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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zum Schneiden und Kultivieren menschlicher Herzscheiben für präklinische Arzneimitteltests und beschreibt die Verwendung von optischen Kartierungen zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Transmembranspannung und intrazellulären Calciumsignalen aus diesen Scheiben.

Zusammenfassung

Humane Herzscheibenpräparate wurden vor kurzem als Plattform für Studien zur menschlichen Physiologie und Therapietests entwickelt, um die Lücke zwischen tier- und klinischen Studien zu überbrücken. Zahlreiche Tier- und Zellmodelle wurden verwendet, um die Wirkung von Medikamenten zu untersuchen, aber diese Reaktionen unterscheiden sich oft beim Menschen. Menschliche Herzscheiben bieten einen Vorteil für Arzneimitteltests, da sie direkt von lebensfähigen menschlichen Herzen abgeleitet sind. Neben der Erhaltung multizellulärer Strukturen, Zell-Zell-Kopplung und extrazellulärer Matrixumgebungen können menschliche Herzgewebescheiben verwendet werden, um die Wirkung unzähliger Medikamente auf die menschliche Herzphysiologie bei Erwachsenen direkt zu testen. Was dieses Modell von anderen Herzpräparaten wie ganzen Herzen oder Keilen unterscheidet, ist, dass Scheiben längerfristig kulturgemäß kultiviert werden können. Als solche, Herzscheiben ermöglichen die Untersuchung der akuten sowie chronischen Auswirkungen von Medikamenten. Darüber hinaus macht die Fähigkeit, mehrere hundert bis tausend Scheiben von einem einzigen Herzen zu sammeln, dies zu einem Hochdurchsatzmodell, um mehrere Medikamente in unterschiedlichen Konzentrationen und Kombinationen mit anderen Medikamenten gleichzeitig zu testen. Scheiben können aus jeder Region des Herzens zubereitet werden. In diesem Protokoll beschreiben wir die Herstellung von linksventrikulären Scheiben, indem wir Gewebewürfel von der linksventrikulären freien Wand isolieren und sie mit einem hochpräzisen vibrierenden Mikrotom in Scheiben schneiden. Diese Scheiben können dann entweder akuten Experimenten unterzogen werden, um die elektrische Ausgangsfunktion zu messen, oder für chronische Arzneimittelstudien kultiviert werden. Dieses Protokoll beschreibt auch die doppelte optische Kartierung von Herzscheiben für gleichzeitige Aufnahmen von Transmembranpotentialen und intrazellulärer Kalziumdynamik, um die Auswirkungen der untersuchten Medikamente zu bestimmen.

Einleitung

Tiermodelle sind ein wertvolles Werkzeug zum Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der menschlichen Physiologie und Pathophysiologie, sowie eine Plattform für Vortests von Therapien zur Behandlung verschiedener Krankheiten1. Auf der Grundlage dieser Tierstudien wurden große Fortschritte auf dem Gebiet der biomedizinischen Forschung erzielt2. Es bestehen jedoch erhebliche Unterschiede zwischen menschlichen und tierischen Physiologien, einschließlich Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Schafen, Schweinen und Hunden3,4. Infolgedessen gab es zahlreiche Arzneimittel-, Gen- und Zelltherapien, die während der Tierversuche vielversprechend waren, aber den Ergebnissen in klinischen Studien nicht gerecht wurden5. Um diese Lücke zu überbrücken, wurden isolierte Herzmyozyten und vom Menschen induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) als Modelle entwickelt, um die Reaktion der menschlichen Physiologie auf verschiedene Medikamente und Krankheiten zu testen6. Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten sind weit verbreitet in Organ-on-a-Chip-Systemen als Ersatz des Herzens6,7,8verwendet worden. Die Nützlichkeit von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten (iPSC-CMs) wird jedoch durch ihren relativ unreifen Phänotyp und die mangelnde Repräsentation der Kardiomyozyten-Subpopulation behindert; Das reife Myokard ist eine komplexe Struktur, die aus mehreren koexistierenden Zelltypen wie Fibroblasten, Neuronen, Makrophagen und Endothelzellen besteht. Auf der anderen Seite sind isolierte menschliche Kardiomyozyten elektrisch ausgereift, und verschiedene Kardiomyozytensubpopulationen können durch Änderung der Kultivierungsparameter erhalten werden9. Dennoch weisen diese Myozyten in der Regel veränderte Wirkungspotentialmorphologien auf, da es an Zell-Zell-Kopplung, schneller Entdifferenzierung und dem Auftreten proarrhythmischen Verhaltens in vitro10,11fehlt. Einige der Einschränkungen wurden durch 3D-Zellkulturmodelle von iPSC-CMs und Herzmyozyten behoben. Diese Modelle, zu denen Sphäroide, Hydrogelgerüste, gekapselte 3D-Kulturen, technische Herzgewebe (EHTs) und Herz-auf-ein-Chip-Systeme gehören, verwenden mehrere Herzzellpopulationen wie Kardiomyozyten, Fibroblasten und Endothelzellen. Sie bauen sich entweder selbst zusammen oder montieren sich entlang eines Gerüstes zu 3D-Strukturen, und einige reproduzieren sogar die komplexe anisotrope Natur des Myokards. Diese Modelle haben Berichten zufolge Zellen von reifen Phänotypen, kontraktilen Eigenschaften und molekularen Profilen ähnlich wie Herzgewebe. Das Heart-on-a-Chip-System ermöglicht auch die Untersuchung systemischer Wirkungen in Medikamententests und Krankheitsmodellen. In vitro zellbasierten Modellen fehlt jedoch die native extrazelluläre Matrix und kann daher die Elektrophysiologie auf Organebene nicht genau imitieren. Menschliche Herzscheiben hingegen haben eine intakte extrazelluläre Matrix und native Zell-zu-Zell-Kontakte, was sie für eine genauere Untersuchung arrhythmogener Eigenschaften des menschlichen Myokards nützlich macht.

Forscher haben menschliche kardiale organotypische Scheiben als physiologische präklinische Plattform für akute und chronische Arzneimitteltests entwickelt und zur Untersuchung der Herzelektrophysiologie und der Herzkrankheitsprogression12,13,14,15,16,17,18,19. Im Vergleich zu iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten replizieren menschliche Herzscheiben die erwachsene menschliche Herzelektrophysiologie mit einem reifen Kardiomyozyten-Phänotyp getreuer. Im Vergleich zu isolierten menschlichen Kardiomyozyten weisen Herzscheiben aufgrund der gut erhaltenen Zell-Zell-Kopplung und der intrinsischen Existenz ihrer nativen intra- und extrazellulären Umgebungen physiologische Wirkungspotenziale auf.

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Erzeugung menschlicher Herzscheiben aus ganzen Spenderherzen, die Durchführung akuter (d. h. stundenlanger) und chronischer (d. h. tagelanger) Studien zur Erprobung der Kardialelektrophysiologie-Parameter mittels optischer Kartierung. Während dieses Protokoll nur die Verwendung des linksventrikulären Gewebes (LV) beschreibt, wurde es erfolgreich auf andere Regionen des Herzens sowie andere Arten wie Mäuse, Ratten, Meerschweinchen und Schweine14,20,21,22angewendet. Unser Labor verwendet ganze menschliche Spenderherzen, die in den letzten 5 Jahren für eine Transplantation abgelehnt wurden, aber es ist möglich, dass dieselben Verfahren an allen Spenderherzprobengeweben durchgeführt werden, die auf alternative Weise gewonnen werden (z. B. linksventrikuläre Hilfsmittel [LVAD]-Implantationen, Biopsien, Myektomien), solange das Gewebe in Würfel geschnitten werden kann. Optisches Mapping wird in dieser Studie aufgrund seiner Fähigkeit verwendet, optische Aktionspotentiale und Kalziumtransienten mit hoher räumlicher (100 x 100 Pixel) und zeitlicher Auflösung (>1.000 Frames/s) gleichzeitig abzubilden. Alternative Methoden können auch verwendet werden, wie Multielektroden-Arrays (MEAs) oder Mikroelektroden, aber diese Techniken sind durch ihre relativ geringen räumlichen Auflösungen begrenzt. Darüber hinaus wurden MEAs für die Verwendung mit Zellkulturen entwickelt, und scharfe Mikroelektroden sind einfacher für die Verwendung mit ganzen Herzen oder großen Gewebekeilen zu verwalten.

Ziel des Artikels ist es, mehr Forschern die Verwendung menschlicher Herzgewebe für die Kardialelektrophysiologie zu ermöglichen. Es sollte beachtet werden, dass die in diesem Artikel beschriebene Technologie relativ einfach und vorteilhaft für Kurzzeitstudien ist (in der Größenordnung von mehreren Stunden bis Tagen). Mehr physiologische biomimetische Kultur für längerfristige Studien (in der Größenordnung von Wochen) wurde diskutiert und beschrieben durch eine Reihe von anderen Studien12,18,23. Elektrische Stimulation, mechanische Belastung und Gewebedehnung sind vorteilhafte Konditionierungsmechanismen, die helfen können, den Beginn der In-vitro-Gewebe-Remodellierung12,18,23zu begrenzen.

Protokoll

Alle beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Leitlinien für das Wohlergehen der Menschen durchgeführt. Die Forschung wurde vom Institution Review Board (IRB) an der George Washington University genehmigt.

HINWEIS: Spender menschliche Herzen wurden von Washington Regional Transplant Community als deidentifiziertes entsorgtes Gewebe mit Genehmigung der George Washington University IRB erworben. Explantierte Herzen werden kardioplegisch verhaftet, indem das Herz mit einer Lösung der eiskalten Kardioplegie gespült wird (das Blut wurde dabei aus dem Herzen entfernt) und unter normalen Organtransplantationsbedingungen ins Labor gebracht.

1. Vorbereitung von Lösungen

  1. Für jedes Herz machen 4 L kardioplegische Lösung (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 1.2 mM CaCl2; pH = 7.4). 3 L bei 4 °C und die restlichen 1 L bei -20 °C lagern.
    HINWEIS: Diese Lösung kann bis zu mehreren Tage im Voraus hergestellt werden.
  2. 1 L je Tyrodes Schneidlösung frisch zubereiten (140 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 10 mM Glukose, 10 mM HEPES, 10 mM 2,3-Butandionmonoxim [BDM]; pH = 7,4) und Tyrodes Rückgewinnungslösung (140 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 10 mM Glukose, 10 mM HEPES, 10 mM BDM; pH = 7,4).
    HINWEIS: Sowohl die Schneid- als auch die Rückgewinnungslösungen sollten am Tag des Experiments hergestellt werden und bei 4 °C gelagert werden.
  3. Bereiten Sie Lagerlösungen der fluoreszierenden Farbstoffe vor. Den spannungsempfindlichen Farbstoff RH237 bei 1,25 mg/ml in Dimethylsulfoxid (DMSO) rekonstituieren und in 30 L-Aliquots bei 4 °C lagern. Stellen Sie den Calciumindikator Rhod-2AM bei 1 mg/ml in DMSO wieder her. In 30 L-Aliquots bei -20 °C lagern.
    HINWEIS: Di-4-ANEPPS (Lagerlösung bei 1,25 mg/ml in DMSO) kann allein in Experimenten zur Einzelkamera-Bildgebung des Transmembranpotentials eingesetzt werden.
    1. Beschallen Sie die Farbstoffe vor Beginn des Experiments mit einem Ultraschallbeschallgerät für mindestens 10 min und verdünnen Sie jeden Aliquot von Fluoreszenzfarbstoffen in 1 ml der Rückgewinnungslösung. Pluronic F-127 (Materialtabelle) zu Rhod-2AM im Verhältnis 1:1 hinzufügen, bevor sie in der Rückgewinnungslösung verdünnt werden.
  4. Bereiten Sie eine Stammlösung des Anregungs-Kontraktions-Entkopplers Blebbistatin bei 2 mg/ml Lösung in DMSO vor. In Aliquots bei -20 °C lagern. Verdünnen Sie bei optischen Kartierungsexperimenten die Vorratslösung von Blebbistatin in der Rückgewinnungslösung des Tyrode auf eine Arbeitskonzentration von 5 bis 10 m.
  5. Machen Sie frische Kultur Medium durch DieErgänzung Medium 199 mit 2% Penicillin-Streptomycin, 1x Insulin-Transferrin-Selen (ITS) flüssige Medien Ergänzung, und 10 mM BDM. Filtern Sie das Medium mit einem 0,2 m sterilen Filter.
    HINWEIS: Bei pharmakologischen Störungsstudien können Medikamente direkt dem Kulturmedium zugesetzt werden. Das Kulturmedium kann bei 37 °C gelagert werden.
  6. Machen Sie ein 4% Agarose-Gel für die Gewebemontage, indem Sie Niedrigschmelzpunkt-Agarose in destilliertem Wasser auflösen und das Gemisch in einer Mikrowelle erwärmen, bis es vollständig gelöst ist. Die Agarose in einer Petrischale mit einer Dicke von 5 mm aushärten und bei 4 °C lagern.

2. Ausrüstungsaufbau

  1. Vibrierende Mikrotome-Setup
    1. Kalibrieren Sie das vibrierende Mikrotom vor jedem Experiment.
      1. Mit einem hochpräzisen vibrierenden Mikrotom (Tisch aus Materialien)laden Sie eine Keramikschneideklinge in den Halter und befestigen Sie die mit dem vibrierenden Mikrotom gelieferte Kalibriervorrichtung. Wählen Sie die Klingeneinstellungsoption aus dem Menü und wählen Sie Keramik für den Blatttyp.
      2. Wählen Sie die Vibrationsoption aus, überprüfen Sie den Wert der Z-Achse. Wenn dieser Wert <1 m ist, beenden Sie das Kalibrierungsmenü. Wenn nicht, stellen Sie die Kalibrierschraube, die an der Oberseite des Vibrationskopfes befestigt ist, fein ein und wählen Sie die Vibrationsoption aus. Wiederholen Sie dies so oft wie nötig, um die Z-Achse auf <1 m festzulegen.
    2. Stellen Sie die Vibramme-Einstellungen auf 400 m Schnittdicke, 0,02 mm/s Vorlaufgeschwindigkeit für Vorhofgewebe und 0,04 mm/s Vorschussgeschwindigkeit für ventrikuläres Gewebe, 2 mm horizontale Schwingungsamplitude und 80 Hz Vibrationsfrequenz ein.
      HINWEIS: Während 400 m die empfohlene Dicke ist, um Zellschäden an den schnittten Oberflächen der Scheibe zu kompensieren, können auch dünnere Scheiben vorbereitet werden. Da die Sauerstoffdiffusionsgrenze bei etwa 150 m liegt, werden häufig Scheiben um 300 mverwendet 14,17,18,24.
    3. Füllen Sie das Bad des vibrierenden Mikrotome mit Schneidlösung bei 4 °C und halten Sie die Temperatur, indem Sie die Außenseite des Bades mit Eis umgeben, nach Bedarf während des gesamten Schneidprotokolls auffüllen. Kontinuierlich sauerstoffhaltige die Schneidlösung im Bad durch Sprudeln mit 100% Sauerstoff während des Schneidens.
    4. Richten Sie eine zweite Schale mit so vielen 100 m Nylon-Netzzellensieben und Mesh-Scheiben ein (ein Zellsieb pro Scheibe). Füllen Sie diese Schale mit Rückgewinnungslösung und sauerstoffisieren Sie es durch Sprudeln mit 100% Sauerstoff bei Raumtemperatur (RT).
      HINWEIS: Diese Lösung wird während des Experiments bei RT beibehalten.
  2. Optische S-Zuordnungseinrichtung
    HINWEIS: Eine ausführlichere Beschreibung des optischen Kartierungssystems finden Sie in früheren Veröffentlichungen16,25,26.
    1. Befestigen Sie ein Gewebebad mit Polydimethylsiloxan (PDMS) Gelschicht an der Unterseite (um die Scheiben zu fixieren) an einem Perfusionssystem. 1 L der Rückgewinnungslösung bei 37 °C zirkulieren und mit 100% Sauerstoff mit Sauerstoff durch das Perfusionssystem mit einer Durchflussrate schnell genug zirkulieren, um die Temperatur und klare Ansammlung von Badperfusate aufrechtzuerhalten.
    2. Passen Sie den Fokus und die Ausrichtung der beiden CMOS-Kameras (Materialtabelle) mit einem Ziel an.
      HINWEIS: Weitere Einzelheiten zur Ausrichtung finden Sie in früheren Studien26.
    3. Verwenden Sie eine grüne LED-Lichtquelle mit einer Wellenlänge von 520 x 5 nm, um die spannungsempfindlichen und Kalzium-Indikatorfarbstoffe gleichzeitig zu erregen.
      HINWEIS: Die Anregungslichtquelle wird am Anregungsfilterwürfel des optischen Kartierungssystems befestigt und von einem 550 nm dichroitischen Spiegel für epizentrische Beleuchtung reflektiert. Das emittierte Licht wird von einem 1x-Objektiv erfasst und durch einen zweiten dichroitischen Spiegel bei 630 nm in Spannungs- und Calciumkomponenten geteilt, bevor es von 690 x 50 nm bzw. 590 x 33 nm Filtern gefiltert und von den beiden Kameras aufgezeichnet wird.

3. Slicing-Protokoll

  1. Wenn Sie bereit für Gewebesektion und Experimente sind, bereiten Sie ein Bad mit eiskalter Kardioplegie vor, indem Sie gefrorene und flüssige Kardioplegie mischen. Halten Sie das Herz im Cardioplegiebad unter Wasser, bis gewebesammeln zum Schneiden (Abbildung 1A).
  2. Kleben Sie das vorgefertigte Agarose-Gel an die Rückseite der Metallgewebehalter des Vibratome.
  3. Identifizieren Sie die linksventrikuläre freie Wand und schneiden Sie 1 cm3 Gewebewürfel in kalter kardioplegischer Lösung. Dann die Gewebeblöcke schnell auf die Metallgewebehalter mit den nach oben gerichteten Endkörperoberflächen montieren und mit topischem Hautkleber am Agarose-Gel befestigen (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Der ausgewählte Gewebebereich sollte sich von großen Blutgefäßen entfernen, um Löcher in den Scheiben zu vermeiden. Die Schnittebene ist ungefähr parallel zur Faserausrichtung in der Endokardschicht (Abbildung 1E) und die Schnittebene könnte aufgrund der Rotationsanisotropie in einer tieferen Schicht der LV-Wand in einem leichten Winkel liegen. Um den Durchsatz zu erhöhen, können bis zu zwei Gewebeblöcke nebeneinander auf demselben Halter montiert werden.
  4. Die Metallhalter in das Vibrammebad mit der eiskalten sauerstoffhaltigen Schneidlösung füllen. Stellen Sie sicher, dass die Gewebewürfel vollständig untergetaucht sind.
  5. Bewegen Sie die Klinge an die vordere Kante des Gewebes und schalten Sie das Vibratom ein, um mit dem Schneiden mit den voreingestellten Parametern zu beginnen. Entsorgen Sie die ersten Scheiben, bis die Klinge über die Trabeculae hinaus in das glatte Endkörpergewebe reicht.
  6. Nachdem jede Scheibe geschnitten wurde, übertragen Sie die Scheibe vorsichtig in ein sauerstoffreiches (100% O2) Bad von Tyrodes Erholungslösung bei RT. Legen Sie jede Scheibe vorsichtig in einzelne 100 m Nylon-Netzzellensiebe und Abdeckung mit meshed Scheiben, um die Gewebescheiben vor Demcurling zu halten (Abbildung 1C). Halten Sie Slices in der Wiederherstellungslösung für mindestens 20 min.
    HINWEIS: Scheiben können unter diesen Bedingungen bis zu 3 x 4 h ohne schädliche elektrophysiologische Wirkungen im Bad aufbewahrt werden.

4. Slice-Kultivierung unter statischen Bedingungen

HINWEIS: Um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination zu minimieren, sterilisieren Sie die Zangen vor jedem Transferschritt mit einem Perlensterilisator.

  1. Wenn Sie bereit zur Kultur sind, übertragen Sie jede Scheibe sorgfältig in die einzelnen Brunnen einer 6-Well-Platte, die mit steriler Phosphat-gepufferter Kochsaline (PBS) gefüllt ist. Schaukeln Sie die Brunnenplatte sanft, um die Scheiben der Rückgewinnungslösung zu spülen.
    HINWEIS: Von diesem Punkt an sollten die Scheiben nur noch in einer BSL2-Laminar-Flow-Kulturhaube freigelegt werden, und sterile Zangen sollten verwendet werden, um das Gewebe zu behandeln.
  2. Übertragen Sie die Scheiben in Brunnen von frischen PBS gründlich spülen und sterilisieren die Scheiben für Kultur. Führen Sie diesen Waschschritt 3x durch, um sicherzustellen, dass die Wiederherstellungslösung vollständig aus den Scheiben entfernt wird.
  3. Übertragen Sie die Scheiben in einzelne Brunnen einer 6-Well-Platte gefüllt mit 3 ml vorgewärmten (37 °C) Kulturmedium (mit oder ohne Drogen, Abbildung 1D). Legen Sie Platten bei 20 Umdrehungen pro Minute in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 30%O2 und 5%CO2auf. Aspirieren und ersetzen Kulturmedium alle 48 h.

5. Funktionelle Charakterisierung, optisches Mapping

  1. Für optische Kartierungsstudien entweder unmittelbar nach dem Schneiden oder nach der Kultivierung, übertragen Sie vorsichtig die Scheibe des Interesses auf das Gewebebad des Perfusionssystems bei 37 °C mit 100% O2 in Tyrodes Erholungslösung, und fixieren Sie die vier Ecken auf die PDMS-Gelschicht, während Sie minimale Dehnung auftragen (d. h. gerade genug, um die Scheibe unter Strömungsbedingungen nicht leicht zu bewegen). Lassen Sie die Scheiben in diesem Bad mit zirkulierender Rückgewinnungslösung für ca. 10 min ruhen.
  2. Fügen Sie dem Reservoir, das die Rückgewinnungslösung enthält, 0,3 bis 0,5 ml des verdünnten Blebbistatins hinzu. Die Scheibe ca. 10 min mit Blebbistatin brüten lassen.
  3. Rekonstituieren Sie 30 l des spannungsempfindlichen Farbstoffs RH237 in 1 ml Rückgewinnungslösung bei 37 °C. Schalten Sie die Pumpen aus und laden Sie langsam 0,2,0,3 ml Arbeitsfarbstofflösung über einen Zeitraum von 30 s auf die Oberfläche der Scheibe. Lassen Sie die Scheibe im Farbstoff mit den Pumpen aus für einen Zeitraum von bis zu 90 s brüten, dann schalten Sie die Pumpen wieder ein, damit überschüssiger Farbstoff ausgewaschen werden kann.
    HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, den Farbstoff gleichmäßig auf die gesamte Scheibe aufzutragen. Darüber hinaus ist eine sehr langsame Farbanwendung entscheidend, um zu verhindern, dass der Farbstoff von der Scheibe wegschwimmt.
  4. Wiederholen Sie Schritt 5.3, um den Calciumindikator Rhod-2AM neu zu konstituieren und auf die Scheibe zu laden.
  5. Konzentrieren Sie die Kameras auf die Scheibe, indem Sie den Abstand der Scheibe vom Objektiv anpassen.
  6. Positionieren Sie eine bipolare Platin-Iridium-Pacing-Elektrode so, dass ihre Spitze mit der Mitte der Scheibe in Kontakt ist, und wenden Sie Temporeize von erhöhter Amplitude an, um die minimale Temposchwelle zu bestimmen, die erforderlich ist, um eine elektrische Reaktion auszulösen. Beschleunigen Sie die Scheibe bei 1 Hz mit einer Pulsbreite von 2 ms bei 1,5-facher Amplitude des vorgegebenen Temposchwelles. Legen Sie einen Deckelüberschlag über die Gewebescheibe.
  7. Beleuchten Sie die Scheibe mit einer 520 x 5 nm LED-Anregungslichtquelle. Zeichnen Sie die emittierten Spannungs- und Kalziumsignale mit den beiden CMOS-Kameras mit 1.000 Frames/s auf.
  8. Überprüfen Sie die Aufzeichnung auf eine gute Signalqualität und unterdrückte Bewegungsartefakte (Abbildung 1F). Fügen Sie dem Reservoir in Schritten von 0,1 ml mehr Blebbistatin hinzu, bis die Bewegung keine Artefakte mehr in den optischen Signalen erzeugt. Fügen Sie bei Bedarf mehr Farbstoff hinzu, um die Signalqualität zu verbessern.
    HINWEIS: Eine gute Signalqualität bezieht sich auf qualitativ bewertete große Signalamplitude und geringehintergrundrauschen in den aufgezeichneten optischen Signalen.

6. Datenverarbeitung mit RHYTHM1.2

HINWEIS: RHYTHM1.2 ist eine MATLAB-basierte Benutzeroberfläche, die zum Anzeigen, Zustand enden und Analysieren optischer Zuordnungsdaten verwendet wird, die von optischen Kartensystemen mit Einzel- oder Zweikamerakameras erfasst wurden (Abbildung 3). Es wird in Verbindung mit dem Bildgebungssystem verwendet.

  1. Laden von Datendateien
    1. Laden Sie die Datendateien in RHYTHM1.2, indem Sie eines der vier Anzeigefenster auf dem Bildschirm auswählen und die Schaltflächen Verzeichnis auswählen und laden verwenden.
    2. Das Programm fordert den Benutzer auf, Kamera 1 oder Camera 2 Daten für die Dual-Spannungs- und Kalzium-Aufnahmen auszuwählen. Wählen Sie Kamera 1 für das Spannungssignal.
    3. Wiederholen Sie den Vorgang, um das Calciumsignal (Kamera 2) auf eines der angrenzenden Anzeigefenster zu laden.
    4. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Dual Data Linking zwischen den beiden ausgewählten Anzeigefenstern, um die beiden Anzeigefenster zu verknüpfen, da die beiden Datensätze aus derselben Region auf dem Slice aufgezeichnet werden.
      HINWEIS: Wenn das gleiche Sichtfeld beibehalten wird, kann diese Funktion verwendet werden, um zwei Bilder zu verknüpfen, die zu separaten Zeitpunkten erhalten wurden, um die Zeitreaktion in der Elektrophysiologie des untersuchten Arzneimittels zu sehen. Durch Doppelklicken auf ein Anzeigefenster kann dieses Fenster maximiert werden, um eine einfache Analyse zu ermöglichen.
  2. Signalkonditionierung
    1. Datenanalyse auswählen | Bedingungsparameter zur Konditionierung der Spannungs- und Calcium-optischen Kartierungsdaten vor der weiteren Analyse.
    2. Verwenden Sie die Funktion"Hintergrund entfernen",um Pixel zu entfernen, die kein Signal enthalten, das auf einem Fluoreszenzintensitätsschwellenwert (Hintergrund [BG]-Schwellenwert) und dem Grad der Pixelclustering (Anregungsschwelle [EX]) basiert.
    3. Führen Sie die räumliche Mittelung der optischen Zuordnungsdaten mithilfe der Funktion"Bin" durch, um die Signalqualität zu verbessern.
    4. Filtern Sie die optischen Zuordnungsdaten mithilfe eines Bandpassfilters mit der Funktion "Filter".
    5. Verwenden Sie die "Drift"-Funktion, um die Basisdrift im optischen Mapping-Signal zu entfernen.
    6. Normalisieren Sie mit der Funktion"Normalisieren" die optischen Zuordnungsdaten von jedem Pixel, um eine maximale Amplitude von 1 zu haben.
    7. Verwenden Sie die Funktion"Inverses Signal", um die Kalziumspuren für die weitere Analyse umzukehren.
    8. Klicken Sie auf "Wellen anzeigen", um die konditionierte Ablaufverfolgung von einer beliebigen Stelle im Anzeigefenster auszuwählen und im Wellenformfenster zu zeichnen. Passen Sie die Signalkonditionierungsparameter an, um ein optimales Aktionspotenzial und Kalziumtransientenspuren zu erhalten.
  3. Berechnung der Leitungsgeschwindigkeit (CV)
    HINWEIS: Die Aktivierungszeit ist definiert als die Zeit der maximalen Ableitung des optischen Signals (dF/dtmax).
    1. Datenanalyse auswählen | Aktivierungszuordnung und geben Sie eine Start- und Endzeit ein, um ein einzelnes Aktionspotenzial in der Ablaufverfolgung zu umfassen. Drücken Sie Berechnen und wählen Sie den Bereich von Interesse (ROI), um die Aktivierungskarte der ausgewählten Region anzuzeigen (Abbildung 1G).
    2. Datenanalyse auswählen | CV Map und ähnlich, wählen Sie die Startzeit und Endzeit. Geben Sie die Interpixelauflösungswerte basierend auf dem Setup ein.
      HINWEIS: Bei 1x Vergrößerungssystemen beträgt die Interpixelauflösung 0,1 mm in X- und Y-Richtung.
    3. Drücken Sie die Eingabetaste Vec. Karte-Schaltfläche, um einen ROI auszuwählen und CV-Vektoren innerhalb dieser Region anzuzeigen. Der Mittelwert, der Median, die Standardabweichung und die Anzahl der in die Analyse einbezogenen Vektoren sowie der durchschnittliche Ausbreitungswinkel der CV-Vektoren in der ausgewählten Region werden berechnet und im Abschnitt Statistik angezeigt.
    4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Linie zeichnen, um eine Linie entlang einer bestimmten Ausbreitungsrichtung zu zeichnen. Alle CV-Vektoren in dieser Richtung werden ausgewählt. Klicken Sie auf CV berechnen, um nur die ausgewählten CV-Vektoren zu verwenden, um die Statistiken zu berechnen, die im Abschnitt Statistik angezeigt werden.
  4. Berechnung der Aktionspotentialdauer (APD) und der Kalziumtransientendauer (CaTD)
    HINWEIS: Die APD ist ein weiterer grundlegender Parameter der Herzelektrophysiologie. APD-Karten können generiert werden, indem die Zeitdifferenz zwischen der Aktivierung und einem bestimmten Prozentsatz der Repolarisation jedes optischen Aktionspotenzials bestimmt wird. APD-Heterogenität oder APD-Verlängerung und Verkürzung können verwendet werden, um die Arrhythmie-Empfindlichkeit vorherzusagen.
    1. Um APD in RHYTHM1.2 zu berechnen, wählen Sie Datenanalyse | APD/CaT Karte.
    2. Wählen Sie start- und endzeit, um ein vollständiges Aktionspotenzial zu umfassen. Legen Sie einen minimalen und maximalen Wert von APD/CaTD fest, um Ausreißer zu entfernen (z. B. 0 bzw. 1.000 ms). Geben Sie die prozentuale Repolarisation ein, die die APD bestimmt, z. B. 0,8 für APD80/CaTD80 oder 0,5 für APD50/CaTD50.
    3. Klicken Sie auf Regional APD Calc, um einen ROI auszuwählen und die APD-Karte zu generieren. Der Mittelwert, der Median, die Standardabweichung und die Anzahl der in der Analyse enthaltenen Pixel werden im Abschnitt Statistik angezeigt.
  5. Anstieg der Zeit
    HINWEIS: Die Anstiegszeit ist ein weiterer elektrophysiologischer Parameter, der anhand optischer Signale von Spannungs- und Kalziumtransientenspuren gemessen werden kann. Es liefert eine Schätzung, wie lange es dauert, bis die depolarisierenden Ionenkanäle ein Aktionspotential auslösen, oder wie lange es dauert, bis Kalzium aus dem sarkoplasmischen Retikulum in das Zytoplasma freigesetzt wird. Optische Anstiegszeiten sind kein perfekter Ersatz für Steigzeiten, die von Mikroelektroden gemessen werden, und sind möglicherweise nicht so empfindlich gegenüber Veränderungen der Depolarisation, da optische Wirkungspotentiale ein Durchschnitt des Transmembranpotenzials vieler Zellen sind. Die räumliche und zeitliche Auflösung des Systems kann sich auch auf optische Anstiegszeitwerte auswirken. Es kann jedoch immer noch verwendet werden, um große Veränderungen in der Depolarisation vorherzusagen27.
    1. Um die Anstiegszeit zu bestimmen, wählen Sie Datenanalyse | Aufstiegszeit.
    2. Wählen Sie Startzeit und Endzeit aus, um den Aufschlag eines einzelnen Aktionspotentials oder Kalziumtransienten auszuwählen. Geben Sie die Werte Start% und End% (in der Regel 10–90 % wird für nicht laute Signale empfohlen) ein, wodurch der Benutzer nur die Teile des Signals auswählen kann, ohne rauschend bei lauten Signalen einzuschließen.
    3. Klicken Sie auf Berechnen, um den ROI auszuwählen und den Mittelwert, den Median, die Standardabweichung und die Anzahl der Pixel zu bestimmen, die in der Analyse der Anstiegszeit enthalten sind.
  6. Calciumzerfall
    HINWEIS: Bei Kalziumspuren kann die Zeitkonstante des Zerfalls des Kalziumtransienten bestimmt werden. Dies ermöglicht die Analyse von Veränderungen bei der Entfernung von Calciumionen aus dem Zytoplasma zurück in die SR.
    1. Datenanalyse auswählen | Calcium Decay und geben Sie die Start- und Endzeit ein, um den gesamten Zerfallsanteil eines einzelnen transienten Calciumsignals zu umfassen.
    2. Klicken Sie auf Tau berechnen, um den ROI auszuwählen und den Mittelwert, den Median, die Standardabweichung und die Anzahl der Pixel zu bestimmen, die in der Analyse der Kalziumzerfallszeitkonstante enthalten sind.

Ergebnisse

Menschliche organotypische Scheiben wurden aus der linken Herzkammer eines Spenders menschliches Herz gemäß dem oben beschriebenen Protokoll gesammelt und inAbbildung 1. Ein optisches Kartensystem mit zwei Kameras wie inAbbildung 2wurde in der aufrechten Bildgebungskonfiguration verwendet, um nach Abschluss des Schneidprotokolls eine simultane optische Kartierung von Spannung und Kalzium etwa 1 h durchzuführen. Die Daten wurden mit RHYTHM1.2 (

Diskussion

Hier stellen wir Schritt-für-Schritt-Methoden vor, um lebensfähige Herzscheiben aus kardioplegisch verhafteten menschlichen Herzen zu erhalten und die Scheiben funktionell mit Hilfe der doppelten optischen Kartierung von Transmembranpotenzial und intrazellulärem Kalzium zu charakterisieren. Mit einer erhaltenen extrazellulären Umgebung und nativer Zell-Zell-Kopplung können menschliche Herzscheiben als genaues Modell des menschlichen Herzens für grundlegende wissenschaftliche Entdeckungen und für Wirksamkeits- und ...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Finanzierung durch die NIH (Grants R21 EB023106, R44 HL139248 und R01 HL126802), durch die Leducq Foundation (Projekt RHYTHM) und ein American Heart Association Postdoctoral Fellowship (19POST34370122) werden dankbar gewürdigt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1mL BD SyringeThomas Scientific309597
2,3-butanedione monoximeSigma-AldrichB0753
6 well culture platesCorning3516
Biosafety cabinetThermoFisher Scientific1377
BlebbistatinCayman13186
Bubble TrapRadnoti130149
Calcium chlorideSigma-AldrichC1016
Corning Cell StrainersFisher Scientific07-201-432
Di-4-ANEPPSBiotiumstock solution at 1.25 mg/mL in DMSO
DMSOSigma-AldrichD2650
Dumont #3c ForcepsFine Science Tools11231-20
Emission dichroic mirrorChromaT630LPXR-UF1
Emission filter (RH237)ChromaET690/50m
Emission Filter (Rhod2AM)ChromaET590/33m
Excitation dichroic mirrorChromaT550LPXR-UF1
Excitation FilterChromaET500/40x
Falcon 50mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-959-49A
GlucoseSigma-AldrichG8270
Heat exchangerRadnoti158821
HEPESSigma-AldrichH3375
IncubatorThermoFisher Scientific50145502
Insulin Transferrin Selenium (ITS)Sigma-AldrichI3146
LED excitation light sourcePrizmatixUHP-Mic-LED-520
Magnessium chloride hexahydrateSigma-AldrichM9272
Medium 199ThermoFisher Scientific11150059
Micam Ultima L type CMOS cameraScimediaN/A
Minutien PinsFine Science Tools26002-10
Pennicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333
Peristaltic PumpCole ParmerEW-07522-20
Platinum pacing wireAlfa Aesar43275
Pluronic F127ThermoFisher ScientificP6867nonionic, surfactant polyol
Potassium chlorideSigma-AldrichP3911
Powerlab data acquisition and stimulatorAD InstrumentsPowerlab 4/26
RH237Biotium61018
Rhod2AMThermoFisher ScientificR1245MP
Rhod-2AMInvitrogen, Carlsbad, CA
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014
Sodium chlorideSigma-AldrichS9625
Sterilizer, dry beadSigma-AldrichZ378550
Stone Oxygen DiffuserWaterwoodB00O0NUVM0
TissueSeal - Histoacryl Topical Skin AdhesivegobiomedAESCULAP
UltraPure Low Melting Point AgaroseThermo Fisher Scientific16520100
Ultrasound sonicatorBranson 1800
VibratomeCampden Instruments7000 smz

Referenzen

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