Isolamento, cultura e indução adipogênica de células-tronco originais de adipose da crista neural do tecido adipogênico periaorótico

Resumo

Apresentamos um protocolo para o isolamento, cultura e indução adipogênica de células-tronco derivadas de adipose derivados da crista neural (NCADSCs) do tecido periártico adiposo de Wnt-1 Cre^+/-; Rostou rosa26^RFP/+. Os NCADSCs podem ser uma fonte de ADSCs facilmente acessível para modelar adipogênese ou lipogênese in vitro.

Resumo

Uma quantidade excessiva de tecido adiposo ao redor dos vasos sanguíneos (tecido adiposo perivascular, também conhecido como PVAT) está associada a um alto risco de doenças cardiovasculares. Os ADSCs derivados de diferentes tecidos adiposos apresentam características distintas, e os do PVAT não foram bem caracterizados. Em um estudo recente, relatamos que alguns ADSCs no tecido adiposo do arco periártico (PAAT) descendem das células da crista neural (NCCs), uma população passageira de células migratórias originárias do ectoderm.

Neste artigo, descrevemos um protocolo para isolar AS NCCs vermelhas fluorescentes (RFP) rotuladas pelo PAAT do Wnt-1 Cre^+/-; Rosa26^RFP/+ camundongos e indução de sua diferenciação adipogênica in vitro. Resumidamente, a fração vascular estromal (SVF) é enzimáticamente dissociada do PAAT, e os ADSCs derivados da crista neural RFP⁺ neural (NCADSCs) são isolados pela classificação celular ativada por fluorescência (FACS). Os NCADSCs se diferenciam tanto em adipócitos marrons quanto brancos, podem ser crioreservadoss e manter seu potencial adipogênico para ~3-5 passagens. Nosso protocolo pode gerar ADSCs abundantes a partir do PVAT para modelar adipogênese PVAT ou lipogênese in vitro. Assim, esses NCADSCs podem fornecer um sistema valioso para estudar os interruptores moleculares envolvidos na diferenciação de PVAT.

Introdução

A prevalência de obesidade está aumentando em todo o mundo, o que aumenta o risco de doenças crônicas relacionadas, incluindo doenças cardiovasculares e diabetes¹. PvAT envolve vasos sanguíneos e é uma das principais fontes de fatores endócrinos e paracrinos envolvidos na função vasculatura. Estudos clínicos mostram que o alto teor de PVAT é um fator de risco independente de doenças cardiovasculares^2,3, e sua função patológica depende do fenótipo das células-tronco derivadas de adiposos constituintes (ADSCs)⁴.

Embora linhas celulares ADSC como a murina 3T3-L1, 3T3-F442A e OP9 sejam modelos celulares úteis para estudar adipogênese ou lipogênese^5,os mecanismos regulatórios para adipogênese diferem entre linhas celulares e células primárias. Os ADSCs na fração de célulavascular estrônita (SVF) isolaram-se diretamente dos tecidos adippose e induzidos a diferenciar em adipócitos provavelmente recapitulando na adipogênese vivo e lipogênese⁶. No entanto, a fragilidade, a flutuação e as variações de tamanho e imunofenótipos dos ADSCs tornam seu isolamento direto desafiador. Além disso, os diferentes procedimentos de isolamento também podem afetar significativamente a capacidade potencial fenótipo e adipogênica dessas células^7,enfatizando assim a necessidade de um protocolo que mantenha a integridade do ADSC.

O tecido adiposo é tipicamente classificado como o tecido adiposo branco morfologicamente e funcionalmente distinto (WAT), ou o tecido adiposo marrom (BAT)⁸, que abriga ADSCs distintos⁹. Embora as ADSCs isoladas de WATs subcutâneos e subcutâneos foram caracterizadas em estudos anteriores^9,10,11,12, menos se sabe em relação aos ADSCs da PVAT que é composto principalmente por BAT¹³.

Em um estudo recente, descobrimos que uma parte dos ADSCs residentes no tecido adiposo do arco periártico (PAAT) são derivados de células de crista neural (NCCs), uma população transitória de células progenitoras migratórias que se originam do ectoderm^14,15. Os camundongos transgênicos Wnt1-Cre foram usados para rastrear o desenvolvimento de células de crista neural^16,17. Cruzamos os mouses Wnt1-Cre⁺ com ratos Rosa26^RFP/+ para gerar O Cre Wnt-1^+/-; Os camundongos Rosa26^RFP/+, nos quais as NCCs e seus descendentes são rotulados com proteína fluorescente vermelha (RFP) e são facilmente rastreados in vivo e in vitro¹⁵. Aqui, descrevemos um método para isolar adsCs derivados da crista neural (ADSCs derivados de NC, ou NCADSCs) do PAAT do mouse e induzir os NCADSCs a diferenciar em adipócitos brancos ou adipócitos marrons.

Protocolo

O protocolo animal foi revisto e aprovado pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Xangai Jiao Tong.

1. Geração de Wnt-1 Cre^+/-; Ratos Rosa26^RFP/+

1. Cross Wnt-1 Cre^+/- mouses¹⁶ com rosnado Rosa26^{RFP/+ 18} para gerar Wnt-1 Cre^+/-; Rostou rosa26^RFP/+. Ratos domésticos um ciclo claro/escuro de 12h em uma instalação livre de patógenos a 25 °C e 45% de umidade até que tenham de 4 a 8 semanas de idade.

2. Dissecação do PAAT

NOTA: Veja a Figura 1.

1. Esterilizar todas as ferramentas cirúrgicas (por exemplo, tesoura cirúrgica, fórceps padrão e tesouras e fórceps microcirúrgicos) por autoclaving a 121 °C por 30 min.
2. Prepare o meio de digestão (High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium [HDMEM] contendo 2 mg/mL colagenase tipo I). Prepare o meio cultural (HDMEM contendo 10% de soro bovino fetal [FBS] e 1% v/v penicilina-estreptomicina [PS]). Esterilizar usando um filtro de seringa de 0,22 μm antes de usar.
3. Esterilizar os reagentes da cultura celular usando UV, etanol, filtração ou vapor, conforme apropriado.
4. Prepare uma placa de Petri com a Solução Salina Balanceada (HBSS) de Hanks e um tubo cônico de 15 mL com 10 mL de HBSS complementado com 1% v/v de solução PS. Mantenha os dois no gelo.
5. Anestesiar os camundongos¹⁵ com isoflurano e sacrifício por luxação cervical. Mergulhe os corpos em um béquer cheio de 75% de álcool (200 mL) por 5 min para esterilizar a superfície da pele.
6. Corte e separe a pele no abdômen e corte ao longo da linha média ventral da pélvis para o pescoço. Abra o abdômen e mova o fígado para expor o diafragma¹⁹.
7. Corte o diafragma e as costelas em ambos os lados da linha média e exponha o coração e os pulmões descascando as costelas.
8. Remova o pulmão e o timo e extrai o PAAT junto com a aorta e o coração.
9. Corte a aorta na raiz aórtica para remover o coração. Faça um corte entre o arco aórtico e a aorta descendente e separe cuidadosamente o tecido adiposo ao redor de ambas as estruturas e as artérias carótidas comuns da esquerda e direita da parede torácica posterior. Transfira o tecido para o tampão HBSS gelado na placa de Petri.
10. Usando fórceps estéreis, remova o máximo da vasculatura (por exemplo, aorta, artérias carótidas comuns e outras vasculaturas pequenas) e fáscia possível, e transfira o tecido adiposo para os tubos Eppendorf de 2 mL contêm 0,5 mL tampão HBSS frio no gelo.

3. Isolamento do SVF

Colete o PAAT de 5-6 camundongos em um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo 1 mL recém-preparado meio de digestão e picar o tecido usando tesoura cirúrgica em um tubo Eppendorf à temperatura ambiente (RT).

1. Transfira o mix para tubos de 50 mL contendo 9 mL do meio de digestão. Homogeneize os tecidos canalizando para cima e para baixo com uma pipeta de 1 mL 10x.
2. Incubar os tubos a 37 °C com constante oscilação a 100 rpm por 30-45 min e verificar a cada 5-10 min para evitar a sobredigestão. Isso é fundamental para melhorar a viabilidade celular e o rendimento.
   NOTA: Uma boa digestão tecidual resultará em um tecido adiposo amarelo claro homogêneo que é visível a olho nu ao girar suavemente o tubo.
3. Pare a digestão adicionando 5 mL de HDMEM contendo 10% de FBS e 1% v/v PS na RT e misture bem com tubos.
4. Centrífuga a suspensão celular a 500 x g por 5 min na RT. O SVF será visível como uma pelota marrom. Cuidadosamente aspirar os adipócitos flutuantes e decantar o supernatante restante sem perturbar o SVF. Dissolva a pelota SVF em 10 mL de meio cultural e filtre através de um filtro de células de 70 μm.
5. Centrífuga a suspensão celular a 500 x g por 5 min, remova o supernatant e suspenda suavemente a pelota em 5 mL de tampão de lise eritropócito em um tubo cônico de 15 mL por 10 min na RT.
6. Pare a reação adicionando 10 mL de 1x PBS contendo 1% de FBS. Centrífuga a suspensão celular a 500 x g por 5 min a 4 °C, remova o supernatante e resuspenda a pelota em 10 mL de 1x PBS contendo 1% de FBS.
7. Centrífuga simê as células novamente a 500 x g por 5 min a 4 °C. Remova o supernatant e resuspenda a pelota em 5 mL de cultura média em um tubo conical de 15 mL a 4 °C.
8. Após uma rodada final de centrífuga (500 x g por 5 min a 4 °C), resuspender as células pelleted em 5 mL de tampão FACS (PBS contendo 10% FBS, 100 unidades/mL DNA I, e 1% v/v PS) no gelo, e contar as células com hemocilômetro.

4. Isolamento de NCADSCs por FACS

1. Configure e otimize o aparelho celular seguindo o manual de instruções. Selecione o bico de 100 μm, esterilize os tubos de coleta, instale o dispositivo de coleta necessário e configure os fluxos laterais²⁰.
2. Recomenda-se um laser amarelo/verde de 561 nm e filtro óptico 579/16 para triagem de células RFP^+. Realize a compensação usando o controle negativo e os controles positivos manchados únicos. Veja a Figura 2A para o esquema de gating.
3. Filtrar as células através de um filtro de 40 μm, centrífuga em 500 x g por 5 min, e resuspender as células em 2 mL de tampão FACS a uma densidade de 0,5-1 x 10⁷/mL. Transfira as células para tubos de poliestireno traseiro redondo de 5 mL claramente rotulados e carregue para o sorter.
4. Execute o tubo amostral experimental a 4 °C, ligue as placas de deflexão e classifique em um tubo cônico de 15 mL pré-revestido com RPMI contendo 1% fbs e 1% v/v PS.
   NOTA: Proteja as amostras de luz forte para minimizar o saque rfp.

5. Cultura dos NCADSCs

1. Coloque as células classificadas a uma densidade de 5.000 células/cm² em uma placa de cultura de 12 poços em meio de cultura completa e incuba a 37 °C em uma atmosfera úmida com 5% de CO₂ para 20-24 h.
2. Remova o meio de cultura, lave as células com PBS pré-aquecidos (37 °C) para remover detritos celulares e adicionar meio de cultura fresca.
3. Uma vez que as células são de 80 a 90% de confluentes, digerir a monocamada usando uma solução EDTA de tentação de 0,25% a 37 °C em uma incubadora por 3-5 min, e neutralize com 2 mL de meio cultural.
4. Centrífuga sem células colhidas por 15 min a 250 x g na RT, remova o supernatante e resuspenda as células em 1 mL de meio cultural. Conte as células com um hemocímetro.
5. Sementes as células em uma placa de cultura de 12 poços na densidade de 5.000 células/cm².
6. Resuspender as células remanescentes em meio cultural contendo 10% de DMSO, congelar e armazenar nitrogênio líquido.

6. Indução adipogênica de NCADSCs

1. Induzir diferenciação adipogênica dos NCADSCs em 80-90% de confluência e condições culturais padrão²¹.
2. Para indução adipogênica marrom, primeiro trate as células cultivadas com meio de indução adipogênica marrom (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 mM/L IBMX, 0,1μM/L dexamethasona, 1 μM/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine e 1 μg/mL insulina) para 2 dias. Lave as células com PBS 2x e substitua por meio fresco (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 1 μM/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodotilina e 1 μg/mL insulina). Troque esse meio a cada 2 dias para um total de 3-5x.
3. Para indução adipogênica branca, primeiro trate as células com meio de indução adipogênica branca (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 mM/L IBMX, 0,1 μM/L dexametasona e 1 μg/mL insulina) por 2 dias. Lave as células com PBS 2x e substitua por meio fresco (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS e 1 μg/mL insulina). Troque esse meio a cada 2 dias para um total de 3-5x.
4. Analise as células adipogênicas conforme apropriado.
   NOTA: Seja gentil ao lavar as células com PBS. Adipócitos diferenciados podem facilmente lavar.

Resultados

Usando o protocolo descrito acima, obtivemos ~0,5-1.0 x 10⁶ ADSCs de 5-6 Wnt-1 Cre^+/-; Rostou rosa26^RFP/+ (48 semanas, homem ou mulher).

O fluxo grama de coleta de PAAT de camundongos é apresentado na Figura 1. A morfologia dos NCADSCs era semelhante ao ADSC de outros tecidos adiposos de camundongos. As NCADSCs cultivadas atingiram 80-90% de confluência após 7-8 dias de cultura, e os NCADSCs tiveram uma morfologia expandida seme...

Discussão

Neste estudo, apresentamos um método confiável para o isolamento, cultura e indução adipogênica de NCADSCs extraídos do PVAT do Wnt-1 Cre^+/-; Rosa26^RFP/+ camundongos transgênicos projetados para produzir RFP⁺ ADSCs. Relatórios anteriores mostram que não há diferença significativa na expressão de marcadores de células-tronco mesenquinais multipotentes gerais (MSCs) em NCADSCs e não NCADSCs²², e que os NCADSCs têm um forte potencial para diferenciar em...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA	BBI life sciences	E672002-0500	Lot #: EC11FA0001
Agarose	ABCONE (China)	A47902	1% working concentration
Anti-cebp/α	ABclonal	A0904	1:1000 working concentration
Anti-mouse IgG, HRP-linked	CST	7076	1:5000 working concentration
Anti-perilipin	Abcam	AB61682	1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54
Anti-PPARy	SANTA CRUZ	sc-7273	0.2 μg/mL working concentration
Anti-rabbit IgG, HRP-linked	CST	7074	1:5000 working concentration
Anti-β-Tubulin	CST	2146	1:1000 working concentration
BSA	VWR life sciences	0332-100G	50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008
Collagenase, Type I	Gibco	17018029
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902	0.1 µM working concentration
Erythrocyte Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333
FBS	Corning	R35-076-CV	50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS
HBSS	Gibco	14025092
HDMEM	Gelifesciences	SH30243.01	Lot #: AD20813268
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM working concentration
Insulin	Sigma-Aldrich	I3536	1 μg/mL working concentration
Microsurgical forceps	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-F201A-1
Microsurgical scissor	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-H121A
Oil Red O solution	Sigma-Aldrich	O1516	0.3% working concentration
PBS (Phosphate buffered saline)	ABCONE (China)	P41970
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
PrimeScript RT reagent Kit	TAKARA	RR047A	Lot #: AK4802
RNeasy kit	TAKARA	9767	Lot #: AHF1991D
Rosa26RFP/+ mice	JAX	No.007909	C57BL/6 backgroud; male and female
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM working concentration
Standard forceps	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-F424
Surgical scissor	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-S231
SYBR Premix Ex Taq	TAKARA	RR420A	Lot #: AK9003
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2877	10 nM working concentration
Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice	JAX	No.009107	C57BL/6 backgroud; male and female