JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ההליך עבור הנחת פרוסות לב של האדם לניסויים פרה-קליניים ופרטים השימוש במיפוי אופטי עבור הקלטת מתח טרנסממברניות ואותות סידן תאיים בו מפרוסות אלה.

Abstract

ההכנות לחיתוך לב האדם פותחו לאחרונה כפלטפורמה לחקר הפיזיולוגיה האנושית ובדיקות תרפיה לגשר על הפער בין בעלי חיים לניסויים קליניים. מודלים רבים של בעלי חיים ותאים שימשו כדי לבחון את ההשפעות של תרופות, אך תגובות אלה שונות לעתים קרובות אצל בני אדם. פרוסות לב אנושיות מציעות יתרון לבדיקת סמים בכך שהן נגזרות ישירות מלבבות אנושיים מעשי. בנוסף לשימור מבנים בעלי מבנה רב-תאי, צימוד תאים תאים וסביבות מטריצה ממסיביות, ניתן להשתמש בפרוסות של רקמת לב אנושית כדי לבדוק ישירות את ההשפעה של תרופות אין-ספור על פיזיולוגיה של לב האדם המבוגר. מה שמבדיל מודל זה מהכנות לב אחרות, כגון לבבות שלמים או פרוסות, היא שפרוסות יכולות להיות נתונים לתרבות ארוכת טווח. ככאלה, פרוסות לב מאפשרות ללמוד את ההשפעות החריפות והכרוניות של סמים. יתר על כן, היכולת לאסוף כמה מאות לאלף פרוסות מלב אחד הופך את זה מודל תפוקה גבוהה כדי לבדוק כמה תרופות בריכוזים שונים ושילובים עם סמים אחרים באותו זמן. פרוסות יכולות להיות מוכנות מכל אזור נתון בלב. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את ההכנה של פרוסות חדרית שמאלי על ידי בידוד קוביות רקמות מהקיר השמאלי של המוח החופשי ולהכניס אותם לפרוסות באמצעות מיקרו הרטט מדויק בדיוק גבוה. פרוסות אלה יכול להיות נתון לניסויים חריפים כדי למדוד פונקציה בסיסית אלקטרופיסיולוגית לב או תרבותי עבור לימודי סמים כרוניים. פרוטוקול זה מתאר גם מיפוי אופטי כפול של פרוסות לב עבור הקלטות בו זמנית של פוטנציאלים טרנסממברניים ודינמיקה סידן תאיים כדי לקבוע את ההשפעות של התרופות נחקר.

Introduction

דגמי בעלי חיים היו כלי רב ערך המשמש להבנת המנגנונים הבסיסיים של הפיזיולוגיה האנושית והפתופסולוגיה, כמו גם פלטפורמה לבדיקה ראשונית של טיפולים לטיפול במחלות שונות1. צעדים גדולים נלקחו בתחום המחקר הביו-רפואי המבוסס על לימודי בעלי חיים אלה2. עם זאת, הבדלים משמעותיים בין המינים קיימים בין הפיזיווגיות אנושיות ובעלי חיים, כולל עכברים, חולדות, שרקנים, ארנבים, כבשים, חזירים וכלבים3,4. כתוצאה מכך, היו הרבה תרופות, גנים, וטיפולים סלולריים שהראה הבטחה במהלך השלב בדיקות בעלי חיים, אך נכשל לחיות עד התוצאות בניסויים קליניים5. כדי לגשר על פער זה, לב מבודד מאוציטים ותאי גזע המושרה האדם pluriפוטנטי (iPSCs) פותחו כמודלים כדי לבדוק את התגובה של הפיזיולוגיה האנושית לתרופות ומחלות שונות6. תאי גזע מבוססי לב נגזר בשימוש נרחב במערכות עוגב-על-שבב כפונדקאית של הלב6,7,8. עם זאת, השימושיות של הקרדיוציטים הנגזרות (iPSC-CMs) מופרעת על ידי הפנוטיפים הילדותיים שלהם וחוסר ייצוג של אוכלוסיית הקרדיוומיציט; שריר הלב בוגרת הוא מבנה מורכב מורכב מספר סוגים של תאים הקיימים כגון פיברותקיעות, נוירונים, מקרופאגים, ותאי אנדותל. מצד שני, הקרדיוציטים האנושיים הבודדים הם בוגרים בחשמל, ואוכלוסיות שונות של הקרדיוציט ניתן להשיג על ידי שינוי פרמטרים של culturing9. עדיין, אלה מיוציטים בדרך כלל התערוכה משתנה פוטנציאל פעולה מורפולוגיות בשל העדר צימוד תא תא, מהיר בידול, והתרחשות של התנהגות proפרעות בחוץ מתורבת10,11. חלק מההגבלות טופלו על ידי מודלים של תרבות התא 3D של iPSC-CMs ומיציטים הלב. מודלים אלה, הכוללים spheroids, פיגום הידרוג'ל שעברו תרבויות תלת-ממד, מהונדסים רקמות לב (EHTs), ומערכות לב-על-שבב, להשתמש באוכלוסיות מרובות תאי לב כגון קרדיוטיציטים, פיברוטיטים ותאי אנדותל. הם או להרכיב או להרכיב לאורך פיגום ליצירת מבנים תלת ממדיים, וחלקם אפילו לשכפל את הטבע אניסוטרופי המורכב של שריר הלב. מודלים אלה דווחו להיות בעלי תאים של פנוטיפים בוגרים, מאפיינים כוללים, ופרופילים מולקולריים דומה לרקמת לב. מערכת הלב-על-שבב גם מאפשרת את המחקר של השפעות מערכתיות בבדיקות סמים ומחלות מודלים. עם זאת, במודלים מחוץ לגוף מתורבת חסר מטריצה החילוץ הילידים ולכן לא ניתן לחקות במדויק את האיברים האלקטרופיזיולוגיה ברמה האיבר. פרוסות לב של האדם, לעומת זאת, יש מטריצה ללא פגע ומקורי הקשר תא אל התא, מה שהופך אותם שימושיים לבדיקה מדויקת יותר של התכונות הקצב של שריר הלב האנושי.

חוקרים פיתחו פרוסות לב אנושי אורגנוטיפקס כפלטפורמה פיסיוקלינית פיזיולוגית עבור בדיקות תרופות חריפה וכרוניות וללמוד אלקטרופיזיולוגיה לב ומחלות לב התקדמות12,13,14,15,16,17,18,19. בהשוואה לקרדיוציטים הנגזרות iPSC, פרוסות לב האדם בנאמנות לשכפל בצורה מבוגרת אלקטרופיזיולוגיה לב האדם עם מתקן קרדיולוגי בוגר. כאשר בהשוואה לקרדיוציטים אנושיים בודדים, פרוסות לב התערוכה משכי הפוטנציאל של פעולה פיזיולוגית בגלל צימוד התא התא השתמר היטב את הקיום הפנימי של סביבות הפנים והמוגלות שלהם.

פרוטוקול זה מתאר את תהליך הפקת פרוסות לב האדם מלבבות תורמים שלמים, ביצוע אקוטי (כלומר, שעות ארוכות) וכרונית (כלומר, ימים ארוכים) לבדיקת פרמטרים של האלקטרופיזיולוגיה באמצעות מיפוי אופטי. בעוד פרוטוקול זה מתאר רק את השימוש של הרקמה השמאלית החדרית (LV), זה הוחל בהצלחה על אזורים אחרים של הלב, כמו גם מינים אחרים כגון עכברים, חולדות, חזירים גינאה, וחזירים14,20,21,22. המעבדה שלנו משתמשת לבבות תורמים שלמים שנדחו עבור ההשתלה במשך 5 השנים האחרונות, אבל זה אפשרי עבור אותם הליכים להיות מבוצעת על כל התורמים הלב לדוגמה רקמות שהתקבלו על ידי אמצעים חלופיים (למשל, שמאל חדרית לסייע המכשיר [LVAD] implantations, ביופסיות, myectomies כריתת המוח) כל עוד מיפוי אופטי מועסק לניתוח במחקר זה בשל יכולתו למפות בו זמנית את פוטנציאל הפעולה האופטי ואת ארעיות הסידן עם מרחבית גבוהה (100 x 100 פיקסלים) ו הזמני (> 1000 מסגרות/s) החלטה. ניתן להשתמש גם בשיטות חלופיות, כגון מערכים רב-אלקטרודה (אני) או מיקרואלקטרודות, אך טכניקות אלה מוגבלות ברזולוציות מרחבית נמוכות יחסית. בנוסף, אני נועדו לשימוש עם תרביות תאים, ומיקרואלקטרודות חדות מנוהלים בקלות רבה יותר לשימוש עם לבבות שלמים או ממדי רקמה גדולה.

מטרת המאמר היא לאפשר לחוקרים נוספים להשתמש ברקמות לב האדם למחקרים אלקטרופיזיולוגיה של הלב. יצוין כי הטכנולוגיה המתוארת במאמר זה היא פשוטה יחסית ומועילה למחקרים לטווח קצר (בסדר של מספר שעות עד ימים). תרבות פיזיולוגית ביותית יותר למחקרים לטווח ארוך (לפי סדר השבועות) נדונה ותוארה על ידי מספר מחקרים אחרים12,18,23. גירוי חשמלי, העמסה מכנית, ורקמות מתיחה הם מנגנוני מיזוג יתרון שיכולים לעזור להגביל את התחלתה של רקמות מחוץ לגופית שיפוץ12,18,23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל השיטות המתוארות בוצעו בהתאם לכל ההנחיות המוסדיים, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם. המחקר אושר על ידי המועצה לסקירת מוסד (IRB) באוניברסיטת ג'ורג ' וושינגטון.

הערה: ליבם האנושי של התורם נרכש מקהילת ההשתלות האזורית של וושינגטון כשזיהה רקמה שהושלכו באישור מאוניברסיטת ג'ורג ' וושינגטון IRB. לבבות הסבר מועברים על-ידי שטיפה של הלב בתמיסה של כריתת לב קר-הקרח (הדם נוקה מהלב בתהליך זה) והועברה למעבדה תחת תנאי השתלת איברים סטנדרטיים.

1. הכנת פתרונות

  1. עבור כל לב, להפוך 4 L של הפתרון cardioplegic (110 mM הנאקל, 16 מ"מ KCl, 16 מ"מ MgCl2, 10 מ"מ נחקו3, 1.2 mm cacl2; pH = 7.4). אחסן 3 L ב -4 ° c ושאר L ב-20 ° c.
    הערה: ניתן לעשות את הפתרון עד מספר ימים מראש.
  2. טרי להכין 1 L כל הפתרון של טירודה ' s חיתוך (140 mM הנאקל, 6 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl2, 1.8 Mm cacl2, 10 מ"מ גלוקוז, 10 מ"מ hepes, 10 מ"מ 2, 3-butanedione מונוקסימי [Bdm]; pH = 7.4) ופתרון ההתאוששות של Tyrode (140 mm הנאקל, 4.5 mm לקלרנית, 1 מ"מ mgcl2, 1.8 mM cacl2, 10 מ"מ גלוקוז, 10 מ"מ Hepes, 10 מ"מ bdm; pH = 7.4).
    הערה: יש לערוך את פתרונות הפריסה והשחזור ביום הניסוי וניתן לאחסנו ב-4 ° c.
  3. הכן את פתרונות המלאי של צבעי הפלורסנט. מהווים מחדש את הצבע הרגיש מתח RH237 ב 1.25 mg/mL ב diמתיל סולפוקסיד (DMSO) ולאחסן אותו ב 30 μL הבליטים ב 4 ° c. מרכיבים מחדש את מחוון הסידן רוד-2AM ב 1 מ"ג/mL ב DMSO. אחסן ב-30 מעלות צלזיוס ב-20 ° c.
    הערה: די-4-ANEPPS (פתרון מניות ב 1.25 מ"ג/mL ב DMSO) ניתן להשתמש בניסויים עבור דימות מצלמה אחת של הפוטנציאל הטרנסממברניות לבד.
    1. לפני תחילת הניסוי, sonicate את הצבעים באמצעות sonicator אולטרסאונד לפחות 10 דקות ולדלל כל סדרת מחלקים של צבעי פלורסנט ב 1 מ ל של פתרון ההתאוששות. הוספת הריבוי של F-127 (טבלת חומרים) כדי רוד-2am ביחס 1:1 לפני דילול פתרון ההתאוששות.
  4. הכנת פתרון מניות של התכווצות-מצמד הכיווץ בלסטטין ב 2 מ"ג/mL פתרון ב-DMSO. החנות מתחת ל-20 ° c. במהלך ניסויים מיפוי אופטי, לדלל את פתרון המניה של בלוסטטין לריכוז עובד של 5-10 μM בפתרון ההתאוששות של Tyrode.
  5. הפוך בינונית תרבותית טרייה על-ידי השלמה בינונית 199 עם 2% פניצילין-סטרפטומיצין, 1x העברת אינסולין-סלניום (שלה) מדיה נוזלית תוספת, ו 10 מ"מ BDM. סנן את המדיום באמצעות מסנן סטרילי מ0.2 יקרומטר.
    הערה: למחקרים פרמקולוגיים, ניתן להוסיף תרופות ישירות למדיום התרבותי. ניתן לאחסן את מדיום התרבות ב-37 ° c.
  6. להפוך 4% agarose ג'ל הרכבה רקמות על ידי המסת נקודת התכה נמוכה agarose במים מזוקקים ולחמם את התערובת במיקרוגל עד התפרקה לחלוטין. מרפאת את הצמח בצלחת פטרי בעובי של 5 מ"מ ובחנות ב -4 ° c.

2. התקנת ציוד

  1. רטט התקנה מיקרוטומה
    1. כיילו את המיקרוטומה הרוטטת לפני כל ניסוי.
      1. השימוש במיקרוטומה הרוטט בדיוק גבוה (טבלת חומרים), טען להב חיתוך קרמי למחזיק וחבר את מכשיר הכיול המצורף למיקרוטומה הרוטט. בחרו באפשרות ' התאמת להב ' מהתפריט ובחרו קרמיקה לסוג להב.
      2. בחרו באפשרות הרטט, בדקו את ערך הציר Z. אם ערך זה הוא < 1 μm, צא מתפריט הכיול. אם לא, כוונן בעדינות את בורג הכיול המחובר לראש הראש הרוטט ובחר את אפשרות הרטט. חזור על מספר הפעמים הדרוש כדי להגדיר את ציר Z ל< 1 μm.
    2. הגדר את הגדרות הרטט ל400 יקרומטר חיתוך עובי, 0.02 מ"מ/s מהירות מראש עבור רקמת פרפור ו 0.04 mm/s מהירות מראש של רקמת המוח, 2 מ"מ הרטט אופקי משרעת, ו 80 תדר הרטט Hz.
      הערה: בעוד 400 יקרומטר הוא העובי המומלץ כדי לפצות על נזק לתאים במשטח החיתוך של הפרוסה, ניתן גם להכין פרוסות דק יותר. בהינתן כי הגבול דיפוזיה חמצן הוא סביב 150 יקרומטר, פרוסות סביב 300 יקרומטר משמשים לעתים קרובות14,17,18,24.
    3. ממלאים את האמבט של המיקרוטומה הרוטטת עם התמיסה החותכת ב -4 ° c ושמירה על הטמפרטורה על-ידי הקפת החלק החיצוני של האמבט עם קרח, מילוי לפי הצורך לאורך פרוטוקול הפריסה. מחמצן באופן רציף את פתרון הפרוסות באמבטיה על ידי מבעבע עם 100% חמצן במהלך החיתוך.
    4. הגדר צלחת שנייה עם כמו רבים 100 יקרומטר שרשת ניילון משני התאים ושיבות מחסן לפי הצורך (מסננת תא אחד לכל פרוסה). למלא את התבשיל הזה עם פתרון ההתאוששות חמצון זה על ידי מבעבע עם 100% חמצן בטמפרטורת החדר (RT).
      הערה: פתרון זה נשמר ב-RT במהלך הניסוי.
  2. כיוונון מיפוי אופטי
    הערה: תיאור מפורט יותר של מערכת המיפוי האופטית מסופקת בפרסומים הקודמים16,25,26.
    1. לצרף אמבטיה רקמה עם polydiמתיל siloxane (pdms) ג'ל בתחתית (כדי להצמיד את הפרוסות) למערכת זלוף. להפיץ 1 L של פתרון ההתאוששות ב 37 ° c ו חמצן עם 100% חמצן, דרך מערכת זלוף בקצב הזרימה מספיק מהר כדי לשמור על הטמפרטורה והצטברות ברורה של מבשם האמבט.
    2. כוונן את המיקוד והיישור של שתי מצלמות ה-CMOS (טבלת חומרים) באמצעות יעד.
      הערה: פרטים נוספים על היישור ניתן למצוא במחקרים קודמים26.
    3. השתמש במקור אור LED ירוק עם אורך גל של 520 ± 5 ננומטר כדי להלהיב את צבע רגיש מתח וסידן בו.
      הערה: מקור האור עירור מצורף קוביית מסנן עירור של מערכת המיפוי האופטי והוא משתקף החוצה 550 nm דיקרואיק מראה להארה אפיצנטרי. האור הנפלט נאסף על ידי עדשת 1x ומפוצל על ידי דיקרואיק מראה שני ב 630 nm לתוך מרכיבים מתח וסידן לפני שהוא מסונן על ידי 690 ± 50 nm ו 590 ± 33 nm מסננים, בהתאמה, והקליט על ידי שתי המצלמות.

3. פרוטוקול פריסה

  1. כשאתם מוכנים לניתוח וניסויים ברקמות, הכינו אמבט של כריתת לב-קרח באמצעות ערבוב הקרדיוליציה הקפואה והנוזלית. השאר את הלב מתחת למים באמבט עד לאיסוף רקמות לפרוסות (איור 1A).
  2. הדבק את ג'ל מראש שנוצר על גבו של מחזיקי רקמת המתכת של הרטט.
  3. לזהות את הקיר השמאלי חדרית חינם וחותכים 1 ס מ3 קוביות של רקמה בתמיסה הקרה קרדיולצימית. לאחר מכן, הר במהירות את גושי רקמות על מחזיקי רקמת מתכת עם משטחי אנדוקקרודיאל פונה כלפי מעלה ולצרף אותם ג'ל agarose באמצעות דבק עור אקטואלי (איור 1B).
    הערה: אזור הרקמה הנבחר צריך להיות רחוק מכלי דם גדולים כדי למנוע חורים בפרוסות. מישור החיבור מקביל במקביל לאוריינטציה סיבים בשכבת האנדוקקרודיאל (איור 1E) ומישור האזהרה יכול להיות בזווית קלה בשל אנאיזוטרופיה סיבובית בשכבה עמוקה יותר של הקיר LV. כדי להגדיל את התפוקה, עד שני גושי רקמה יכול להיות רכוב זה לצד זה על אותו בעל.
  4. העבירו את מחזיקי המתכת לתוך האמבט הרטט המלא בתמיסת החמצן הקר. ודא שקוביות הרקמה. שקועים לגמרי
  5. הזז את הלהב אל הקצה הקדמי של הרקמה והפעל את הרטט כדי להתחיל לחתוך עם הפרמטרים המוגדרים מראש. התעלם ממספר הפרוסות הראשונות עד שהלהב יגיע מעבר לטראפיליות לתוך רקמת האנדוקקרוחיוג החלקה.
  6. לאחר פרוסה כל חתך, בזהירות להעביר את הפרוסה לחמצן (100% O2) אמבטיה של התאוששות הפתרון של tyrode ב-RT. בעדינות למקם כל פרוסה בפרט 100 יקרומטר ניילון תא רשת שינוי וכיסוי עם מנקי שיבות כדי לשמור את פרוסות הרקמה מסלסול (איור 1c). שמור פרוסות בפתרון השחזור לפחות 20 דקות.
    הערה: ניתן לשמור פרוסות באמבט בתנאים אלה עד 3 עד 4 שעות ללא השפעות אלקטרופיזיולוגיות מזיקות.

4. פורסים מעגלי בתנאים סטטיים

הערה: כדי למזער את הסיכוי לזיהום, לחטא את הלקחיים באמצעות חרוז מחוטא לפני כל צעד העברה.

  1. כאשר מוכן לתרבות, להעביר בזהירות כל פרוסה לבארות הבודדות של 6 צלחת הבאר מלא מלוחים סטרילית מאגור פוספט (PBS). הסלע בעדינות צלחת לשטוף את הפרוסות של פתרון ההתאוששות.
    הערה: מנקודה זו והלאה, יש לחשוף את הפרוסות רק במכסה של תרבות זרימה BSL2-שכבתית, ולהשתמש במלקחיים סטריליים כדי לטפל ברקמה.
  2. העבירו את הפרוסות לבארות של הPBS הטרייה כדי לשטוף ולעקר ביסודיות את הפרוסות עבור התרבות. לבצע זה לשטוף שלב 3x כדי להבטיח הסרה מלאה של פתרון ההתאוששות מן הפרוסות.
  3. להעביר את הפרוסות לבארות בודדות של צלחת 6 הבאר מלא 3 מ ל של טרום מחומם (37 ° c) תרבות בינונית (עם או בלי תרופות, איור 1D). למקם צלחות על שייקר מסלולית ב 20 סל ד בחממה לחות ב 37 ° c עם 30% O2 ו 5% CO2. מנושף ומחליף את התרבות הבינונית כל 48 h.

5. אפיון פונקציונלי – מיפוי אופטי

  1. עבור מחקרים מיפוי אופטי או מיד לאחר הפריסה או לאחר culturing, בזהירות להעביר את הפרוסה של עניין אמבט הרקמה של מערכת זלוף ב 37 ° c עם 100% O2 בפתרון ההתאוששות של tyrode, ולהצמיד את ארבע הפינות אל שכבת ה-pdms ג'ל תוך החלת מתיחה מינימלית (כלומר, רק מ אפשר את הפרוסות לנוח באמבטיה זה עם מחזורי התאוששות פתרון במשך כ 10 דקות.
  2. הוסף 0.3 כ 0.5 מ ל של בלייבלסטטין מדולל למאגר המכיל את פתרון ההתאוששות. תן את הפרוסה לדגירה עם בליבסטטין במשך כ 10 דקות.
  3. מהווים 30 μL של צבע מניות רגיש מתח, RH237, ב 1 mL של פתרון ההתאוששות ב 37 ° c. כבו את המשאבות והעמיסו לאט 0.2 ל-0.3 mL של פתרון צבע העבודה על פני השטח של הפרוסה על פני תקופה של 30 s. לאפשר את הפרוסה כדי לצבוע את הצבע עם משאבות לתקופה עד 90 s, ואז להפעיל את המשאבות שוב כדי לאפשר כל לצבוע עודף לשטוף.
    הערה: יש לנקוט בטיפול כדי להחיל את הצבע באופן שווה בכל הפרוסה. בנוסף, יישום צבע איטי מאוד חיוני כדי למנוע את הצבע מרחף מן הפרוסה.
  4. חזור על שלב 5.3 כדי ליצור מחדש את מחוון סידן מניות רוד-2AM ולטעון אותו על פרוסה.
  5. למקד את המצלמות על הפרוסה על ידי התאמת המרחק של הפרוסה מן העדשה.
  6. מיקום פלטינה דו קוטבית אירידיום באמצעות אלקטרודה כגון העצה שלה הוא במגע עם באמצע הפרוסה ולהחיל גירויים התנועה של משרעת הגוברת כדי לקבוע את הסף המינימלי הנדרש כדי לעורר תגובה חשמלית. הקצב את הפרוסה ב-1 הרץ עם המשך של 2 אלפיות הפעימה ב-1.5 x משרעת של סף התנועה שנקבע מראש. מניחים שמיכות. מעל לפרוסת הרקמה
  7. להאיר את הפרוסה באמצעות 520 ± 5 ננומטר הנורית מקור אור. להקליט את המתח הנפלט אותות סידן עם שתי מצלמות ה-CMOS ב 1,000 מסגרות/s.
  8. בדוק את ההקלטה באיכות אות טובה ובחפצי תנועה מודחקים (איור 1F). הוסף עוד בלוסטטין למאגר בשלבים של 0.1 mL עד התנועה כבר לא מייצרת פריטים באותות האופטיים. הוסף צבע נוסף, במידת הצורך, כדי לשפר את איכות האות.
    הערה: איכות האות הטובה מתייחסת לשרעת האותות הגדולים המוערך ביותר ורעשי רקע נמוכים באותות האופטיים המוקלטת.

6. עיבוד נתונים עם קצב 1.2

הערה: קצב 1.2 הוא ממשק משתמש מבוסס MATLAB המשמש להצגה, תנאי וניתוח של נתוני מיפוי אופטי הנרכשים על-ידי מערכות מיפוי אופטי יחיד או כפול (איור 3). היא משמשת בשילוב עם מערכת ההדמיה.

  1. טעינת קובצי נתונים
    1. טען את קבצי הנתונים לקצב 1.2 על-ידי בחירת אחד מארבעת חלונות התצוגה במסך ושימוש בלחצני בחירת ספריה וטעינה .
    2. התוכנית תנחה את המשתמש לבחור מצלמה 1 או מצלמה 2 נתונים עבור הקלטות מתח כפול וסידן. בחר מצלמה 1 עבור אות המתח.
    3. חזור על התהליך כדי לטעון את אות הסידן (מצלמה 2) לאחד מחלונות התצוגה הסמוכים.
    4. בחר בתיבת הסימון קישור נתונים כפול בין שני חלונות התצוגה שנבחרו כדי לקשר בין שני חלונות התצוגה, מכיוון ששתי ערכות הנתונים נרשמות מאותו אזור בפרוסה.
      הערה: לחילופין, אם אותו שדה של השקפה נשמרת, ניתן להשתמש בפונקציה זו כדי לקשר שתי תמונות שהתקבלו בנקודות זמן נפרדות כדי לראות את תגובת הזמן בפיזיולוגיה של התרופה הנבדקת. לחיצה כפולה על חלון תצוגה אחד מאפשרת להגדיל חלון אחד כדי לאפשר את המשך הניתוח.
  2. מיזוג אותות
    1. בחירת ניתוח נתונים | תנאי פרמטרים כדי להתאים את נתוני מיפוי מתח אופטי וסידן לפני ניתוח נוסף.
    2. השתמש בפונקציה "Remove הרקע" כדי להסיר פיקסלים שאינם מכילים כל אות המבוסס על סף של עוצמת פלורסנט (סף [BG]) ומידת שימוש באשכול באשכולות פיקסלים (העירור [EX]).
    3. בצע חישוב מרחבי של נתוני המיפוי האופטיים באמצעות הפונקציה "Bin" כדי לשפר את איכות האות.
    4. סנן את נתוני המיפוי האופטי באמצעות מסנן מעבר בין רצועות באמצעות הפונקציה "filter".
    5. השתמש בפונקציה "דריפט" כדי להסיר את הסחף הבסיסי באות המיפוי האופטי.
    6. באמצעות הפונקציה "נרמול", לנרמל את נתוני המיפוי האופטי מכל פיקסל כדי לקבל משרעת מקסימלית של 1.
    7. השתמש בפונקציה "האות ההופכית" כדי להפוך את עקבות הסידן לניתוח נוסף.
    8. לחצו על ' הצג גל ' לבחירת המעקב הממוזג מכל נקודה נתונה בחלון התצוגה והתוויית הנתונים בחלון ' צורת גל '. כוונן את פרמטרי מיזוג האותות כדי לקבל יכולת פעולה אופטימלית ועקבות של סידן.
  3. חישוב מהירות ההולכה (CV)
    הערה: זמן ההפעלה מוגדר כזמן הנגזרת המרבית של האות האופטי (dF/dtmax).
    1. בחירת ניתוח נתונים | הפעלה מפה והזנת זמן התחלה וזמן סיום כדי להקיף פוטנציאל פעולה יחיד במעקב. לחץ על חשב ובחר את אזור הריבית (ROI) כדי להציג את מפת ההפעלה של האזור שנבחר (איור 1g).
    2. בחירת ניתוח נתונים | CV Map ובדומה, בחר בזמן התחלה ובשעת סיום. הזן את ערכי הרזולוציה הבין-פיקסלים המבוססים על הכיוונון.
      הערה: עבור מערכות הגדלה של 1x, רזולוציה בין פיקסלים היא 0.1 מ"מ בכיוון X ו-Y.
    3. לחץ על הפקת Vec. לחצן מפה כדי לבחור ROI ולהציג וקטורים CV בתוך אזור זה. הממוצע, החציון, סטיית התקן ומספר הווקטורים הכלולים בניתוח, כמו גם זווית ההפצה הממוצעת של וקטורים של קורות חיים באזור שנבחר מחושב ומוצג במקטע סטטיסטיקה.
    4. לחץ על לחצן צייר קו כדי לצייר קו לאורך כיוון נתון של הפצה. כל וקטורים CV בכיוון זה ייבחרו. לחץ על חשב קורות חיים כדי להשתמש רק בווקטורי קורות החיים שנבחרו כדי לחשב את הסטטיסטיקות שיוצגו בסעיף ' סטטיסטיקה '.
  4. חישוב משך פוטנציאלי (APD) ומשך הסידן של משך זמן (CaTD)
    הערה: ה-APD הוא עוד פרמטר בסיסי לפיזיולוגיה של האלקטרולוגי. ניתן ליצור מפות APD על-ידי קביעת הפרש הזמן בין הפעלה לבין אחוז מוגדר של הפרדה בין כל פוטנציאל של פעולה אופטית. APD טרוגניות או APD הארכה וקיצור ניתן להשתמש כדי לחזות רגישות להפרעה בקצב הלב.
    1. כדי לחשב את APD בקצב 1.2, בחר בניתוח נתונים | Apd/החתול מפה.
    2. בחר את זמן ההתחלה ושעת הסיום כדי להקיף פוטנציאל פעולה מלא אחד. הגדר ערך מינימום ומקסימום של APD/CaTD כדי להסיר החוצה (לדוגמה, 0 ו-1,000 ms, בהתאמה). הזן את אחוז התגובה שיקבע את ה-APD, לדוגמה, 0.8 עבור APD80/catd80 או 0.5 עבור apd50/catd50.
    3. לחץ על חישוב Apd אזורי כדי לבחור ROI וליצור את מפת apd. הממוצע, החציון, סטיית התקן ומספר הפיקסלים הכלולים בניתוח יוצגו בסעיף ' סטטיסטיקה '.
  5. זמן הזריחה
    הערה: זמן העלייה הוא פרמטר אלקטרולוגי אחר שניתן למדוד מאותות אופטיים של מתח ועקבות של סידן. הוא מספק הערכה למשך כמה זמן לוקח עבור ערוצי יון הקטקוניים כדי לעורר פוטנציאל פעולה, או כמה זמן לוקח סידן להשתחרר לתוך הציטופלסמה מן sarcoplasmic רשת. זמן העלייה האופטית אינו תחליף מושלם לזמני העלייה שנמדדו על-ידי microelectrodes, וייתכן שלא יהיה רגיש לשינויים depolarization, כי פוטנציאל פעולה אופטי הם ממוצע של פוטנציאל transממברנים של תאים רבים. הרזולוציה המרחבית והטמפורלית של המערכת יכולה גם להשפיע על ערכי זמן עלייה אופטיים. עם זאת, הוא עדיין יכול לשמש כדי לחזות שינויים גדולים depolarization27.
    1. כדי לקבוע את זמן העלייה, בחר באפשרות ניתוח נתונים | זמן עלייה.
    2. בחר ' זמן התחלה ' ו'זמן סיום ' כדי לבחור באפשרות ' משיכת קו ' של פעולה אחת בודדת או של סידן ארעי. הזן את הערכים של התחל% ו-End% (בדרך כלל 10-90% מומלץ לאותות לא רועשים), המאפשר למשתמש לבחור רק את החלקים של האות מבלי לכלול רעש במקרה של אותות רועשים.
    3. לחץ על חשב כדי לבחור את ה-ROI ולקבוע את הממוצע, החציון, סטיית התקן ומספר הפיקסלים הכלולים בניתוח זמן העלייה.
  6. קרינת סידן
    הערה: לסימני הסידן, ניתן לקבוע את הזמן הקבוע של ריקבון הסידן החולף. זה מאפשר ניתוח של שינויים בהסרת יוני סידן מן הציטופלסמה בחזרה ל-SR.
    1. בחירת ניתוח נתונים | סידן ריקבון ולהזין את שעת ההתחלה וזמן הסיום כדי להקיף את החלק הריקבון כולו של אות אחד חולף סידן.
    2. לחץ על חשב טאו כדי לבחור את ה-ROI ולקבוע את הממוצע, החציון, סטיית התקן, ומספר הפיקסלים הכלולים בניתוח של זמן ניוון סידן קבוע.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

פרוסות אורגאואיות אנושיות נאספו מחדר שמאלי של לב אנושי התורם לפי הפרוטוקול המפורט לעיל ומומחש באיור 1. מערכת מיפוי אופטי מצלמה כפולה כמו זו באיור 2שימש בתצורת הדמיה זקופה לבצע מיפוי אופטי סימולטני של מתח וסידן על 1 h לאחר השלמת פרוטוקול הפרוסות. הנתונים נותח...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן, אנו מציגים שיטות צעד אחר צעד כדי לקבל פרוסות לב קיימא מן הלבבות עצר האדם לבבות ולאפיין פונקציונלית את הפרוסות באמצעות מיפוי אופטי כפול של פוטנציאל טרנסקרום וסידן תאיים. עם סביבה משומרת מועלת ומשולבת תאים תא התא, פרוסות לב האדם יכול לשמש כמודל מדויק של הלב האנושי לגילוי מדעי בסיסי וליע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

מימון על ידי NIH (מענקים R21 EB023106, R44 HL139248, ו R01 HL126802), על ידי הקרן Leducq (הפרויקט קצב) ו מלגת האיגוד האמריקני פוסט דוקטורט (19POST34370122) הם הכירו בהכרת תודה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1mL BD SyringeThomas Scientific309597
2,3-butanedione monoximeSigma-AldrichB0753
6 well culture platesCorning3516
Biosafety cabinetThermoFisher Scientific1377
BlebbistatinCayman13186
Bubble TrapRadnoti130149
Calcium chlorideSigma-AldrichC1016
Corning Cell StrainersFisher Scientific07-201-432
Di-4-ANEPPSBiotiumstock solution at 1.25 mg/mL in DMSO
DMSOSigma-AldrichD2650
Dumont #3c ForcepsFine Science Tools11231-20
Emission dichroic mirrorChromaT630LPXR-UF1
Emission filter (RH237)ChromaET690/50m
Emission Filter (Rhod2AM)ChromaET590/33m
Excitation dichroic mirrorChromaT550LPXR-UF1
Excitation FilterChromaET500/40x
Falcon 50mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-959-49A
GlucoseSigma-AldrichG8270
Heat exchangerRadnoti158821
HEPESSigma-AldrichH3375
IncubatorThermoFisher Scientific50145502
Insulin Transferrin Selenium (ITS)Sigma-AldrichI3146
LED excitation light sourcePrizmatixUHP-Mic-LED-520
Magnessium chloride hexahydrateSigma-AldrichM9272
Medium 199ThermoFisher Scientific11150059
Micam Ultima L type CMOS cameraScimediaN/A
Minutien PinsFine Science Tools26002-10
Pennicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333
Peristaltic PumpCole ParmerEW-07522-20
Platinum pacing wireAlfa Aesar43275
Pluronic F127ThermoFisher ScientificP6867nonionic, surfactant polyol
Potassium chlorideSigma-AldrichP3911
Powerlab data acquisition and stimulatorAD InstrumentsPowerlab 4/26
RH237Biotium61018
Rhod2AMThermoFisher ScientificR1245MP
Rhod-2AMInvitrogen, Carlsbad, CA
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014
Sodium chlorideSigma-AldrichS9625
Sterilizer, dry beadSigma-AldrichZ378550
Stone Oxygen DiffuserWaterwoodB00O0NUVM0
TissueSeal - Histoacryl Topical Skin AdhesivegobiomedAESCULAP
UltraPure Low Melting Point AgaroseThermo Fisher Scientific16520100
Ultrasound sonicatorBranson 1800
VibratomeCampden Instruments7000 smz

References

  1. Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).
  2. Choudhary, A., Ibdah, J. A. Animal models in today's translational medicine world. Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).
  3. Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
  4. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  5. Green, A. R. Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).
  6. Shinnawi, R., Gepstein, L. iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331(2014).
  7. Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip. Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).
  8. Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
  9. Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
  10. Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1. Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).
  11. Zhang, Y., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PloS One. 5 (9), 12559(2010).
  12. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168(2019).
  13. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, 117(2019).
  14. Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
  15. Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).
  16. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798(2016).
  17. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).
  18. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
  20. Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts - A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).
  21. Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
  22. Bussek, A., et al. Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).
  23. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).
  24. Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. Supply of nutrients to cells in engineered tissues. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).
  25. Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. Journal of Visualized Experiments. (55), e3275(2011).
  26. Brianna, C., et al. Open-Source Multiparametric Optocardiography. Scientific Reports. 9, 721(2019).
  27. George, S. A., et al. Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).
  28. Kawara, T., et al. Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis. Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).
  29. Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109(2018).
  30. Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies. Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).
  31. Lou, Q., et al. Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure. Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved