Isolement, culture et induction adipogénique des cellules souches adipeuses originales dérivées de l’adipose de l’adipose de l’adiacisation périortique

Résumé

Nous présentons un protocole pour l’isolement, la culture, et l’induction adipogenic des cellules souches adipeuses dérivées de crête neurale (NCADSCs) du tissu adipeux périortique de Wnt-1 Cre^-/-; Rosa26^{RFP /} souris. Les NCADSC peuvent être une source facilement accessible d’ADSCs pour la modélisation de l’adipogénèse ou de la lipogenèse in vitro.

Résumé

Une quantité excessive de tissu adipeux entourant les vaisseaux sanguins (tissu adipeux périvasculaire, également connu sous le nom de PVAT) est associée à un risque élevé de maladie cardio-vasculaire. Les ADSC dérivés de différents tissus adipeux présentent des caractéristiques distinctes, et ceux du PVAT n’ont pas été bien caractérisés. Dans une étude récente, nous avons rapporté que quelques ADSCs dans le tissu adipeux périortique d’arc (PAAT) descendent des cellules neurales de crête (NCCs), une population transitoire des cellules migratrices provenant de l’ectoderm.

Dans cet article, nous décrivons un protocole pour isoler les nCCs étiquetés par protéines fluorescentes rouges (PD) de la PAAT de Wnt-1^Cre.-; Rosa26^{RFP /} souris et induire leur différenciation adipogénique in vitro. En bref, la fraction vasculaire stromal (SVF) est enzymatiquement dissociée de l’APA, et la DP^- crête neurale dérivée ADSCs (NCADSCs) sont isolés par le tri des cellules activées par fluorescence (FACS). Les NCADSC se différencient en adipocytes bruns et blancs, peuvent être cryoconservés et conservent leur potentiel adipogénique pour des passages de 3 à 5. Notre protocole peut générer des ADSC abondants à partir du PVAT pour la modélisation de l’adipogénèse PVAT ou de la lipogenèse in vitro. Ainsi, ces NCADSCs peuvent fournir un système précieux pour étudier les commutateurs moléculaires impliqués dans la différenciation PVAT.

Introduction

La prévalence de l’obésité augmente dans le monde entier, ce qui augmente le risque de maladies chroniques connexes, y compris les maladies cardiovasculaires et le diabète¹. PVAT entoure les vaisseaux sanguins et est une source majeure de facteurs endocriniens et paracrines impliqués dans la fonction de la vascularisation. Les études cliniques montrent que la teneur élevée en PVAT est un facteur de risque indépendant de la maladie cardio-vasculaire^2,3, et sa fonction pathologique dépend du phénotype des cellules souches dérivées de l’adipose constituante (ADSCs)⁴.

Bien que les lignées cellulaires DaDSC comme la murine 3T3-L1, 3T3-F442A, et OP9 soient des modèles cellulaires utiles pour étudier l’adipogenèse ou la lipogenèse⁵, les mécanismes de régulation de l’adipogenèse diffèrent entre les lignées cellulaires et les cellules primaires. Les ADSC dans la fraction de cellules vasculaires stromal (SVF) isolées directement des tissus adipeux et induites pour se différencier en adipocytes récapitulent probablement l’adipogenèse in vivo et la lipogenèse^6. Cependant, la fragilité, la flottabilité et les variations de taille et d’immunophénotypes des ADSC rendent leur isolement direct difficile. En outre, les différentes procédures d’isolement peuvent également affecter de manière significative le phénotype et la capacité potentielle adipogénique de ces cellules^7,soulignant ainsi la nécessité d’un protocole qui maintient l’intégrité d’ADSC.

Le tissu adipeux est typiquement classifié comme tissu d’adipeux blanc morphologiquement et fonctionnellement distinct (WAT), ou le tissu adipeux brun (BAT)⁸, qui abrite des ADSC distincts^9. Tandis que les ADSC isolés des WATs sous-cutanés périgonadalets et inguinals ont été caractérisés dans les études précédentes^9,10,11,12, moins est connu concernant les ADSC s’agit de PVAT qui est principalement composé de BAT¹³.

Dans une étude récente, nous avons constaté qu’une partie des ADSC résidents dans le tissu adipeux périortique d’arc (PAAT) sont dérivés des cellules neurales de crête (NCCs), une population transitoire des cellules progénitrices migratoires qui proviennent de l’ectoderm^14,15. Des souris transgéniques de Wnt1-Cre ont été employées pour tracer le développement neural de cellules de crête^16,17. Nous avons traversé wnt1-Cre^- souris avec Rosa26^{RFP /} souris pour générer Wnt-1 Cre^{- ;} Rosa26^{RFP /} Souris, dans lequel les CNC et leurs descendants sont étiquetés avec des protéines fluorescentes rouges (DP) et sont facilement suivis in vivo et in vitro¹⁵. Ici, nous décrivons une méthode pour isoler la crête neurale dérivée aDSCs (NC-dérivé ADSCs, ou NCADSCs) de la souris PAAT et induire les NCADSCs pour se différencier en adipocytes blancs ou adipocytes bruns.

Protocole

Le protocole animal a été examiné et approuvé par le Comité des soins aux animaux de l’Université Jiao Tong de Shanghai.

1. Génération de Wnt-1 Cre^-; Rosa26^{RFP /} Souris

1. Cross Wnt-1 Cre^-/- souris¹⁶ avec Rosa26^{RFP/ souris 18} pour générer Wnt-1 Cre^-/-; Rosa26^{RFP /} souris. Maison des souris sous un cycle de lumière/obscurité de 12 h dans une installation exempte d’agents pathogènes à 25 oC et 45 % d’humidité jusqu’à l’âge de 4 à 8 semaines.

2. Dissection du PAAT

REMARQUE: Voir Figure 1.

1. Stériliser tous les outils chirurgicaux (p. ex. ciseaux chirurgicaux, forceps standard et ciseaux et forceps microchirurgicaux) en autoclantant à 121 oC pendant 30 min.
2. Préparer le milieu de digestion (High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium [HDMEM] contenant 2 mg/mL de collagène de type I). Préparer le milieu de culture (HDMEM contenant 10% de sérum bovin fœtal [FBS] et 1% v/v pénicilline-streptomycine [PS]). Stériliser à l’aide d’un filtre à seringues de 0,22 m avant utilisation.
3. Stérilisez les réactifs de culture cellulaire à l’aide d’UV, d’éthanol, de filtration ou de vapeur, le cas échéant.
4. Préparer un plat Petri avec Hanks' Balanced Saline Solution (HBSS) et un tube conique de 15 ml avec 10 ml de HBSS complété avec 1% v/v de solution PS. Gardez les deux sur la glace.
5. Anesthésier les souris¹⁵ avec l’isoflurane et le sacrifice par dislocation cervicale. Immerger les corps dans un bécher rempli de 75% d’alcool (200 ml) pendant 5 min pour stériliser la surface de la peau.
6. Couper et séparer la peau sur l’abdomen et couper le long de la ligne médiane ventrale du bassin au cou. Ouvrez l’abdomen et déplacez le foie pour exposer le diaphragme¹⁹.
7. Couper le diaphragme et les côtes des deux côtés de la ligne médiane et exposer le cœur et les poumons en épluchant les côtes.
8. Retirer le poumon et le thymus et extraire le PAAT avec l’aorte et le cœur.
9. Couper l’aorte à la racine aortique pour enlever le cœur. Faire une coupe entre l’arc aortique et l’aorte descendante et séparer soigneusement le tissu adipeux entourant les deux structures et les artères carotides communes gauches et droites de la paroi thoracique postérieure. Transférer le tissu dans le tampon HBSS glacé dans le plat Petri.
10. À l’aide de forceps stériles, retirer autant de la vascularisation (p. ex., aorte, artères carotides courantes et autres petites vascularisations) et le fascia possible, et transférer le tissu adipeux dans les tubes d’Eppendorf de 2 ml contiennent un tampon HBSS de 0,5 ml de glace sur la glace.

3. Isolement de la SVF

Recueillir le PAAT de 5-6 souris dans un tube microcentrifuge de 2 ml contenant 1 ml de milieu de digestion fraîchement préparé et hacher le tissu à l’aide de ciseaux chirurgicaux dans un tube Eppendorf à température ambiante (RT).

1. Transférer le mélange dans des tubes de 50 ml contenant 9 ml du milieu de digestion. Homogénéiser les tissus en faisant monter et descendre avec une pipette 10x de 1 ml.
2. Incuber les tubes à 37 oC avec des secousses constantes à 100 tr/min pendant 30 à 45 min et vérifier toutes les 5 à 10 min pour éviter la surdigestion. Ceci est essentiel à l’amélioration de la viabilité et du rendement des cellules.
   REMARQUE : Une bonne digestion des tissus se traduira par un tissu adipeux jaune clair homogène qui est visible à l’œil nu en tourbillonnant doucement le tube.
3. Arrêter la digestion en ajoutant 5 mL de HDMEM contenant 10% FBS et 1% v/v PS à RT et bien mélanger par pipetting.
4. Centrifugelant la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min à RT. Le SVF sera visible sous forme de granule brunâtre. Aspirez soigneusement les adipocytes flottants et décants le reste du supernatant sans déranger le SVF. Dissoudre la pastille SVF dans 10 ml de milieu de culture et filtrer à travers une passoire à cellules de 70 m.
5. Centrifugelant la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min, retirez le supernatant et suspendez doucement la pastille dans 5 mL de tampon de lyse érythrocyte dans un tube conique de 15 ml pendant 10 min à RT.
6. Arrêtez la réaction en ajoutant 10 ml de 1x PBS contenant 1% FBS. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min à 4 oC, retirer le supernatant et resuspendre la pastille en 10 ml de 1x PBS contenant 1 % de FBS.
7. Centrifuger à nouveau les cellules à 500 x g pendant 5 min à 4 oC. Retirer le supernatant et resuspendre la pastille dans 5 ml de milieu de culture dans un tube conique de 15 ml à 4 oC.
8. Après un dernier tour de centrifugation (500 x g pour 5 min à 4 oC), resuspendre les cellules granulées en 5 ml de tampon FACS (PBS contenant 10 % de FBS, 100 unités/mL d’ADN I et 1 % v/v PS) sur la glace, et compter les cellules avec un hémocytomètre.

4. Isolement des NCADSC par les FACS

1. Configurez et optimisez le trieur cellulaire en suivant le manuel d’instructions. Sélectionnez la buse de 100 m, stérilisez les tubes de collecte, installez le dispositif de collecte requis et configurez les flux latéraux²⁰.
2. Un laser jaune/vert de 561 nm et un filtre optique 579/16 sont recommandés pour le tri des^cellules de la DP. Effectuer la compensation en utilisant le contrôle négatif et les contrôles positifs non tachés. Voir Figure 2A pour le schéma de gating.
3. Filtrer les cellules à travers une passoire de 40 m, centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min, et resuspendre les cellules dans 2 ml de tampon FACS à une densité de 0,5 x 1 x 10⁷/mL. Transférer les cellules dans des tubes de polystyrène ronds de 5 ml clairement étiquetés et charger dans le trieur.
4. Exécuter le tube d’échantillon expérimental à 4 oC, allumer les plaques de déviation et trier en un tube conique de 15 ml précouché avec RPMI contenant 1 % de FBS et 1 % de v/v PS.
   REMARQUE : Protégez les échantillons de la lumière forte pour minimiser l’étanchéité de la DP.

5. Culture des NCADSC

1. Plaquer les cellules triées à une densité de 5 000 cellules/cm² dans une plaque de culture de 12 puits dans un milieu de culture complet et incuber à 37 oC dans une atmosphère humide avec 5 % de CO₂ pour 20 à 24 h.
2. Enlever le milieu de culture, laver les cellules avec du PBS préchauffé (37 oC) pour enlever les débris cellulaires et ajouter un milieu de culture frais.
3. Une fois que les cellules sont confluentes à 80 à 90 %, digérez la monocouche à l’aide d’une solution EDTA de trypsine de 0,25 % à 37 oC dans un incubateur de 3 à 5 min, et neutralisez-la avec 2 ml de milieu de culture.
4. Centrifuger les cellules récoltées pendant 15 min à 250 x g à RT, enlever le supernatant, et resuspendre les cellules dans 1 ml de milieu de culture. Comptez les cellules avec un hémocytomètre.
5. Ensemencer les cellules dans une plaque de culture de 12 puits à la densité de 5 000 cellules/cm².
6. Resuspendre les cellules restantes dans le milieu de culture contenant 10% de DMSO, congeler et stocker dans l’azote liquide.

6. Induction adipogénique des NCADSC

1. Induire la différenciation adipogénique des NCADSCs à 80-90% de confluence et conditions de culture standard²¹.
2. Pour l’induction adipogénique brune, traitez d’abord les cellules cultivées avec le milieu d’induction adipogénique brun (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0.5 mM/L IBMX, 0.1M/L dexamethasone, 1 'M/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine, et 1 'g/mL insuline) pendant 2 jours. Laver les cellules avec pbS 2x et les remplacer par un milieu frais (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 1 m/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine, et 1 'g/mL insuline). Changez ce médium tous les 2 jours pour un total de 3 à 5x.
3. Pour l’induction adipogénique blanche, traitez d’abord les cellules avec le milieu adipogenic blanc d’induction (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0.5 mM/L IBMX, 0.1 M/L dexamethasone, et 1 'g/mL insuline) pendant 2 jours. Laver les cellules avec du PBS 2x et les remplacer par un milieu frais (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, et 1'g/mL d’insuline). Changez ce milieu tous les 2 jours pour un total de 3-5x.
4. Analyser les cellules adipogéniques le cas échéant.
   REMARQUE : Soyez doux lorsque vous lavez les cellules avec du PBS. Les adipocytes différenciés peuvent facilement se laver.

Résultats

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, nous avons obtenu 0,5 à 1,0 x 10⁶ ADSC de 5 à 6 Wnt-1^Cre.-; Rosa26^{Souris De p.} 100 (48 semaines, mâle ou femelle).

Le diagramme d’écoulement de la collection de PAAT des souris est présenté dans la figure 1. La morphologie des NCADSCs était semblable à l’ADSC d’autres tissus adipeux de souris. Les NCADSC cultivés ont atteint 80 à 90 % de confluence après 7 à 8 jours de ...

Discussion

Dans cette étude, nous présentons une méthode fiable pour l’isolement, la culture et l’induction adipogénique des NCADSC extraits du PVAT de Wnt-1^Cre. Rosa26^{RFP /} souris transgéniques conçues pour produire des PDSA. Les rapports précédents montrent qu’il n’y a pas de différence significative dans l’expression des marqueurs mésenchymal sénogènes (MSC) généraux dans les NCADSCets et non NCADSCs²², et que les NCADSCont ont un fort potentiel de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA	BBI life sciences	E672002-0500	Lot #: EC11FA0001
Agarose	ABCONE (China)	A47902	1% working concentration
Anti-cebp/α	ABclonal	A0904	1:1000 working concentration
Anti-mouse IgG, HRP-linked	CST	7076	1:5000 working concentration
Anti-perilipin	Abcam	AB61682	1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54
Anti-PPARy	SANTA CRUZ	sc-7273	0.2 μg/mL working concentration
Anti-rabbit IgG, HRP-linked	CST	7074	1:5000 working concentration
Anti-β-Tubulin	CST	2146	1:1000 working concentration
BSA	VWR life sciences	0332-100G	50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008
Collagenase, Type I	Gibco	17018029
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902	0.1 µM working concentration
Erythrocyte Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333
FBS	Corning	R35-076-CV	50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS
HBSS	Gibco	14025092
HDMEM	Gelifesciences	SH30243.01	Lot #: AD20813268
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM working concentration
Insulin	Sigma-Aldrich	I3536	1 μg/mL working concentration
Microsurgical forceps	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-F201A-1
Microsurgical scissor	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-H121A
Oil Red O solution	Sigma-Aldrich	O1516	0.3% working concentration
PBS (Phosphate buffered saline)	ABCONE (China)	P41970
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
PrimeScript RT reagent Kit	TAKARA	RR047A	Lot #: AK4802
RNeasy kit	TAKARA	9767	Lot #: AHF1991D
Rosa26RFP/+ mice	JAX	No.007909	C57BL/6 backgroud; male and female
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM working concentration
Standard forceps	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-F424
Surgical scissor	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-S231
SYBR Premix Ex Taq	TAKARA	RR420A	Lot #: AK9003
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2877	10 nM working concentration
Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice	JAX	No.009107	C57BL/6 backgroud; male and female