Isolation, Kultur und adipogene Induktion von Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll zur Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von neuronalen Kamm abgeleiteten Adipose-abgeleiteten Stammzellen (NCADSCs) aus dem periaortischen Fettgewebe von Wnt-1 Cre^+/-; Rosa26^RFP/+ Mäuse. Die NCADSCs können eine leicht zugängliche Quelle von ADSCs zur Modellierung von Adipogenese oder Lipogenese in vitro sein.

Zusammenfassung

Eine übermäßige Menge an Fettgewebe, das die Blutgefäße umgibt (perivaskuläres Fettgewebe, auch bekannt als PVAT), ist mit einem hohen Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen verbunden. ADSCs, die aus verschiedenen Fettgeweben gewonnen wurden, weisen unterschiedliche Merkmale auf, und die von der PVAT sind nicht gut charakterisiert. In einer aktuellen Studie berichteten wir, dass einige ADSCs im periaortischen Bogenfettgewebe (PAAT) von den neuralen Kammzellen (NCCs) abstammen, einer vorübergehenden Population von Zugzellen, die aus dem Ektoderm stammen.

In diesem Beitrag beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von rotem fluoreszierendem Protein (RFP)-markierten NCCs aus dem PAAT von Wnt-1 Cre^+/-; Rosa26^RFP/+ Mäuse und induzieren ihre adipogene Differenzierung in vitro. Kurz gesagt, die stromale Gefäßfraktion (SVF) wird enzymatisch vom PAAT getrennt, und die rFP⁺ neuronalen Kamm abgeleiteten ADSCs (NCADSCs) werden durch fluoreszaktivierte Zellsortierung (FACS) isoliert. Die NCADSCs unterscheiden sich sowohl in braune als auch in weiße Adipozyten, können kryokonserviert werden und behalten ihr adipogenes Potenzial für 3–5 Passagen. Unser Protokoll kann reichlich ADSCs aus dem PVAT zur Modellierung der PVAT-Adipogenese oder Lipogenese in vitro generieren. Somit können diese NCADSCs ein wertvolles System zur Untersuchung der molekularen Schalter bieten, die an der PVAT-Differenzierung beteiligt sind.

Einleitung

Die Prävalenz von Adipositas nimmt weltweit zu, was das Risiko für verwandte chronische Krankheiten, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Diabetes¹erhöht. PVAT umgibt Blutgefäße und ist eine wichtige Quelle für endokrine und parakrine Faktoren, die an der Vaskulaturfunktion beteiligt sind. Klinische Studien zeigen, dass ein hoher PVAT-Gehalt ein unabhängiger Risikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen^{ist 2,3}, und seine pathologische Funktion hängt vom Phänotyp der konstituierenden adipose-abgeleiteten Stammzellen (ADSCs)⁴ab.

Obwohl ADSC-Zelllinien wie die murinen 3T3-L1, 3T3-F442A und OP9 nützliche zelluläre Modelle sind, um Adipogenese oder Lipogenese⁵zu untersuchen, unterscheiden sich die regulatorischen Mechanismen für die Adipogenese zwischen Zelllinien und Primärzellen. Die ADSCs in der stromalen Vaskulären Zellfraktion (SVF) isoliert direkt aus Fettgewebeund und induziert, um in Adipozyten zu differenzieren höchstwahrscheinlich rekapitulieren in vivo Adipogenese und Lipogenese⁶. Die Fragilität, der Auftrieb und die Größenunterschiede und Immunphenotypen der ADSCs machen ihre direkte Isolation jedoch schwierig. Darüber hinaus können die verschiedenen Isolationsverfahren auch den Phänotyp und die adipogene Potenzialfähigkeit dieser Zellen⁷erheblich beeinflussen, wodurch die Notwendigkeit eines Protokolls betont wird, das die ADSC-Integrität beibehält.

Adipose-Gewebe wird in der Regel entweder als das morphologisch und funktionell ausgeprägte weiße Fettgewebe (WAT) oder das braune Fettgewebe (BAT)⁸klassifiziert, das unterschiedliche ADSCs⁹beherbergt. Während ADSCs, die aus perigonadalen und leistensubkutanen WATs isoliert sind, in früheren Studien^9,10,11,12gekennzeichnet wurden, ist weniger in Bezug auf die ADSCs aus PVAT bekannt, die hauptsächlich aus BAT¹³bestehen.

In einer aktuellen Studie fanden wir heraus, dass ein Teil der gebietsansässigen ADSCs im periaortischen Arch-Fettgewebe (PAAT) aus neuronalen Kammzellen (NCCs) abgeleitet wird, einer vorübergehenden Population von wandernden Vorläuferzellen, die aus dem Ektoderm^14,15stammen. Wnt1-Cre transgene Mäuse wurden zur Verfolgung der Entwicklung von neuronalen Kammzellen^16,17verwendet. Wir kreuzten Wnt1-Cre⁺ Mäuse mit Rosa26^RFP/+ Mäusen, um Wnt-1 Cre^+/-zu erzeugen; Rosa26^RFP/+ Mäuse, bei denen NCCs und ihre Nachkommen mit rotem fluoreszierendem Protein (RFP) gekennzeichnet sind und leicht in vivo und in vitro¹⁵nachverfolgt werden können. Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung von neuronalen Kamm abgeleiteten ADSCs (NC-abgeleitete ADSCs oder NCADSCs) von Maus-PAAT und induzieren die NCADSCs, sich in weiße Adipozyten oder braune Adipozyten zu differenzieren.

Protokoll

Das Tierprotokoll wurde vom Animal Care Committee der Shanghai Jiao Tong University überprüft und genehmigt.

1. Erzeugung von Wnt-1 Cre^+/-; Rosa26^RFP/+ Mäuse

1. Kreuz Wnt-1 Cre^+/- Mäuse¹⁶ mit Rosa26^RFP/+ Mäuse^18, um Wnt-1 Cre zu erzeugen^+/-; Rosa26^RFP/+ Mäuse. Hausmäuse unter einem 12 h Licht/Dunkel-Zyklus in einer pathogenfreien Anlage bei 25 °C und 45% Luftfeuchtigkeit, bis sie 4–8 Wochen alt sind.

2. Zerlegung der PAAT

HINWEIS: Siehe Abbildung 1.

1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge (z. B. chirurgische Schere, Standardzange und mikrochirurgische Schere und Zange) durch Autoklavieren bei 121 °C für 30 min.
2. Bereiten Sie das Verdauungsmedium vor (High Glucose Dulbecco es Modified Eagle Medium [HDMEM] mit 2 mg/ml Kollagennase Typ I). Bereiten Sie das Kulturmedium vor (HDMEM enthält 10% fetales Rinderserum [FBS] und 1% v/v Penicillin-Streptomycin [PS]). Sterilisieren Sie vor Gebrauch mit einem 0,22 m Spritzenfilter.
3. Sterilisieren Sie die Zellkulturreagenzien gegebenenfalls mit UV, Ethanol, Filtration oder Dampf.
4. Bereiten Sie eine Petrischale mit Hanks' Balanced Saline Solution (HBSS) und ein 15 ml kegelförmiges Rohr mit 10 ml HBSS, ergänzt mit 1% v/v PS-Lösung, vor. Halten Sie beide auf Eis.
5. Anästhetisieren Sie die Mäuse¹⁵ mit Isofluran und Opfer durch zervikale Dislokation. Tauchen Sie die Körper in einen Becher gefüllt mit 75% Alkohol (200 ml) für 5 min, um die Hautoberfläche zu sterilisieren.
6. Schnippen und trennen Sie die Haut auf dem Bauch und schneiden Sie entlang der ventralen Mittellinie vom Becken bis zum Hals. Öffnen Sie den Bauch und bewegen Sie die Leber, um das Zwerchfell¹⁹auszusetzen.
7. Schneiden Sie das Zwerchfell und die Rippen auf beiden Seiten der Mittellinie und belichten Sie das Herz und die Lunge, indem Sie die Rippen zurückschälen.
8. Entfernen Sie die Lunge und Thymus und extrahieren Sie die PAAT zusammen mit der Aorta und Herz.
9. Schneiden Sie die Aorta an der Aortenwurzel ab, um das Herz zu entfernen. Machen Sie einen Schnitt zwischen dem Aortenbogen und absteigenden Aorta und trennen Sie sorgfältig das Fettgewebe, das beide Strukturen und die linken und rechten gemeinsamen Karotisarterien von der hinteren Brustwand umgibt. Übertragen Sie das Gewebe in den eiskalten HBSS-Puffer in der Petrischale.
10. Mit sterilen Zangen möglichst viel von der Gefäßisation (z.B. Aorta, gemeine Karotisarterien und andere kleine Gefäße) und Faszien entfernen und das Fettgewebe in die 2 mL Eppendorf-Röhren übertragen, die 0,5 ml eiskalten HBSS-Puffer auf Eis enthalten.

3. Isolierung des SVF

Sammeln Sie das PAAT von 5-6 Mäusen in einem 2 ml Mikrozentrifugenrohr mit 1 ml frisch zubereitetem Verdauungsmedium und zerkleinern Sie das Gewebe mit einer chirurgischen Schere in einem Eppendorfer Rohr bei Raumtemperatur (RT).

1. Die Mischung in 50 ml-Rohre mit 9 ml des Verdauungsmediums übertragen. Homogenisieren Sie das Gewebe, indem Sie mit einer 1 ml Pipette 10x nach oben und unten pfeifen.
2. Inkubieren Sie die Rohre bei 37 °C mit konstantem Schütteln bei 100 U/min für 30–45 min und überprüfen Sie alle 5–10 min, um eine Überverdauung zu verhindern. Dies ist entscheidend für die Verbesserung der Zelllebensfähigkeit und Ausbeute.
   HINWEIS: Eine gute Gewebeverdauung führt zu einem homogenen, hellgelben Fettgewebe, das mit bloßem Auge sichtbar ist, wenn das Rohr sanft gewirbelt wird.
3. Beenden Sie die Verdauung, indem Sie 5 ml HDMEM mit 10% FBS und 1% v/v PS bei RT hinzufügen und durch Pipettieren gut mischen.
4. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 x g für 5 min bei RT. Der SVF wird als bräunliches Pellet sichtbar sein. Sorgsam die schwimmenden Adipozyten ansaugen und den restlichen Überstand dekantieren, ohne den SVF zu stören. Lösen Sie das SVF-Pellet in 10 ml Kulturmedium auf und filtern Sie es durch ein 70 m Zellsieb.
5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 x g für 5 min, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 5 ml Erythrozytenlysepuffer in einem 15 ml konischen Rohr für 10 min bei RT sanft wieder auf.
6. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 10 ml 1x PBS hinzufügen, die 1% FBS enthalten. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 x g für 5 min bei 4 °C, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 10 ml 1x PBS mit 1% FBS wieder auf.
7. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C wieder. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 5 ml Kulturmedium in einem 15 ml konischen Rohr bei 4 °C wieder auf.
8. Nach einer letzten Zentrifugationsrunde (500 x g für 5 min bei 4 °C) die pelletierten Zellen in 5 ml FACS-Puffer (PBS mit 10% FBS, 100 Einheiten/ml DNA I und 1% v/v PS) auf Eis wieder aufesetzen und die Zellen mit einem Hämozytometer zählen.

4. Isolierung von NCADSCs durch FACS

1. Richten Sie den Zellensortierer gemäß der Bedienungsanleitung ein und optimieren Sie ihn. Wählen Sie die 100-mm-Düse, sterilisieren Sie die Sammelrohre, installieren Sie das erforderliche Sammelgerät und richten Sie die Seitenströme²⁰ein.
2. Zum Sortieren von RFP⁺ Zellen werden ein 561 nm gelb/grüner Laser und ein optischer Filter 579/16 empfohlen. Führen Sie die Kompensation mit der Negativsteuerung und den eingefärbten Positivsteuerungen aus. Siehe Abbildung 2A für das Gating-Schema.
3. Filtern Sie die Zellen durch ein 40-m-Sieb, Zentrifuge bei 500 x g für 5 min, und suspendieren Sie die Zellen in 2 ml FACS-Puffer mit einer Dichte von 0,5–1 x 10⁷/ml. Übertragen Sie die Zellen auf klar beschriftete 5 ml runde untere Polystyrolröhren und laden Sie sie in den Sortierer.
4. Führen Sie das versuchsweise Probenrohr bei 4 °C aus, schalten Sie die Umlenkplatten ein und sortieren Sie es in ein 15 ml konisches Rohr, das mit RPMI vorbeschichtet ist und 1% FBS und 1% v/v PS enthält.
   HINWEIS: Schützen Sie die Proben vor starkem Licht, um das Ablöschen von RFP zu minimieren.

5. Kultur der NCADSCs

1. Die sortierten Zellen mit einer Dichte von 5.000^Zellen/cm2 in einer 12 Brunnenkulturplatte in einem kompletten Kulturmedium aufsieben und bei 37 °C in feuchter Atmosphäre mit 5%_CO2 für 20–24 h inkubieren.
2. Entfernen Sie das Kulturmedium, waschen Sie die Zellen mit vorgewärmten (37 °C) PBS, um Zellablagerungen zu entfernen und frisches Kulturmedium hinzuzufügen.
3. Sobald die Zellen 80–90% konfluent sind, verdauen Sie die Monoschicht mit einer 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung bei 37 °C in einem Inkubator für 3–5 min und neutralisieren sie mit 2 ml Kulturmedium.
4. Zentrifugieren Sie die geernteten Zellen für 15 min bei 250 x g bei RT, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 1 ml Kulturmedium wieder aus. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
5. Säen Sie die Zellen in einer 12 Brunnenkulturplatte mit einer Dichte von 5.000 Zellen/cm².
6. Die verbleibenden Zellen im Kulturmedium, die 10% DMSO enthalten, wieder aufhängen und in flüssigem Stickstoff lagern.

6. Adipogene Induktion von NCADSCs

1. Induzieren Sie adipogene Differenzierung der NCADSCs bei 80–90% Konfluenz und Standardkulturbedingungen²¹.
2. Bei brauner adipogenic Induktion werden zunächst die kultivierten Zellen mit braunem adipogenem Induktionsmedium (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 mM/L IBMX, 0,1 m/L Dexamethason, 1 M/L Rosiglitazon, 10 nmol/L Triiodothyronin und 1 g/ml Insulin) für 2 Tage behandelt. Waschen Sie die Zellen mit PBS 2x und ersetzen Sie sie durch frisches Medium (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 1 M/L Rosiglitazon, 10 nmol/L Triiodothyronin und 1 g/ml Insulin). Ändern Sie dieses Medium alle 2 Tage für insgesamt 3–5x.
3. Bei weißer adipogenic Induktion behandeln Sie zunächst die Zellen mit weißem adipogenem Induktionsmedium (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 mM/L IBMX, 0,1 M/L Dexamethason und 1 g/ml Insulin) für 2 Tage. Waschen Sie die Zellen mit PBS 2x und ersetzen Sie sie durch frisches Medium (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS und 1 g/ml Insulin). Ändern Sie dieses Medium alle 2 Tage für insgesamt 3-5x.
4. Analysieren Sie die adipogenen Zellen je nach Bedarf.
   HINWEIS: Seien Sie sanft beim Waschen der Zellen mit PBS. Differenzierte Adipozyten können leicht weggewaschen werden.

Ergebnisse

Mit dem oben beschriebenen Protokoll erhielten wir 0,5–1,0 x 10⁶ ADSCs von 5–6 Wnt-1 Cre^+/-; Rosa26^RFP/+ Mäuse (48 Wochen alt, männlich oder weiblich).

Das Flussdiagramm der SAMMLUNG von PAAT von Mäusen ist in Abbildung 1dargestellt. Die Morphologie der NCADSCs ähnelte dem ADSC von anderen Mäusen Fettgewebe. Die kultivierten NCADSCs erreichten nach 7–8 Tagen Kultur 80–90 % Konfluenz, und die NCADSCs hatten eine erweite...

Diskussion

In dieser Studie stellen wir eine zuverlässige Methode für die Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von NCADSCs dar, die aus dem PVAT von Wnt-1 Cre^+/-extrahiert wurden. Rosa26^RFP/+ transgene Mäuse zur Herstellung von RFP⁺ ADSCs. Frühere Berichte zeigen, dass es keinen signifikanten Unterschied in der Expression von allgemeinen multipotenten mesenchymalen Stammzellen (MSCs) Markern in NCADSCs und Nicht-NCADSCs²²gibt und dass NCADSCs ein starkes Potenzial h...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA	BBI life sciences	E672002-0500	Lot #: EC11FA0001
Agarose	ABCONE (China)	A47902	1% working concentration
Anti-cebp/α	ABclonal	A0904	1:1000 working concentration
Anti-mouse IgG, HRP-linked	CST	7076	1:5000 working concentration
Anti-perilipin	Abcam	AB61682	1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54
Anti-PPARy	SANTA CRUZ	sc-7273	0.2 μg/mL working concentration
Anti-rabbit IgG, HRP-linked	CST	7074	1:5000 working concentration
Anti-β-Tubulin	CST	2146	1:1000 working concentration
BSA	VWR life sciences	0332-100G	50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008
Collagenase, Type I	Gibco	17018029
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902	0.1 µM working concentration
Erythrocyte Lysis Buffer	Invitrogen	00-4333
FBS	Corning	R35-076-CV	50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS
HBSS	Gibco	14025092
HDMEM	Gelifesciences	SH30243.01	Lot #: AD20813268
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	0.5 mM working concentration
Insulin	Sigma-Aldrich	I3536	1 μg/mL working concentration
Microsurgical forceps	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-F201A-1
Microsurgical scissor	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-H121A
Oil Red O solution	Sigma-Aldrich	O1516	0.3% working concentration
PBS (Phosphate buffered saline)	ABCONE (China)	P41970
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
PrimeScript RT reagent Kit	TAKARA	RR047A	Lot #: AK4802
RNeasy kit	TAKARA	9767	Lot #: AHF1991D
Rosa26RFP/+ mice	JAX	No.007909	C57BL/6 backgroud; male and female
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408	1 μM working concentration
Standard forceps	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-F424
Surgical scissor	Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China)	MR-S231
SYBR Premix Ex Taq	TAKARA	RR420A	Lot #: AK9003
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2877	10 nM working concentration
Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice	JAX	No.009107	C57BL/6 backgroud; male and female