تقييم الكهربائيات القلبية قبل الاحتكين بواسطة الجهد المزدوج ورسم الخرائط البصرية الكالسيوم لشرائح القلب العضوية البشرية

Summary

يصف هذا البروتوكول الإجراء الخاص بالقطع و زراعة شرائح القلب البشرية لاختبار الأدوية قبل الفحص، وتفاصيل استخدام الخرائط البصرية لتسجيل الجهد عبر المُجمب وإشارات الكالسيوم داخل الخلايا في وقت واحد من هذه الشرائح.

Abstract

وقد تم مؤخرا تطوير الاستعدادات شريحة القلب الإنسان كمنصة لدراسات علم وظائف الأعضاء البشرية واختبار العلاج لسد الفجوة بين التجارب الحيوانية والسريرية. وقد استخدمت العديد من نماذج الحيوانات والخلايا لدراسة آثار المخدرات، ولكن هذه الاستجابات غالبا ما تختلف في البشر. تقدم شرائح القلب البشرية ميزة لاختبار المخدرات من حيث أنها مشتقة مباشرة من قلوب الإنسان قابلة للحياة. بالإضافة إلى الحفاظ على هياكل متعددة الخلايا، اقتران الخلايا الخلية، وبيئات مصفوفة خارج الخلية، يمكن استخدام شرائح الأنسجة القلبية البشرية لاختبار مباشر تأثير الأدوية التي لا تعد ولا تحصى على وظائف الأعضاء القلبية البشرية الكبار. ما يميز هذا النموذج عن غيرها من الاستعدادات القلب، مثل قلوب كاملة أو أسافين، هو أن شرائح يمكن أن تخضع للثقافة على المدى الطويل. على هذا النحو، تسمح شرائح القلب لدراسة الآثار الحادة والمزمنة للأدوية. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على جمع عدة مئات إلى ألف شريحة من قلب واحد يجعل هذا نموذجا عالي الإنتاجية لاختبار العديد من الأدوية بتركيزات وتركيبات مختلفة مع أدوية أخرى في نفس الوقت. يمكن إعداد الشرائح من أي منطقة معينة من القلب. في هذا البروتوكول، ونحن وصف إعداد شرائح البطين الأيسر عن طريق عزل مكعبات الأنسجة من الجدار الأيسر خالية البطين وجزئتها إلى شرائح باستخدام microtome تهتز عالية الدقة. ويمكن بعد ذلك أن تخضع هذه الشرائح لتجارب حادة لقياس الوظيفة الكهروفسية القلبية الأساسية أو مثقفة لدراسات المخدرات المزمنة. يصف هذا البروتوكول أيضا رسم الخرائط البصرية المزدوجة لشرائح القلب للتسجيلات المتزامنة لإمكانات الميكروم عبر الخلايا وديناميات الكالسيوم داخل الخلايا لتحديد آثار الأدوية التي يجري التحقيق فيها.

Introduction

وقد كانت النماذج الحيوانية أداة قيمة تستخدم لفهم الآليات الكامنة في علم وظائف الأعضاء البشرية والفيزيولوجيا المرضية، فضلا عن منصة للاختبار الأولي للعلاجات لعلاج الأمراض المختلفة¹. وقد اتخذت خطوات كبيرة في مجال البحوث الطبية الحيوية استنادا إلى هذه الدراسات الحيوانية². ومع ذلك، توجد اختلافات كبيرة بين الأنواع بين علم وظائف الأعضاء البشرية والحيوانية، بما في ذلك الفئران والجرذان والخنازير الغينية والأرانب والأغنام والخنازير والكلاب^3،4. ونتيجة لذلك، كان هناك العديد من الأدوية، الجينات، والعلاجات الخلية التي أظهرت الوعد خلال مرحلة اختبار الحيوانات ولكن فشلت في الارتقاء إلى مستوى النتائج في التجارب السريرية⁵. ولسد هذه الفجوة، تم تطوير الخلايا القلبية المعزولة والخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) كنماذج لاختبار استجابة علم وظائف الأعضاء البشرية لمختلف الأدوية والأمراض⁶. وقد استخدمت الخلايا الجذعية المشتقة cardiomyocytes على نطاق واسع في الجهاز على رقاقة النظم كبديل للقلب^6,7,8. ومع ذلك، فإن فائدة القلب القلبي المشتق من iPSC (iPSC-CMs) تعوقها نوعها الظاهري غير الناضج نسبيًا وعدم تمثيل السكان الفرعيين في القلب و القلب؛ عضلة القلب ناضجة عبارة عن بنية معقدة تتألف من عدة أنواع الخلايا المتعايشة مثل الخلايا الليفية، والخلايا العصبية، الضامة، والخلايا البطانية. من ناحية أخرى ، تكون الخلايا القلبية البشرية المعزولة ناضجة كهربائيًا ، ويمكن الحصول على التشكيلات الفرعية القلبية المختلفة عن طريق تغيير معلمات الاستزراع⁹. لا يزال، هذه myocytes عموما عرض العمل المحتملة morphologies بسبب عدم وجود اقتران الخلية الخلية، سريع دي التمايز، وحدوث سلوك proarrhythmic في المختبر^10،11. تم معالجة بعض القيود من قبل نماذج ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد من iPSC-CMs و myocytes القلبية. هذه النماذج، التي تشمل spheroids، سقالة هيدروجيل مغلفة الثقافات 3D، أنسجة القلب المهندسة (EHTs)، وأنظمة القلب على رقاقة، واستخدام مجموعات الخلايا القلبية متعددة مثل خلايا القلب، الخلايا الليفية، والخلايا البطانية. إما أنها ذاتية التجمع أو التجمع على طول سقالة لتشكيل هياكل 3D، وبعض حتى إعادة إنتاج الطبيعة المعقدة أنيسروبيك من عضلة القلب. وقد تم الإبلاغ عن هذه النماذج أن يكون خلايا من الأنماط الظاهرية ناضجة، وخصائص انقباضية، وملامح الجزيئية مماثلة للأنسجة القلب. كما يسمح نظام القلب على رقاقة بدراسة الآثار النظامية في اختبار المخدرات ونماذج الأمراض. ومع ذلك، في النماذج المستندة إلى الخلايا في المختبر تفتقر إلى مصفوفة خارج الخلية الأصلي وبالتالي لا يمكن تقليد بدقة الجهاز مستوى الفيزيولوجيا الكهربائية. شرائح القلب البشري، على النقيض من ذلك، لديها مصفوفة خارج الخلية سليمة والمخالط الأصلية من الخلايا إلى الخلية، مما يجعلها مفيدة لمزيد من التدقيق في فحص خصائص عدم انتظام ضربات القلب البشرية.

وقد طور الباحثون شرائح الجهاز القلبي البشري كمنصة قبل كلينية فسيولوجية لاختبار الأدوية الحادة والمزمنة ودراسة الفيزيولوجيا الكهربائية القلبية وتطور أمراض القلب^{12,13,14,15,16,17,18,19}. بالمقارنة مع الخلايا القلبية المشتقة من iPSC ، فإن شرائح القلب البشرية تكرر بأمانة أكبر أمراض القلب البشرية البالغة مع النمط الظاهري للقلب الناضج. بالمقارنة مع خلايا القلب البشرية المعزولة، شرائح القلب المعرض فترات العمل الفسيولوجية المحتملة بسبب اقتران الخلايا المحفوظة جيدا والوجود الجوهري لبيئاتهم داخل وخارج الخلية الأصلية.

يصف هذا البروتوكول عملية توليد شرائح القلب البشرية من قلوب المتبرعين بالكامل، وأداء دراسات حادة (أي ساعات طويلة) ومزمنة (أي أيام) لاختبار بارامترات الفيزيولوجيا الكهربائية القلبية عن طريق رسم الخرائط البصرية. في حين أن هذا البروتوكول يصف فقط استخدام أنسجة البطين الأيسر (LV) ، فقد تم تطبيقه بنجاح على مناطق أخرى من القلب وكذلك أنواع أخرى مثل الفئران والجرذان والخنازير الغينية^{والخنازير 14،20،21،22}. يستخدم مختبرنا قلوب المتبرعين البشريين بالكامل التي تم رفضها للزرع على مدى السنوات الخمس الماضية ، ولكن من الممكن تنفيذ هذه الإجراءات نفسها على أي أنسجة عينة قلب متبرع تم الحصول عليها بوسائل بديلة (على سبيل المثال ، جهاز المساعدة البطيني الأيسر [LVAD] زرع ، خزعات ، استئصالات myectomies) طالما أن الأنسجة لديها القدرة على أن تكون مقطعة إلى مكعبات. يستخدم رسم الخرائط البصرية للتحليل في هذه الدراسة نظرا لقدرته على رسم خريطة في وقت واحد إمكانات العمل البصري والكالسيوم العابرين مع ارتفاع المكانية (100 × 100 بكسل) والزمانية (> 1000 إطار / ق) القرار. ويمكن أيضاً استخدام طرق بديلة، مثل صفيفات multielectrode (الاتفاقات المتعددة الأعراق) أو ميكروليكتروديس، ولكن هذه التقنيات محدودة بسبب دقة مكانيتها المنخفضة نسبياً. بالإضافة إلى ذلك، تم تصميم الاتفاقات MEA للاستخدام مع الثقافات الخلية، ويتم إدارة microelectrodes حادة أكثر سهولة للاستخدام مع قلوب كاملة أو أسافين الأنسجة الكبيرة.

الهدف من هذه المادة هو تمكين المزيد من الباحثين من استخدام أنسجة القلب البشرية لدراسات الفيزيولوجيا الكهربائية القلبية. وتجدر الإشارة إلى أن التكنولوجيا المذكورة في هذه المقالة بسيطة نسبيا ومفيدة للدراسات قصيرة الأجل (على سبيل ترتيب عدة ساعات إلى أيام). وقد نوقشت الثقافة الحيوية الفسيولوجية أكثر للدراسات على المدى الطويل (على ترتيب أسابيع) ووصفها عدد من الدراسات الأخرى^12,18,23. التحفيز الكهربائي، والتحميل الميكانيكي، وتمتد الأنسجة هي آليات تكييف مفيدة التي يمكن أن تساعد على الحد من بداية في الأنسجة في المختبر إعادة عرض^12،18،23.

Protocol

وقد تم تنفيذ جميع الأساليب الموصوفة وفقا لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية المتعلقة برفاه الإنسان. تمت الموافقة على البحوث من قبل مجلس مراجعة المؤسسات (IRB) في جامعة جورج واشنطن.

ملاحظة: تم الحصول على قلوب بشرية مانحة من مجتمع واشنطن الإقليمي لزرع الأعضاء كإنسجة متخلصة من الهوية بموافقة من جامعة جورج واشنطن IRB. يتم القبض على قلوب explanted cardioplegically عن طريق طرد القلب مع حل من القلب الباردة الجليد (تم مسح الدم من القلب في هذه العملية) ونقلها إلى المختبر في ظل ظروف زرع الأعضاء القياسية.

1- إعداد الحلول

1. لكل قلب، وجعل 4 L من حل القلب النابل (110 mM NaCl، 16 mM KCl، 16 mM MgCl_2،10 mM NaHCO_3،1.2 mM CaCl_2؛pH = 7.4). تخزين 3 لتر في 4 درجة مئوية و1 لتر المتبقية في -20 درجة مئوية.
   ملاحظة: يمكن إجراء هذا الحل إلى عدة أيام مقدماً.
2. إعداد حديثا 1 لتر كل من حل تشريح تيرود (140 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1.8 mM CaCl₂, 10 mM الجلوكوز, 10 mM HEPES, 10 mM 2,3-butanedione monoxime [BDM]; pH = 7.4) و تايرود حل الانتعاش (140 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1.8 mM CaCl₂, 10 mM الجلوكوز, 10 mM HEPES, 10 mM BDM; pH = 7.4).
   ملاحظة: يجب جعل كل من حلول التقطيع والاسترداد يوم التجربة ويمكن تخزينها عند 4 درجات مئوية.
3. إعداد حلول الأسهم من الأصباغ الفلورسنت. إعادة تشكيل صبغة حساسة للجهد 237 في 1.25 ملغ / مل في ثنائيثيل السلفوكسيد (DMSO) وتخزينه في 30 ميكرولتر aliquots في 4 درجة مئوية. إعادة تشكيل مؤشر الكالسيوم رود-2AM في 1 ملغ /مليلتر في DMSO. تخزين في 30 ميكرولتر aliquots في -20 درجة مئوية.
   ملاحظة: يمكن استخدام Di-4-ANEPPS (محلول الأسهم عند 1.25 ملغ/مل في DMSO) في تجارب التصوير بالكاميرا الفردية لإمكانات الترميمبران وحدها.
   1. قبل بداية التجربة، sonicate الأصباغ باستخدام sonicator الموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقيقة على الأقل وتمييع كل aliquot من الأصباغ الفلورية في 1 مل من الحل الانتعاش. إضافة Pluronic F-127(جدول المواد)إلى رود-2AM بنسبة 1:1 قبل التخفيف في حل الانتعاش.
4. إعداد حل الأسهم من الإثارة-الانكماش uncoupler blebbistatin في 2 ملغ / مل حل في DMSO. تخزين في aliquots في -20 درجة مئوية. خلال تجارب الخرائط البصرية، تمييع محلول مخزون blebbistatin إلى تركيز عمل يبلغ 5−10 ميكرومتر في محلول الانتعاش في التيرود.
5. جعل ثقافة جديدة المتوسطة من خلال تكملة المتوسطة 199 مع 2٪ البنسلين-ستريبتوميسين, 1x الأنسولين نقل السيلينيوم-السيلينيوم (ITS) تكملة وسائل الإعلام السائلة, و 10 M BDM. تصفية المتوسطة باستخدام مرشح معقم 0.2 ميكرومتر.
   ملاحظة: بالنسبة لدراسات الانزعاج الدوائي، يمكن إضافة الأدوية مباشرة إلى الوسط الثقافي. يمكن تخزين الوسط الثقافي عند 37 درجة مئوية.
6. جعل 4٪ agarose هلام لتركيب الأنسجة عن طريق حل منخفضة ذوبان أكروزوا نقطة في الماء المقطر وتسخين الخليط في ميكروويف حتى يذوب تماما. علاج agarose في طبق بيتري بسماكة 5 مم وتخزينها في 4 درجة مئوية.

2. إعداد المعدات

1. إعداد ميكرومومي الاهتزاز
   1. معايرة microtome تهتز قبل كل تجربة.
      1. باستخدام الدقيقة عالية الدقة تهتز microtome(جدول المواد)،تحميل شفرة قطع السيراميك في حامل وإرفاق جهاز معايرة المقدمة مع microtome تهتز. اختر خيار ضبط الشفرة من القائمة وحدد السيراميك لنوع الشفرة.
      2. حدد خيار الاهتزاز، تحقق من قيمة محور Z. إذا كانت هذه القيمة <1 ميكرومتر، قم بإنهاء قائمة المعايرة. إذا لم يكن كذلك، ضبط ناعما المسمار المعايرة تعلق على الجزء العلوي من الرأس تهتز وحدد الخيار اهتزاز. كرر عدة مرات حسب الحاجة لتعيين المحور Z إلى <1 ميكرومتر.
   2. تعيين إعدادات الاهتزاز إلى 400 ميكرومتر قطع سمك، 0.02 مم / ث سرعة متقدمة للأنسجة الأذينية و 0.04 مم / ث سرعة تقدم للأنسجة البطينية، 2 مم السعة الاهتزاز الأفقي، و 80 هرتز تردد الاهتزاز.
      ملاحظة: في حين أن 400 ميكرومتر هو سمك الموصى به للتعويض عن تلف الخلايا على الأسطح قطع من شريحة، ويمكن أيضا أن تكون شرائح أرق تكون مستعدة. وبالنظر إلى أن الحد الأقصى لنشر الأكسجين حوالي 150 ميكرومتر، فإن الشرائح التي تبلغ حوالي 300 ميكرومتر غالبا ما تستخدم^{14و17و18و24.}
   3. ملء حمام microtome تهتز مع حل تشريح في 4 درجة مئوية والحفاظ على درجة الحرارة من قبل المحيطة خارج الحمام مع الجليد، وتجديد حسب الحاجة في جميع أنحاء بروتوكول تشريح. الأكسجين باستمرار حل تشريح في الحمام عن طريق محتدما مع الأكسجين 100٪ أثناء تشريح.
   4. إعداد طبق ثان مع العديد من 100 ميكرومتر مصافي خلية شبكة النايلون وغسالات شبكية حسب الحاجة (مصفاة خلية واحدة لكل شريحة). ملء هذا الطبق مع محلول الانتعاش وأكسجين عليه عن طريق محتدما مع الأكسجين 100٪ في درجة حرارة الغرفة (RT).
      ملاحظة: يتم الاحتفاظ بهذا الحل في RT أثناء التجربة.
2. إعداد تعيين بصري
   ملاحظة: يتم توفير وصف أكثر تفصيلا لنظام الخرائط البصرية في المنشورات السابقة^16،25،26.
   1. إرفاق حمام الأنسجة مع طبقة هلام بوليديميثيلوكسيكسان (PDMS) في الجزء السفلي (لتثبيت الشرائح) إلى نظام الضخ. تعميم 1 لتر من محلول الاسترداد في 37 درجة مئوية والأكسجين مع الأكسجين 100٪ ، من خلال نظام الضخ بمعدل تدفق سريع بما يكفي للحفاظ على درجة الحرارة وتراكم واضح من الاستحمام perfusate.
   2. ضبط التركيز والمحاذاة من اثنين من كاميرات CMOS(جدول المواد)باستخدام هدف.
      ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول المحاذاة في الدراسات السابقة²⁶.
   3. استخدام مصدر الضوء الأخضر LED مع طول موجة من 520 ± 5 نانومتر لإثارة صبغات مؤشر قياس الجهد والكالسيوم في وقت واحد.
      ملاحظة: مصدر ضوء الإثارة موصول بمكعب مرشح الإثارة في نظام الخرائط البصرية وينعكس على مرآة 550 نانومتر للإضاءة الملحمية. يتم جمع الضوء المنبعث من قبل عدسة 1x وتقسيمها من قبل مرآة dichroic الثانية في 630 نانومتر في مكونات الجهد والكالسيوم قبل أن يتم تصفيتها من قبل 690 ± 50 نانومتر و 590 ± 33 نانومتر المرشحات، على التوالي، وسجلت من قبل الكاميرات اثنين.

3. بروتوكول تقطيع

1. عندما تكون جاهزة لتشريح الأنسجة والتجريب، وإعداد حمام من القلب الباردة الجليد عن طريق خلط غشاء القلب المجمدة والسائلة. الحفاظ على القلب المغمورة في حمام القلب وplegia حتى جمع الأنسجة لتشريح (الشكل 1A).
2. الغراء هلام agarose premade إلى الجزء الخلفي من حاملي الأنسجة المعدنية من الهزاز.
3. تحديد الجدار الأيسر خالية البطين وقطع 1 سم^{مكعبات 3} من الأنسجة في محلول القلب والعضلي الباردة. ثم، بسرعة جبل كتل الأنسجة على أصحاب الأنسجة المعدنية مع الأسطح بطانة القلب التي تواجهها وإرفاقها إلى هلام agarose باستخدام لاصقة الجلد الموضعية(الشكل 1B).
   ملاحظة: يجب أن تكون منطقة الأنسجة المختارة بعيدة عن الأوعية الدموية الكبيرة لتجنب الثقوب في الشرائح. إن مستوى القطاعات موازٍ تقريباً لتوجه الألياف في طبقة بطانة القلب(الشكل 1E)ويمكن أن يكون مستوى القطاعات بزاوية طفيفة بسبب أنسوجيا الدوران في طبقة أعمق من جدار LV. لزيادة الإنتاجية، يمكن تركيب ما يصل إلى كتلتين من الأنسجة جنبًا إلى جنب على نفس الحامل.
4. نقل أصحاب المعادن في حمام هزاز مليئة حل تقطيع الأوكسيجين الباردة الجليد. تأكد من أن مكعبات الأنسجة مغمورة بالكامل.
5. حرك الشفرة إلى الحافة الأمامية للأنسجة واقلب الاهتزاز لتبدأ في التقطيع مع المعلمات المسبقة. تخلص من الشرائح المتعددة الأولى حتى تصل الشفرة إلى ما وراء الترابيكولا إلى الأنسجة الشغافية الناعمة.
6. مرة واحدة يتم قطع كل شريحة، ونقل بعناية شريحة إلى أكسجين (100٪ O₂₎حمام من حل الانتعاش التيرود في RT. ضع بلطف كل شريحة في الفردية 100 ميكرومتر مصافي الخلايا شبكة النايلون وتغطية مع غسالات متشابكة للحفاظ على شرائح الأنسجة من الشباك(الشكل 1C). احتفظ بشرائح في محلول الاسترداد لمدة 20 دقيقة على الأقل.
   ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالشرائح في الحمام في ظل هذه الظروف لمدة تصل إلى 3−4 ساعة دون تأثيرات كهربائية ضارة.

4. زراعة شريحة في ظل ظروف ثابتة

ملاحظة: لتقليل فرصة التلوث، تعقيم ملقط باستخدام معقمة الخرز قبل كل خطوة نقل.

1. عندما تكون جاهزة للثقافة، نقل بعناية كل شريحة إلى الآبار الفردية من لوحة 6 بئر مليئة المالحة المعقمة الفوسفات المخزنة (PBS). صخرة بلطف لوحة جيدا لشطف شرائح من حل الانتعاش.
   ملاحظة: من هذه النقطة إلى الأمام، يجب أن تكون شرائح فقط يتعرض في غطاء ثقافة تدفق الفارم BSL2، ويجب استخدام ملقط العقيمة للتعامل مع الأنسجة.
2. نقل شرائح إلى آبار من برنامج تلفزيوني جديد لشطف شامل وتعقيم شرائح للثقافة. تنفيذ هذه الخطوة 3x غسل لضمان إزالة كاملة من حل الانتعاش من شرائح.
3. نقل شرائح إلى آبار فردية من 6 لوحة بئر مليئة 3 مل من prewarmed (37 درجة مئوية) المتوسطة الثقافة (مع أو بدون المخدرات، الشكل 1D). ضع اللوحات على شاكر مداري عند 20 دورة في الدقيقة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 30% O₂ و 5% CO₂. التعرق واستبدال الثقافة المتوسطة كل 48 ح.

5- التوصيف الوظيفي - رسم الخرائط البصرية

1. لدراسات رسم الخرائط البصرية إما مباشرة بعد تشريح أو بعد زراعة، نقل بعناية شريحة من الفائدة إلى حمام الأنسجة من نظام القذف في 37 درجة مئوية مع 100٪ O₂ في حل الانتعاش تيرودي، دبوس أسفل الزوايا الأربعة إلى طبقة هلام PDMS مع تطبيق الحد الأدنى تمتد (أي، فقط بما فيه الكفاية للحفاظ على شريحة من التحرك بسهولة تحت ظروف التدفق). السماح لشرائح للراحة في هذا الحمام مع تعميم حل الانتعاش لمدة 10 دقيقة تقريبا.
2. أضف 0.3−0.5 مل من البليبيتاتين المخفف إلى الخزان الذي يحتوي على محلول الاستعادة. اسمحوا شريحة احتضان مع blebbistatin لمدة 10 دقيقة تقريبا.
3. إعادة تشكيل 30 ميكرولتر من صبغة الأسهم الحساسة للجهد، RH237، في 1 مل من حل الانتعاش في 37 درجة مئوية. إيقاف المضخات وتحميل ببطء 0.2−0.3 مل من حل صبغة العمل على سطح شريحة على مدى فترة 30 s. السماح للشريحة لاحتضان في الصبغة مع مضخات قبالة لفترة تصل إلى 90 s، ثم تشغيل المضخات مرة أخرى للسماح لأي صبغة الزائدة لغسل.
   ملاحظة: يجب توخي الحذر لتطبيق الصبغة بالتساوي في جميع أنحاء الشريحة. بالإضافة إلى ذلك، تطبيق صبغ بطيئة جدا أمر حاسم لمنع الصبغة من العائمة بعيدا عن شريحة.
4. كرر الخطوة 5.3 لإعادة تشكيل مؤشر الكالسيوم السهم رود-2AM وتحميله على شريحة.
5. ركز الكاميرات على الشريحة عن طريق ضبط مسافة الشريحة من العدسة.
6. ضع قطب سرعة البلاتين ثنائي القطب بحيث يكون طرفه على اتصال مع منتصف الشريحة وتطبيق محفزات سرعة السعة المتزايدة لتحديد الحد الأدنى لعتبة سرعة المطلوبة للحصول على استجابة كهربائية. سرعة الشريحة في 1 هرتز مع 2 مللي ثانية عرض مدة في 1.5x السعة من عتبة سرعة محددة سلفا. ضع غطاء على شريحة الأنسجة.
7. تضيء شريحة باستخدام 520 ± 5 نانومتر LED مصدر الضوء الإثارة. سجل إشارات الجهد والكالسيوم المنبعثة مع كاميرتي CMOS بمعدل 1000 إطار/الثانية.
8. تحقق من تسجيل جودة إشارة جيدة والتحف الحركة قمعها (الشكل 1F). إضافة المزيد من blebbistatin إلى الخزان في خطوات من 0.1 مل حتى الحركة لم تعد تنتج القطع الأثرية في الإشارات البصرية. أضف المزيد من الصبغة، إذا لزم الأمر، لتحسين جودة الإشارة.
   ملاحظة: تشير جودة الإشارة الجيدة إلى سعة الإشارة الكبيرة المقدرة نوعًا والضوضاء المنخفض في الخلفية في الإشارات البصرية المسجلة.

6. معالجة البيانات مع RHYTHM1.2

ملاحظة: RHYTHM1.2 هو واجهة مستخدم MATLAB القائمة التي تستخدم لعرض، شرط، وتحليل بيانات الخرائط البصرية المكتسبة من قبل أنظمة رسم الخرائط البصرية الكاميرا واحدة أو مزدوجة(الشكل 3). يتم استخدامه بالاقتران مع نظام التصوير.

1. تحميل ملفات البيانات
   1. تحميل ملفات البيانات في RHYTHM1.2 عن طريق تحديد أي من نوافذ العرض الأربعة على الشاشة واستخدام الدليل تحديد وأزرار تحميل.
   2. سيقوم البرنامج بمطالبة المستخدم لتحديد بيانات الكاميرا 1 أو الكاميرا 2 لتسجيلات الجهد الثنائي والكالسيوم. حدد الكاميرا 1 لإشارة الجهد.
   3. كرر العملية لتحميل إشارة الكالسيوم (الكاميرا 2) إلى أحد نوافذ العرض المجاورة.
   4. حدد خانة الاختيار ربط البيانات المزدوجة بين نافذتي العرض المحددين لربط نافذتي العرض، حيث يتم تسجيل مجموعتي البيانات من نفس المنطقة على الشريحة.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، إذا تم الحفاظ على نفس مجال الرؤية، يمكن استخدام هذه الوظيفة لربط صورتين تم الحصول عليهما في نقاط زمنية منفصلة لرؤية الاستجابة الزمنية في الفيزيولوجيا الكهربائية للدواء الذي يجري التحقيق فيه. النقر المزدوج أي نافذة عرض واحدة يسمح أن يتم تكبير إطار واحد للسماح لسهولة التحليل.
2. تكييف الإشارة
   1. حدد تحليل البيانات | المعلمات شرط لشرط الجهد والكالسيوم بيانات الخرائط البصرية قبل مزيد من التحليل.
   2. استخدم الدالة"إزالة الخلفية"لإزالة وحدات البكسل التي لا تحتوي على أي إشارة استناداً إلى عتبة كثافة الفلورسنت (عتبة الخلفية [BG] ودرجة البكسل متفاوت المسافات (استثارة [EX] عتبة).
   3. تنفيذ المتوسط المكاني لبيانات الخرائط البصرية باستخدام وظيفة"Bin"لتحسين جودة الإشارة.
   4. تصفية بيانات التعيين البصري باستخدام شريط تمرير مرشح مع "تصفية" وظيفة.
   5. استخدام"الانجراف"وظيفة لإزالة الانجراف خط الأساس في إشارة رسم الخرائط البصرية.
   6. باستخدام"تطبيع"وظيفة، تطبيع بيانات الخرائط البصرية من كل بكسل أن يكون أقصى اتساع 1.
   7. استخدم الدالة"الإشارة العكسية"لعكس آثار الكالسيوم لمزيد من التحليل.
   8. انقر فوق عرض الموجة لتحديد التتبع المشروط من أي بقعة معينة في نافذة العرض و رسمها في إطار الموجي. ضبط معلمات تكييف إشارة للحصول على إمكانية العمل الأمثل وآثار عابرة الكالسيوم.
3. حساب سرعة الـ (CV)
   ملاحظة: يتم تعريف وقت التنشيط على أنه وقت مشتق الأقصى من الإشارة الضوئية (dF /dt_{الحد الأقصى).}
   1. حدد تحليل البيانات | قم بالتنشيط قم بإدخال وقت البدء ووقت الانتهاء ليشمل إمكانية إجراء واحد في التتبع. اضغط على حساب وحدد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) لعرض خريطة التنشيط للمنطقة المحددة ( الشكل1G).
   2. حدد تحليل البيانات | السيرة الذاتية خريطة وبالمثل، واختيار وقت البدء ووقت الانتهاء. أدخل قيم دقة interpixel استناداً إلى الإعداد.
      ملاحظة: بالنسبة لأنظمة التكبير 1x، دقة interpixel هي 0.1 مم في الاتجاه X و Y.
   3. اضغط على إنشاء Vec. زر الخريطة لتحديد عائد الاستثمار وعرض متجهات السيرة الذاتية داخل تلك المنطقة. ويُحسب متوسط ناقلات السيرة الذاتية ومتوسطها وانحرافها المعياري وعددها، وكذلك زاوية الانتشار المتوسطة لمتجهات السيرة الذاتية في المنطقة المختارة، وتعرض في قسم الإحصاءات.
   4. انقر فوق الزر رسم الخط لرسم خط على طول اتجاه معين من الانتشار. سيتم اختيار جميع متجهات السيرة الذاتية في هذا الاتجاه. انقر فوق حساب السيرة الذاتية لاستخدام تلك الموجهات CV المحدد فقط لحساب الإحصائيات التي سيتم عرضها في قسم الإحصائيات.
4. مدة الإجراء المحتملة (APD) والكالسيوم مدة عابرة (CaTD) حساب
   ملاحظة: إن APD هو معلمة أساسية أخرى للفيزياء الكهربية القلبية. يمكن إنشاء خرائط APD عن طريق تحديد الفرق الزمني بين التنشيط ونسبة مئوية محددة من إعادة قطبية كل احتمالية الإجراء البصري. يمكن استخدام عدم تجانس APD أو إطالة APD وتقصيرها للتنبؤ بعدم قابلية عدم انتظام ضربات القلب.
   1. لحساب APD في RHYTHM1.2، اختر تحليل البيانات | APD/ خريطة CAT.
   2. حدد وقت البدء ووقت الانتهاء ليشمل إمكانية إجراء كاملة واحدة. تعيين قيمة الحد الأدنى والحد الأقصى لـ APD/CaTD لإزالة أي قيم خارجة (على سبيل المثال، 0 و 1000 مللي ثانية، على التوالي). أدخل إعادة استقطاب النسبة المئوية التي ستحدد APD، على سبيل المثال، 0.8 لـ APD₈₀/CaTD₈₀ أو 0.5 لAPD₅₀/CaTD₅₀.
   3. انقر على حساب APD الإقليمي لتحديد عائد الاستثمار وإنشاء خريطة APD. سيتم عرض متوسط، وسيط، الانحراف المعياري، وعدد وحدات البكسل المضمنة في التحليل في قسم الإحصائيات.
5. ارتفاع الوقت
   ملاحظة: وقت الارتفاع هو معلمة أخرى فيزيائية كهربائية يمكن قياسها من الإشارات الضوئية من آثار الجهد والكالسيوم عابرة. وهو يوفر تقديرًا للفترة التي تستغرقها القنوات الأيونية المزيلة لتحريك إمكانات العمل ، أو المدة التي يستغرقها إطلاق الكالسيوم في السيتوبلازم من التشنج الساركوبلازميك. الوقت ارتفاع بصري ليس بديلا مثاليا لأوقات الارتفاع التي تقاس microelectrodes وقد لا تكون حساسة للتغيرات في إزالة القطب، وذلك لأن إمكانات العمل البصري هي متوسط إمكانات transmembrane العديد من الخلايا. ويمكن أن تؤثر الدقة المكانية والزمنية للنظام أيضا على قيم وقت الارتفاع الضوئي. ومع ذلك، فإنه لا يزال يمكن استخدامها للتنبؤ تغييرات كبيرة في إزالة القطب²⁷.
   1. لتحديد وقت الارتفاع، اختر تحليل البيانات | وقت الصعود.
   2. حدد وقت البدء ووقت الانتهاء لتحديد ضربة أعلى من واحد المحتملة عمل واحد أو عابر الكالسيوم. أدخل قيم Start% و End% (يوصى عادةً بنسبة 10-90% للإشارات غير الصاخبة)، مما يسمح للمستخدم بتحديد أجزاء الإشارة فقط دون تضمين الضوضاء في حالة الإشارات الصاخبة.
   3. انقر فوق حساب لتحديد عائد الاستثمار وتحديد الوسط، المتوسط، الانحراف المعياري، وعدد البيكسلات المضمنة في تحليل وقت الارتفاع.
6. تسوس الكالسيوم
   ملاحظة: بالنسبة لآثار الكالسيوم، يمكن تحديد ثابت الوقت من اضمحلال عابر الكالسيوم. وهذا يسمح لتحليل التغيرات في إزالة أيونات الكالسيوم من السيتوبلازم مرة أخرى إلى ريال.
   1. حدد تحليل البيانات | يتحلل الكالسيوم ويدخل وقت البدء ووقت النهاية ليشمل جزء الاضمحلال بأكمله من إشارة عابرة واحدة الكالسيوم.
   2. انقر فوق حساب Tau لتحديد عائد الاستثمار وتحديد المتوسط، المتوسط، الانحراف المعياري، وعدد البيكسلات المضمنة في تحليل ثابت وقت اضمحلال الكالسيوم.

النتائج

تم جمع شرائح الأعضاء البشرية من البطين الأيسر من قلب الإنسان المانح وفقا للبروتوكول مفصلة أعلاه ويتضح فيالشكل 1. كاميرا مزدوجة نظام رسم الخرائط الضوئية مثل ذلك فيالشكل 2تم استخدامه في تكوين التصوير تستقيم لأداء رسم الخرائط البصرية في وقت واحد من الجهد والك...

Discussion

هنا، ونحن نقدم خطوة بخطوة أساليب للحصول على شرائح القلب قابلة للحياة من القلب العضوب العضوبوق البشرية وتوصيف وظيفيا شرائح باستخدام رسم الخرائط البصرية المزدوجة من إمكانات عبر مومبيبرين والكالسيوم داخل الخلايا. مع الحفاظ على البيئة خارج الخلية والخلايا الأصلية اقتران الخلية، يمكن استخد...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1mL BD Syringe	Thomas Scientific	309597
2,3-butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
6 well culture plates	Corning	3516
Biosafety cabinet	ThermoFisher Scientific	1377
Blebbistatin	Cayman	13186
Bubble Trap	Radnoti	130149
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Corning Cell Strainers	Fisher Scientific	07-201-432
Di-4-ANEPPS	Biotium		stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Dumont #3c Forceps	Fine Science Tools	11231-20
Emission dichroic mirror	Chroma	T630LPXR-UF1
Emission filter (RH237)	Chroma	ET690/50m
Emission Filter (Rhod2AM)	Chroma	ET590/33m
Excitation dichroic mirror	Chroma	T550LPXR-UF1
Excitation Filter	Chroma	ET500/40x
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49A
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Heat exchanger	Radnoti	158821
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Incubator	ThermoFisher Scientific	50145502
Insulin Transferrin Selenium (ITS)	Sigma-Aldrich	I3146
LED excitation light source	Prizmatix	UHP-Mic-LED-520
Magnessium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272
Medium 199	ThermoFisher Scientific	11150059
Micam Ultima L type CMOS camera	Scimedia	N/A
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Pennicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Peristaltic Pump	Cole Parmer	EW-07522-20
Platinum pacing wire	Alfa Aesar	43275
Pluronic F127	ThermoFisher Scientific	P6867	nonionic, surfactant polyol
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Powerlab data acquisition and stimulator	AD Instruments	Powerlab 4/26
RH237	Biotium	61018
Rhod2AM	ThermoFisher Scientific	R1245MP
Rhod-2AM	Invitrogen, Carlsbad, CA
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625
Sterilizer, dry bead	Sigma-Aldrich	Z378550
Stone Oxygen Diffuser	Waterwood	B00O0NUVM0
TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive	gobiomed	AESCULAP
UltraPure Low Melting Point Agarose	Thermo Fisher Scientific	16520100
Ultrasound sonicator		Branson 1800
Vibratome	Campden Instruments	7000 smz