומטר

4. בידוד של NCADSCs על ידי FACS

1. הגדר ומטב את סדרן התא בהתאם למדריך ההדרכה. בחר את זרבובית 100 יקרומטר, עקר את צינורות הגבייה, התקן את התקן הגבייה הנדרש והגדר את הזרמים הצדדיים²⁰.
2. 561 ננומטר צהוב/ירוק לייזר ומסנן אופטי 579/16 מומלצים למיון RFP⁺ תאים. בצע את הפיצוי באמצעות הפקד השלילי והפקדים החיוביים המוכתמים בודדים. ראה איור 2א עבור הערכה של התוכנית.
3. לסנן את התאים באמצעות מסננת 40 יקרומטר, צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות, ולהשעות מחדש את התאים 2 מ ל של מאגר facs בצפיפות של 0.5 – 1 x 10⁷/ml. העבר את התאים באופן ברור בתווית 5 מ ל קלקר בתחתית הצינורות, ו לטעון לתוך סדרן.
4. הפעל את הצינורית לדוגמה הניסיונית ב-4 ° c, הפעל את לוחות הטיה, ומיין לתוך שפופרת של 15 מ"ל מראש עם RPMI המכיל 1% FBS ו-1% v/v PS.
   הערה: להגן על דגימות מפני אור חזק כדי למזער את מקושה RFP.

5. תרבות הNCADSCs

1. צלחת התאים הממוינים בצפיפות של 5,000 תאים/cm² ב 12 לוחית התרבות היטב בינונית תרבות מלאה ו דגירה ב 37 ° c באווירה לח עם 5% CO₂ עבור 20 – 24 h.
2. הסר את מדיום התרבות, לשטוף את התאים עם טרום מחומם (37 ° c) PBS להסרת פסולת התא ולהוסיף מדיום התרבות הטרייה.
3. כאשר התאים הם 80-90% מאגד, לעכל את המונאולייר באמצעות 0.25% טריפסין הפתרון EDTA ב 37 ° c בחממה עבור 3-5 דקות, ולנטרל עם 2 מ ל של מדיום התרבות.
4. צנטריפוגה את התאים שנקטפו עבור 15 דקות ב 250 x g ב RT, הסר את הסופרנטאנט, והשהה מחדש את התאים ב 1 mL של מדיום התרבות. . תספור את התאים באמצעות הומוטומטר
5. זרע את התאים בצלחת 12 היטב התרבות בצפיפות של 5,000 תאים/cm².
6. השהה מחדש את התאים הנותרים במדיום התרבותי המכיל 10% DMSO, להקפיא ולאחסן בחנקן נוזלי.

6. השראה אדיגנית של NCADSCs

1. לגרום הבחנה אדיפוגניים של NCADSCs בשנת 80 – 90% שליטה ותנאים התרבות הסטנדרטית²¹.
2. עבור השראה חום האינדוקציה, תחילה לטפל בתאים מתורבתים עם מדיום אינדוקציה חום אדיפוגניים (HDMEM 10% FBS, 1% v/v PS, 0.5 מ"מ/L IBMX, 0.1 μM/L dexamethone, 1 μM/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine, ו 1 μg/mL אינסולין) במשך יומיים. לשטוף את התאים עם PBS 2x ולהחליף עם בינוני טרי (HDMEM 10% FBS, 1% v/v PS, 1 μM/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine, ו 1 μg/mL אינסולין). לשנות את המדיום כל 2 ימים עבור סך של 3 – 5x.
3. עבור אינדוקציה האדיפוגניים לבן, תחילה לטפל בתאים עם השראה לבן אינדוקציה בינונית (HDMEM 10% FBS, 1% v/v PS, 0.5 mM/L IBMX, 0.1 μM/L dexamethone, ו-1 μg/mL אינסולין) במשך יומיים. שטוף את התאים עם PBS 2x ולהחליף עם בינוני טרי (HDMEM 10% FBS, 1% v/v PS, ו 1 μg/mL אינסולין). שנה בינונית זו כל 2 ימים עבור סך של 3-5x.
4. לנתח את התאים האדיפוגניים לפי הצורך.
   הערה: להיות עדין כאשר לשטוף את התאים עם PBS. אדיפוציטים בונות יכול בקלות לשטוף משם.

תוצאות

באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, הגענו ~ 0.5 – 1.0 x 10⁶ ADSCs מ 5-6 wnt-1 היצורים^+/-; Rosa26^Rfp/+ עכברים (48 בן שבועות, זכר או נקבה).

תרשים הזרימה של אוסף PAAT מעכברים מוצג באיור 1. המבנה של הNCADSCs היה דומה ל-ADSC מן העכברים האחרים מרקמות האדיפוז. הNCADSCs התרבותיים הגיעו ל-80...

Discussion

במחקר זה, אנו מציגים שיטה אמינה לבידוד, תרבות, ואינדוקציה אדיפוגניים של NCADSCs שחולצו מ-PVAT של Wnt-1 היצורים^+/-; עכברים Rosa26^rfp/+ טרנסגניים שתוכננו לייצר rfp⁺ ADSCs. הדיווחים הקודמים מראים כי אין הבדל משמעותי בביטוי של תאי גזע mesenchymal כללי רב עוצמה (MSCs) סמנים ב NCADSCs ו לא NCADSCs²², ו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA	BBI life sciences	E672002-0500	Lot #: EC11FA0001
Agarose	ABCONE (China)	A47902	1% working concentration
Anti-cebp/α	ABclonal	A0904	1:1000 working concentration
Anti-mouse IgG, HRP-linked	CST	7076	1:5000 working concentration
Anti-perilipin	Abcam	AB61682	1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54
Anti-PPARy	SANTA CRUZ	sc-7273	0.2 μg/mL working concentration
Anti-rabbit IgG, HRP-linked	CST	7074	1:5000 working concentration
Anti-β-Tubulin	CST	2146	1:1000 working concentration
BSA	VWR life sciences	0332-100G	50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008
Collagenase, Type I	Gibco	17018029
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902	0.1 µM working concentration
Erythrocyte Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333
FBS	Corning	R35-076-CV	50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS
HBSS	Gibco	14025092
HDMEM	Gelifesciences	SH30243.01	Lot #: AD20813268
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM working concentration
Insulin	Sigma-Aldrich	I3536	1 μg/mL working concentration
Microsurgical forceps	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-F201A-1
Microsurgical scissor	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-H121A
Oil Red O solution	Sigma-Aldrich	O1516	0.3% working concentration
PBS (Phosphate buffered saline)	ABCONE (China)	P41970
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
PrimeScript RT reagent Kit	TAKARA	RR047A	Lot #: AK4802
RNeasy kit	TAKARA	9767	Lot #: AHF1991D
Rosa26RFP/+ mice	JAX	No.007909	C57BL/6 backgroud; male and female
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM working concentration
Standard forceps	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-F424
Surgical scissor	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-S231
SYBR Premix Ex Taq	TAKARA	RR420A	Lot #: AK9003
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2877	10 nM working concentration
Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice	JAX	No.009107	C57BL/6 backgroud; male and female