Изоляция, Культура и адипогенная индукция нейронных Креста Оригинальные жировые стволовые клетки из периаортных жировой ткани

Резюме

Мы представляем протокол для изоляции, культуры и адипогенной индукции нервного гребня полученных жировые стволовые клетки (NCADSCs) из периаортной жировой ткани Wnt-1 Cre^/-; Мышей Rosa26^RFP/'. NCADSCs может быть легко доступным источником ADSCs для моделирования адипогенеза или липогенеза в пробирке.

Аннотация

Чрезмерное количество жировой ткани, окружающих кровеносные сосуды (периваскулярная жировая ткань, также известная как PVAT) связано с высоким риском сердечно-сосудистых заболеваний. ADSCs, полученные из различных жировые ткани показывают различные особенности, и те из PVAT не были хорошо охарактеризованы. В недавнем исследовании, мы сообщили, что некоторые ADSCs в периаортной арки жировой ткани (PAAT) спуститься из нервных клеток гребня (NCCs), переходной популяции мигрирующих клеток, происходящих из эктодерма.

В этой работе мы описываем протокол для изоляции красного флуоресцентного белка (RFP) с маркировкой NCCs от PAAT Wnt-1^Cre Мышей Rosa26^RFP/' и индуцирование их адипогенной дифференциации in vitro. Вкратце, стромальная сосудистая фракция (SVF) ферментативно отделена от PAAT, а RFP^и нервный гребень, полученный ADSCs (NCADSCs), изолированы флуоресценцией активированной сортировки клеток (FACS). NCADSCs дифференцировать в коричневые и белые адипоциты, могут быть криоконсервированы, и сохранить их адипогенный потенциал для 3-5 проходов. Наш протокол может генерировать обильные ADSCs из PVAT для моделирования PVAT адипогенез или липогенез в пробирке. Таким образом, эти NCADSCs могут обеспечить ценную систему для изучения молекулярных переключателей, участвующих в дифференциации PVAT.

Введение

Распространенность ожирения растет во всем мире, что увеличивает риск связанных с ними хронических заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания и диабет^1. PVAT окружает кровеносные сосуды и является основным источником эндокринных и паракринных факторов, участвующих в функции сосудов. Клинические исследования показывают, что высокое содержание PVAT является независимым фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний^2,3, и его патологическая функция зависит от фенотипа составных жирового стволовых клеток (ADSCs)⁴.

Хотя линии клеток ADSC, такие как murine 3T3-L1, 3T3-F442A и OP9, являются полезными клеточными моделями для изучения адипогенеза или липогенеза⁵, регулирующие механизмы адипогенеза различаются между клеточными линиями и первичными клетками. ADSCs в стромальной сосудистой клетки фракции (SVF) изолированы непосредственно из жировой ткани и индуцированных дифференцировать в адипоциты, скорее всего, резюмировать in vivo адипогенез и липогенез⁶. Тем не менее, хрупкость, плавучесть, и различия в размерах и иммунофенотипов ADSCs сделать их прямой изоляции сложной задачей. Кроме того, различные процедуры изоляции может также существенно повлиять на фенотип и адипогенной потенциальной способности этих клеток⁷, таким образом подчеркивая необходимость протокола, который поддерживает целостность ADSC.

Жировая ткань, как правило, классифицируется как либо морфологически и функционально различные белые жировой ткани (WAT), или коричневой жировой ткани (BAT)⁸, который гавани различных ADSCs⁹. В то время как ADSCs изолированы от perigonadal и паховой подкожной WATs были охарактеризованы в предыдущих исследованиях^9,10,11,12, меньше известно в отношении ADSCs от PVAT, который в основном состоит из BAT¹³.

В недавнем исследовании, мы обнаружили, что часть резидентов ADSCs в периаортной арки жировой ткани (PAAT) являются производными от нервных клеток гребня (NCCs), переходной популяции мигрирующих клеток-прародителей, которые происходят из эктодерма^14,15. Wnt1-Cre трансгенных мышей были использованы для отслеживания развития нервных гребня клеток^16,17. Мы пересекли Wnt1-Cre^мышей с Rosa26^{RFP / мышей} для создания Wnt-1 Cre^/-; Мышей Rosa26^RFP/, в которых НКК и их потомки помечены красным флуоресцентным белком (RFP) и легко отслеживаются в vivo и in vitro¹⁵. Здесь мы описываем метод изоляции нервного гребня производных ADSCs (NC-производных ADSCs, или NCADSCs) от мыши PAAT и побудить NCADSCs дифференцировать в белые адипоциты или коричневые адипоциты.

протокол

Протокол о животных был рассмотрен и одобрен Комитетом по уходу за животными Шанхайского университета Цзяо Тонг.

1. Поколение Wnt-1^Cre Rosa26^RFP/' Мыши

1. Крест Wnt-1 Cre^{No /-} мышей¹⁶ с Rosa26^{RFP / мышей 18} для создания Wnt-1^Cre Мышей Rosa26^RFP/'. Домашние мыши под 12 ч свет / темный цикл в патоген-свободной объекта на 25 кВ и 45% влажности, пока они не 4-8 недель.

2. Рассечение ПААТ

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 1.

1. Стерилизовать все хирургические инструменты (например, хирургические ножницы, стандартные щипцы и микрохирургические ножницы и щипцы) путем автоматического автоматического при 121 градусах Цельсия в течение 30 мин.
2. Подготовьте среду пищеварения (Высокоглюкоза Dulbecco в модифицированный eagle Medium (HDMEM), содержащий 2 мг/мл коллагеназа типа I). Подготовьте культурную среду (HDMEM, содержащую 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 1% v/v пенициллин-стрептомицин (PS). Стерилизовать с помощью фильтра шприца 0,22 мкм перед использованием.
3. Стерилизовать реагенты клеточной культуры с использованием УФ, этанола, фильтрации или пара, по мере необходимости.
4. Приготовьте блюдо Петри с помощью сбалансированного соленого раствора Хэнкса (HBSS) и конической трубки 15 мл с 10 мл HBSS, дополненной 1% v/v раствора PS. Держите обоих на льду.
5. Анестезия мышей¹⁵ с изофлуран и жертвоприношения шейки матки дислокации. Погрузите тела в стакан, наполненный 75% алкоголем (200 мл) в течение 5 минут для стерилизации поверхности кожи.
6. Вырезать и отделить кожу на животе и вырезать вдоль брюшной средней линии от таза до шеи. Откройте живот и переместить печень, чтобы разоблачить диафрагму¹⁹.
7. Вырезать диафрагмы и ребер с обеих сторон средней линии и подвергать сердца и легких, пилинг назад ребра.
8. Удалить легких и тимуса и извлечь PAAT вместе с аортой и сердцем.
9. Отрежьте аорту у корня аорты, чтобы удалить сердце. Сделайте разрез между аортатической аркой и нисходящей аортой и тщательно отделите жировую ткань, окружающую обе структуры и левую и правую общую сонную артерии, от задней грудной стенки. Перенесите ткань в ледяной буфер HBSS в чашке Петри.
10. Используя стерильные щипцы, удалите как можно больше сосуд (например, аорты, общих сонных артерий и других мелких сосудистой) и фасции, а также перенесите жировую ткань в 2 мл труб Eppendorf содержат 0,5 мл ледяного буфера HBSS на льду.

3. Изоляция СВФ

Соберите PAAT 5-6 мышей в одну микроцентрифугую трубку 2 мл, содержащую 1 мл свежеприготовленной среды пищеварения и фарш ткани с помощью хирургических ножниц в трубке Eppendorf при комнатной температуре (RT).

1. Перенесите смесь в трубки 50 мл, содержащие 9 мл среды пищеварения. Гомогенизировать ткани путем pipetting вверх и вниз с 1 мл пипетки 10x.
2. Инкубировать трубки при 37 градусах Цельсия при постоянной тряске при 100 об/мин в течение 30-45 мин и проверяйте каждые 5-10 минут, чтобы предотвратить переварение желудка. Это имеет решающее значение для повышения жизнеспособности и урожайности клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошее пищеварение ткани приведет к однородной, светло-желтый жировой ткани, которая видна невооруженным глазом на мягко закрученного трубки.
3. Остановить пищеварение, добавив 5 мл HDMEM, содержащий 10% FBS и 1% v/v PS на RT и хорошо перемешать путем пипеттинга.
4. Центрифуга подвески ячейки на 500 х г в течение 5 мин на RT. SVF будет виден как коричневатый гранулы. Тщательно аспирируйте плавающие адипоциты и осечки оставшиеся супернатанты, не нарушая SVF. Растворите гранулы SVF в 10 мл культуры среды и фильтр через 70 мкм ячейки ситечко.
5. Centrifuge клеточной подвески на 500 х г в течение 5 минут, удалить супернатант, и осторожно resuspend гранулы в 5 мл из буфера лиза эритроцита в 15 мл конической трубки в течение 10 минут на RT.
6. Остановите реакцию, добавив 10 мл 1x PBS, содержащий 1% FBS. Centrifuge клеточной подвески на 500 х г в течение 5 минут при 4 кв С, удалить супернатант, и resuspend гранулы в 10 мл 1x PBS, содержащий 1% FBS.
7. Центрифуге клетки снова на 500 х г в течение 5 мин при 4 кв. C. Удалите супернатант и resuspend гранулы в 5 мл культуры среды в 15 мл конической трубки при 4 градусах Цельсия.
8. После заключительного раунда центрифугации (500 х г в течение 5 мин при 4 градусах По Цельсию) переприостановите пеллетные клетки в 5 мл буфера FACS (PBS, содержащего 10% FBS, 100 единиц/мл ДНК I и 1% v/v PS) на льду и подсчитайте клетки гемоцитометром.

4. Изоляция NCADSCs ФАКС

1. Настройка и оптимизация сортировки ячейки после инструкции. Выберите сопло площадью 100 мкм, стерилизуйте трубки для сбора, установите необходимое устройство сбора и установите боковые потоки^20.
2. Для сортировки клеток RFP^{рекомендуется} 561 нм желтого/зеленого лазера и оптического фильтра 579/16. Выполните компенсацию с использованием отрицательного контроля и одноцветного положительного контроля. См Рисунок 2А для схемы gating.
3. Фильтр клетки через 40 мкм ситечко, центрифуга на 500 х г в течение 5 минут, и повторной работы клеток в 2 мл буфера FACS при плотности 0,5-1 х 10⁷/мл. Перенесите клетки на четко обозначенные 5 мл круглых нижних полистироловых труб и загрузите в сортировку.
4. Запустите экспериментальный образец трубки при 4 градусах Цельсия, включите плиты отклонения и сортируйте в коническую трубку 15 мл, предварительно покрытую RPMI, содержащей 1% FBS и 1% v/v PS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите образцы от сильного света, чтобы свести к минимуму закалку RFP.

5. Культура NCADSCs

1. Плита отсортированных клеток при плотности 5000 клеток / см² в 12 хорошо культуры пластины в полной среде культуры и инкубировать при 37 градусов по Цельсию во влажной атмосфере с 5% CO₂ для 20-24 ч.
2. Удалите культурную среду, промойте клетки с преропарированным (37 градусов по Цельсию) PBS, чтобы удалить мусор клеток и добавить свежую среду культуры.
3. После того, как клетки 80-90% сливаются, переварить монослой с помощью 0,25% трипсин EDTA раствор при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе в течение 3-5 мин, и нейтрализовать с 2 мл культуры среды.
4. Центрифуги собранных клеток в течение 15 минут при 250 х г на РТ, удалить супернатант, и resuspend клеток в 1 мл культуры среды. Подсчитайте клетки гемоситометром.
5. Семена клеток в 12 хорошо культуры пластины при плотности 5000 клеток / см².
6. Приостанавливать оставшиеся клетки в культурной среде, содержащей 10% ДМСО, заморозить и хранить в жидком азоте.

6. Адипогенная индукция NCADSCs

1. Индуцировать адипогенную дифференциацию NCADSCs на 80-90% confluency и стандартных условиях культуры²¹.
2. Для коричневой адипогенной индукции сначала обработайте культивированные клетки коричневым адипогенным индукционным носителем (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 мМ/Л IBMX, 0,1 мкм/дексаметазон, 1 мкм/л розиглитазон, 10 нмоль/l триодотиронин. Вымойте клетки с PBS 2x и заменить свежей среде (HDMEM, 10% FBS, 1% V/v PS, 1 мкм / L розиглитазон, 10 нмоль / l трийодтиронин, и 1 мкг /мЛ инсулина). Изменение этой среде каждые 2 дня в общей сложности 3-5x.
3. Для белой адипогенной индукции сначала обработайте клетки с белой адипогенной индукционной средой (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 мМ/л IBMX, 0,1 мкм/л-дексаметазон и 1 мкг/мл инсулина) в течение 2 дней. Вымойте клетки с PBS 2x и заменить свежей среде (HDMEM, 10% FBS, 1% V/V PS, и 1 мкг /мл инсулина). Изменение этой среде каждые 2 дня в общей сложности 3-5x.
4. Анализ адипогенных клеток по мере необходимости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте нежны при мытье клеток с PBS. Дифференцированные адипоциты могут легко смыть.

Результаты

Используя описанный выше протокол, мы получили 0,5-1,0 х 10⁶ ADSCs от 5-6 Wnt-1 Cre^/-; Мышей Rosa26^RFP/) (48 недель, мужчины или женщины).

Диаграмма потока сбора PAAT от мышей представлена на рисунке 1. Морфология NCADSCs была похожа на ADSC от других мышей жировой ткан...

Обсуждение

В этом исследовании мы представляем надежный метод изоляции, культуры и адипогенной индукции NCADSCs, извлеченных из PVAT Wnt-1^Cre Трансгенные мыши Rosa26^RFP/', предназначенные для производства РПП^и ADSC. Предыдущие доклады показывают, что нет существенной разницы в выражении общих ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA	BBI life sciences	E672002-0500	Lot #: EC11FA0001
Agarose	ABCONE (China)	A47902	1% working concentration
Anti-cebp/α	ABclonal	A0904	1:1000 working concentration
Anti-mouse IgG, HRP-linked	CST	7076	1:5000 working concentration
Anti-perilipin	Abcam	AB61682	1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54
Anti-PPARy	SANTA CRUZ	sc-7273	0.2 μg/mL working concentration
Anti-rabbit IgG, HRP-linked	CST	7074	1:5000 working concentration
Anti-β-Tubulin	CST	2146	1:1000 working concentration
BSA	VWR life sciences	0332-100G	50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008
Collagenase, Type I	Gibco	17018029
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902	0.1 µM working concentration
Erythrocyte Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333
FBS	Corning	R35-076-CV	50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS
HBSS	Gibco	14025092
HDMEM	Gelifesciences	SH30243.01	Lot #: AD20813268
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM working concentration
Insulin	Sigma-Aldrich	I3536	1 μg/mL working concentration
Microsurgical forceps	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-F201A-1
Microsurgical scissor	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-H121A
Oil Red O solution	Sigma-Aldrich	O1516	0.3% working concentration
PBS (Phosphate buffered saline)	ABCONE (China)	P41970
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
PrimeScript RT reagent Kit	TAKARA	RR047A	Lot #: AK4802
RNeasy kit	TAKARA	9767	Lot #: AHF1991D
Rosa26RFP/+ mice	JAX	No.007909	C57BL/6 backgroud; male and female
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM working concentration
Standard forceps	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-F424
Surgical scissor	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-S231
SYBR Premix Ex Taq	TAKARA	RR420A	Lot #: AK9003
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2877	10 nM working concentration
Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice	JAX	No.009107	C57BL/6 backgroud; male and female