Valutazione elettrofisiologia cardiaca preclinica mediante mappatura ottica a doppia tensione e calcio delle fette cardiache di organitypica umana

Riepilogo

Questo protocollo descrive la procedura per sezionare e coltivare fette cardiache umane per test preclinici sui farmaci e descrive in dettaglio l'uso della mappatura ottica per la registrazione simultanea della tensione transmembrana e dei segnali di calcio intracellulare da queste fette.

Abstract

I preparati per fetta cardiaca umana sono stati recentemente sviluppati come piattaforma per gli studi di fisiologia umana e i test terapeutici per colmare il divario tra gli studi sugli animali e quelli clinici. Numerosi modelli animali e cellulari sono stati utilizzati per esaminare gli effetti dei farmaci, ma queste risposte spesso differiscono negli esseri umani. Le fette cardiache umane offrono un vantaggio per i test antidroga in quanto sono direttamente derivate da cuori umani vitali. Oltre ad aver conservato strutture multicellulari, accoppiamento cellulare e ambienti a matrice extracellulare, le fette di tessuto cardiaco umano possono essere utilizzate per testare direttamente l'effetto di innumerevoli farmaci sulla fisiologia cardiaca umana adulta. Ciò che distingue questo modello da altre preparazioni cardiache, come cuori interi o cunei, è che le fette possono essere sottoposte a una cultura a lungo termine. Come tale, fette cardiache consentono di studiare gli effetti acuti e cronici dei farmaci. Inoltre, la capacità di raccogliere diverse centinaia o mille fette da un solo cuore rende questo un modello ad alto throughput per testare diversi farmaci a concentrazioni diverse e combinazioni con altri farmaci allo stesso tempo. Le fette possono essere preparate da qualsiasi regione del cuore. In questo protocollo, descriviamo la preparazione di fette ventricolari a sinistra isolando i cubi di tessuto dalla parete libera ventricolare sinistra e sezionandoli a fette utilizzando un microtoma vibrante di alta precisione. Queste fette possono quindi essere sottoposte a esperimenti acuti per misurare la funzione elettrofisiologica cardiaca di base o coltivate per studi sui farmaci cronici. Questo protocollo descrive anche la doppia mappatura ottica delle fette cardiache per registrazioni simultanee di potenziali transmembrani e dinamiche intracellulari del calcio per determinare gli effetti dei farmaci studiati.

Introduzione

I modelli animali sono stati un valido strumento utilizzato per comprendere i meccanismi alla base della fisiologia e della fisiopatologia umana, nonché una piattaforma per la sperimentazione preliminare delle terapie per il trattamento di varie malattie¹. Sono stati compiuti grandi passi avanti nel campo della ricerca biomedica basata su questi studi sugli animali². Tuttavia, esistono differenze significative tra le specie tra le fisiologie umane e animali, tra cui topi, ratti, porcellini d'India, conigli, pecore, maiali e cani^3,4. Di conseguenza, ci sono state numerose terapie farmacologiche, geniche e cellulari che hanno mostrato promessa durante la fase di sperimentazione animale, ma non sono riuscite a vivere fino ai risultati negli studi clinici⁵. Per colmare questa lacuna, sono stati sviluppati come modelli per colmare la risposta della fisiologia umana a vari farmaci e malattie a vari farmaci e malattie^indottedall'uomo. I cardiomiociti derivati dalle cellule staminali sono stati ampiamente utilizzati nei sistemi organo-su-chip come surrogato del cuore^6,7,8. Tuttavia, l'utilità dei cardiomiociti derivati da iPSC (iPSC-CMs) è ostacolata dal loro fenotipo relativamente immaturo e dalla mancanza di rappresentazione della sottopopolazione cardiomiocita; il miocardio maturo è una struttura complessa composta da diversi tipi di cellule coesistenti come fibroblasti, neuroni, macrofagi e cellule endoteliche. D'altra parte, i cardiomiociti umani isolati sono elettricamente maturi, e diverse sottopopolazioni cardiomiociti possono essere ottenute alterando i parametri di coltura⁹. Tuttavia, questi miociti mostrano generalmente un'azione alterata potenziali morfologie a causa della mancanza di accoppiamento cellulare, rapida de-differenziazione, e la comparsa di comportamento proaritmico in vitro^10,11. Alcune delle limitazioni sono state affrontate da modelli di coltura cellulare 3D di iPSC-CMs e miociti cardiaci. Questi modelli, che includono sferoidi, scaffold idrogel incapsulati colture 3D, tessuti cardiaci ingegnerizzati (EIT) e sistemi cuore su un chip, utilizzano più popolazioni di cellule cardiache come cardiomiociti, fibroblasti e cellule endoteliali. Si auto-assemblano o assemblano lungo un ponteggio per formare strutture 3D, e alcuni riproducono anche la complessa natura anisotropica del miocardio. Questi modelli sono stati segnalati per avere cellule di fenotipi maturi, proprietà contrattuali, e profili molecolari simili al tessuto cardiaco. Il sistema heart-on-a-chip consente anche lo studio degli effetti sistemici nei modelli di droga e malattia. Tuttavia, i modelli a base di cellule in vitro non hanno la matrice extracellulare nativa e quindi non sono in grado di imitare con precisione l'elettrofisiologia a livello di organo. Le fette cardiache umane, al contrario, hanno una matrice extracellulare intatta e contatti autocellulari a cellule, il che li rende utili per esaminare con maggiore precisione le proprietà aritmogene del miocardio umano.

I ricercatori hanno sviluppato fette di organotipiche cardiache umane come piattaforma preclinica fisiologica per test sui farmaci acuti e cronici e per studiare l'elettrofisiologia cardiaca e la progressione delle malattie cardiache^{12,13,14,15,16,17,18,19}. Rispetto ai cardiomiociti derivati da iPSC, le fette cardiache umane replicano più fedelmente l'elettrofisiologia cardiaca umana adulta con un fenotipo cardiomiocito maturo. Rispetto ai cardiomiociti umani isolati, le fette cardiache presentano durate potenziali di azione fisiologica a causa dell'accoppiamento cellula-cellula ben conservato e dell'esistenza intrinseca dei loro ambienti nativi intra ed extracellulari.

Questo protocollo descrive il processo di generazione di fette cardiache umane da cuori interi donatori, eseguendo studi acuti (cioè di ore) e cronici (cioè giorni lunghi) per testare i parametri di elettrofisiologia cardiaca tramite mappatura ottica. Mentre questo protocollo descrive solo l'uso del tessuto ventricolare sinistro (LV), è stato applicato con successo ad altre regioni del cuore così come altre specie come topi, ratti, porcellini d'India e maiali^14,20^,2121,22. Il nostro laboratorio utilizza interi cuori donatrici che sono stati respinti per il trapianto negli ultimi 5 anni, ma è possibile che queste stesse procedure vengano eseguite su qualsiasi tessuti campione di cuore donatore ottenuti con mezzi alternativi (ad esempio, impianti di assistenza ventricolare sinistra [LVAD], biopsie, miectomie) purché i tessuti abbiano la capacità di essere sezionati in cubi. La mappatura ottica viene utilizzata per l'analisi in questo studio a causa della sua capacità di mappare simultaneamente potenziali di azione ottica e transitori di calcio con alta risoluzione spaziale (100 x 100 pixel) e temporale (>1,000 fotogrammi/s). È anche possibile utilizzare metodi alternativi, come gli array multielettrodi (MEA) o i microelettrodi, ma queste tecniche sono limitate dalle loro risoluzioni spaziali relativamente basse. Inoltre, i MEA sono stati progettati per l'uso con le colture cellulari e i microelettrodi taglienti sono più facilmente gestiti per l'uso con cuori interi o grandi cunei di tessuto.

L'obiettivo dell'articolo è quello di consentire a più ricercatori di utilizzare tessuti cardiaci umani per studi di elettrofisiologia cardiaca. Va notato che la tecnologia descritta in questo articolo è relativamente semplice e vantaggiosa per gli studi a breve termine (nell'ordine di diverse ore a giorni). Più fisiologica cultura biomimetica per studi a lungo termine (nell'ordine di settimane) è stato discusso e descritto da una serie di altri studi^12,18,23. Stimolazione elettrica, carico meccanico e stretching dei tessuti sono meccanismi di condizionamento vantaggiosi che possono aiutare a limitare l'insorgenza del rimodellamento del tessuto in vitro^12,18,23.

Protocollo

Tutti i metodi descritti sono stati eseguiti nel rispetto di tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano. La ricerca è stata approvata dall'Institution Review Board (IRB) della George Washington University.

NOTA: I cuori umani dei donatori sono stati acquisiti dalla Washington Regional Transplant Community come tessuto scartato deidentificato con l'approvazione della George Washington University IRB. I cuori espulsi vengono arrestati cardioplericamente sciaccando il cuore con una soluzione di cardioplegia ghiacciata (il sangue è stato ripulito dal cuore in questo processo) e trasferiti in laboratorio in condizioni standard di trapianto di organo.

1. Preparazione delle soluzioni

1. Per ogni cuore, fare 4 L di soluzione cardioplegica (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 1,2 mM CaCl₂; pH - 7.4). Conservare 3 L a 4 gradi centigradi e il rimanente 1 L a -20 gradi centigradi.
   NOTA: questa soluzione può essere effettuata con diversi giorni di anticipo.
2. Prepara da appena 1 L ciascuna delle soluzioni di slicing di Tyrode (140 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1,8 mM CaCl₂, 10 mM di glucosio, 10 mM HEPES, 10 mM 2,3-butanedione monoxime [BDM]; pH 7.4) e soluzione di recupero di Tyrode (140 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1,8 mM CaCl₂, 10 mM di glucosio, 10 m HEPES, 10 mM BDM;
   NOTA: Entrambe le soluzioni di affettatura e recupero devono essere effettuate il giorno dell'esperimento e possono essere conservate a 4 gradi centigradi.
3. Preparare le soluzioni stock dei coloranti fluorescenti. Ricostituire il colorante sensibile alla tensione RH237 a 1,25 mg/mL in solissione dimetilo (DMSO) e conservarlo in 30 aliquote lismicate a 4 gradi centigradi. Ricostituire l'indicatore di calcio Rhod-2AM a 1 mg/mL in DMSO. Conservare in 30 aliquote l.C. a -20 gradi centigradi.
   NOTA: Di-4-ANEPPS (soluzione stock a 1,25 mg/mL in DMSO) può essere utilizzato negli esperimenti per l'imaging a singola fotocamera del singolo potenziale della transmembrana.
   1. Prima dell'inizio dell'esperimento, sonicare i coloranti utilizzando un sonicatore ad ultrasuoni per almeno 10 min e diluire ogni aliquota di coloranti fluorescenti in 1 mL della soluzione di recupero. Aggiungere Pluronic F-127 (Table of Materials) a Rhod-2AM con un rapporto 1:1 prima della diluizione nella soluzione di recupero.
4. Preparare una soluzione di riserva della blebbistatin di disaccoppiamento a contrazione eccitazione a 2 soluzione mg/mL in DMSO. Conservare in aliquote a -20 gradi centigradi. Durante gli esperimenti di mappatura ottica, diluire la soluzione di riserva di blebbistatin a una concentrazione di lavoro di 5-10 M nella soluzione di recupero di Tyrode.
5. Rendere medio di coltura fresca completando medio 199 con 2% penicillina-streptomycin, 1x insulino-trasferiscitrice-selenio (ITS) integratore di media liquidi, e 10 mM BDM. Filtrare il mezzo utilizzando un filtro sterile da 0,2 m.
   NOTA: Per gli studi di perturbazione farmacologica, i farmaci possono essere aggiunti direttamente al mezzo di coltura. Il mezzo di coltura può essere immagazzinato a 37 gradi centigradi.
6. Fare un 4% gel di agarose per il montaggio dei tessuti sciogliendo il punto di fusione a bassa fusione in acqua distillata e riscaldando la miscela in un forno a microonde fino a completa dissoluzione. Curare l'agarose in un piatto Petri con uno spessore di 5 mm e conservare a 4 gradi centigradi.

2. Configurazione dell'attrezzatura

1. Impostazione vibrante del microtoma
   1. Calibrare il microtoma vibrante prima di ogni esperimento.
      1. Utilizzando un microtoma vibrante di alta precisione (Tabella dei materiali),caricare una lama di taglio in ceramica nel supporto e collegare il dispositivo di calibrazione fornito con il microtoma vibrante. Scegliere l'opzione di regolazione della lama dal menu e selezionare ceramica per il tipo di lama.
      2. Selezionare l'opzione vibrazione, verificare il valore dell'asse . Se questo valore è <1 m, uscire dal menu di calibrazione. In caso contrario, regolare finemente la vite di calibrazione attaccata alla parte superiore della testa vibrante e selezionare l'opzione vibrazione. Ripetere il numero di volte necessario per impostare l'asse z su <1 m.
   2. Impostare le impostazioni del vibratome su 400 m spessore di taglio, 0,02 mm/ s velocità di avanzamento per il tessuto atriale e 0,04 mm/ velocità di avanzamento per il tessuto ventricolare, 2 mm di ampiezza di vibrazione orizzontale e frequenza di vibrazione 80 Hz.
      NOTA: Mentre lo spessore raccomandato è di 400 m per compensare i danni alle cellule sulle superfici tagliate della fetta, è possibile preparare anche le fette più sottili. Dato che il limite di diffusione dell'ossigeno è di circa 150 m, le fette intorno ai 300 m sono spesso utilizzate^14,17,18,24.
   3. Riempire il bagno del microtoma vibrante con soluzione di affettatura a 4 gradi centigradi e mantenere la temperatura circondando l'esterno del bagno con ghiaccio, ricostificando se necessario per tutto il protocollo di affettatura. Ossigenare continuamente la soluzione di affettatura nella vasca da gorgogliare con ossigeno al 100% durante il taglio.
   4. Impostare un secondo piatto con ben 100 sgherne di cellule di nylon e lavatrici a maglie necessarie (un colino cellulare per fetta). Riempire questo piatto con soluzione di recupero e ossigenarlo spumando con ossigeno al 100% a temperatura ambiente (RT).
      NOTA: questa soluzione viene mantenuta in RT durante l'esperimento.
2. Configurazione della mappatura ottica
   NOTA: Una descrizione più dettagliata del sistema di mappatura ottica è fornita nelle pubblicazioni precedenti^16,25,26.
   1. Attaccare un bagno di tessuto con strato di gel polidimetiloxane (PDMS) nella parte inferiore (per fissare le fette) a un sistema di perfusione. Circola 1 L della soluzione di recupero a 37 gradi centigradi e ossigena con ossigeno al 100%, attraverso il sistema di perfusione ad una portata abbastanza veloce da mantenere la temperatura e l'accumulo chiaro di vasca perfusate.
   2. Regolare la messa a fuoco e l'allineamento delle due telecamere CMOS (Tabella dei materiali) utilizzando un obiettivo.
      NOTA: Ulteriori dettagli sull'allineamento possono essere trovati negli studi precedenti²⁶.
   3. Utilizzare una sorgente luminosa a LED verde con una lunghezza d'onda di 520 x 5 nm per eccitare contemporaneamente i coloranti sensibili alla tensione e all'indicatore di calcio.
      NOTA: La sorgente di luce di eccitazione è collegata al cubo del filtro di eccitazione del sistema di mappatura ottica e viene riflessa da uno specchio dicroico da 550 nm per l'illuminazione epicentrica. La luce emessa viene raccolta da un obiettivo 1x e divisa da un secondo specchio dicromatico a 630 nm in componenti di tensione e calcio prima di essere filtrata rispettivamente da filtri da 690 e 590 nm e registrata dalle due telecamere.

3. Protocollo di sezionamento

1. Quando sei pronto per la dissezione e la sperimentazione dei tessuti, prepara un bagno di cardioplegia ghiacciata mescolando cardioplegia congelata e liquida. Mantenere il cuore immerso nel bagno cardioplegia fino alla raccolta dei tessuti per affettare (Figura 1A).
2. Incollare il gel di agarose prefatto sul retro dei supporti di tessuto metallico del vibratoma.
3. Identificare la parete libera ventricolare sinistra e tagliare 1 cm³ cubetti di tessuto in soluzione cardioplegica fredda. Quindi, montare rapidamente i blocchi di tessuto sui supporti di tessuto metallico con le superfici endocardiali rivolte verso l'alto e attaccarli al gel di agarose utilizzando l'adesivo topico della pelle (Figura 1B).
   NOTA: La regione del tessuto selezionata deve essere lontana dai grandi vasi sanguigni per evitare fori nelle fette. Il piano di sezionamento è approssimativamente parallelo all'orientamento della fibra nello strato endocardico (Figura 1E) e il piano di sezionamento potrebbe essere ad una leggera angolazione a causa dell'anisotropia rotazionale in uno strato più profondo della parete LV. Per aumentare la produttività, fino a due blocchi di tessuto possono essere montati fianco a fianco sullo stesso supporto.
4. Trasferire i supporti metallici nel bagno vibratoma riempito con la soluzione di affettare ossigenata ghiacciata. Assicurarsi che i cubi di tessuto siano completamente sommersi.
5. Spostare la lama sul bordo anteriore del tessuto e attivare il vibratoma per iniziare a affettare con i parametri preimpostati. Scartare le prime diverse fette fino a quando la lama raggiunge oltre le trabeculae nel tessuto endocardico liscio.
6. Una volta tagliata ogni fetta, trasferire con attenzione la fetta a un bagno ossigenato (100% O₂) della soluzione di recupero di Tyrode a RT. Posizionare delicatamente ogni fetta in singoli colino a rete di nylon da 100 m e coprire con vele a rete per evitare che le fette di tessuto si arricciano (Figura 1C). Conservare le sezioni nella soluzione di recupero per almeno 20 min.
   NOTA: Le fette possono essere conservate nella vasca da bagno in queste condizioni per un massimo di 3/4 h senza effetti elettrofisiologici dannosi.

4. Affettare la coltura in condizioni statiche

NOTA: Per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione, sterilizzare le pinze utilizzando uno sterilizzatore di perline prima di ogni passaggio di trasferimento.

1. Quando si è pronti alla coltura, trasferire con attenzione ogni fetta ai singoli pozzi di un 6 ben piastra riempito con salina sterile (PBS) con buffer di fosfato. Cullare delicatamente la piastra del pozzo per sciacquare le fette di soluzione di recupero.
   NOTA: Da questo punto in avanti, le fette devono essere esposte solo in una cappa di coltura del flusso laminare BSL2 e le pinze sterili devono essere utilizzate per gestire il tessuto.
2. Trasferire le fette in pozze di PBS fresco per sciacquare e sterilizzare accuratamente le fette per la coltura. Eseguire questo passaggio di lavaggio 3x per garantire la rimozione completa della soluzione di recupero dalle fette.
3. Trasferire le fette a singoli pozze di un 6 pozzetto riempito con 3 mL di preriscaldato (37 gradi centigradi) mezzo di coltura (con o senza droghe, Figura 1D). Posizionare le piastre su uno shaker orbitale a 20 giri in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi con il 30% O₂ e 5% di CO₂. Aspirati e sostituisci il mezzo di coltura ogni 48 h.

5. Caratterizzazione funzionale: mappatura ottica

1. Per gli studi di mappatura ottica immediatamente dopo la milazione o dopo la coltura, trasferire con attenzione la fetta di interesse al bagno di tessuto del sistema di perfusione a 37 gradi centigradi con 100% O₂ nella soluzione di recupero di Tyrode, e individuare i quattro angoli allo strato di gel PDMS mentre si applica un tratto minimo (cioè, quanto basta per evitare che la fetta si muova facilmente in condizioni di flusso). Lasciare riposare le fette in questo bagno con soluzione di recupero circolante per circa 10 min.
2. Aggiungere al serbatoio la soluzione di recupero pari a 0,3,5 mL della blebbistatin diluita. Lasciare affettare con blebbistatin per circa 10 min.
3. Ricostituire 30 l del coloranti sensibile alla tensione di magazzino, RH237, in 1 mL di soluzione di recupero a 37 gradi centigradi. Spegnere le pompe e caricare lentamente 0,2-0,3 mL di soluzione di tintura di lavoro sulla superficie della fetta per un periodo di 30 s. Lasciare che la fetta incubare nel colorare con le pompe spente per un periodo fino a 90 s, quindi accendere nuovamente le pompe per consentire qualsiasi coloranti da lavare.
   NOTA: Occorre prestare attenzione ad applicare il tinrito in modo uniforme su tutta la fetta. Inoltre, l'applicazione di tinri molto lenta è fondamentale per evitare che il tinri fluttuare dalla fetta.
4. Ripetere il passaggio 5.3 per ricostituire l'indicatore di calcio di riserva Rhod-2AM e caricarlo su affettare.
5. Mettere a fuoco le telecamere sulla sezione regolando la distanza della sezione dall'obiettivo.
6. Posizionare un elettrodo di stimolazione bipolare platino-iridio in modo che la sua punta sia a contatto con il centro della fetta e applicare stimoli di stimolazione di ampiezza crescente per determinare la soglia minima di stimolazione necessaria per provocare una risposta elettrica. Passo la sezione a 1 Hz con una durata della larghezza dell'impulso di 2 ms a 1,5 x l'ampiezza della soglia di stimolazione predeterminata. Posizionare un coperchio sopra la fetta di tessuto.
7. Illuminare la fetta utilizzando una fonte di luce di eccitazione LED da 520 x 5 nm. Registrare la tensione e i segnali di calcio emessi con le due telecamere CMOS a 1.000 fotogrammi/s.
8. Controllare la registrazione per una buona qualità del segnale e artefatti di movimento soppressi(Figura 1F). Aggiungere più blebbistatina al serbatoio in gradini di 0,1 mL fino a quando il movimento non produce più artefatti nei segnali ottici. Aggiungere più tinri, se necessario, per migliorare la qualità del segnale.
   NOTA: Una buona qualità del segnale si riferisce all'ampiezza del segnale di grandi dimensioni valutata qualitativamente e al basso rumore di fondo nei segnali ottici registrati.

6. Elaborazione dei dati con RHYTHM1.2

NOTA: RHYTHM1.2 è un'interfaccia utente basata su MATLAB utilizzata per visualizzare, condizionare e analizzare i dati di mappatura ottica acquisiti da sistemi dimappaturaottica a fotocamera singola o doppia ( Figura 3 ). Viene utilizzato in combinazione con il sistema di imaging.

1. Caricamento dei file di dati
   1. Caricare i file di dati in RHYTHM1.2 selezionando una delle quattro finestre di visualizzazione sullo schermo e utilizzando i pulsanti Seleziona directory e Carica.
   2. Il programma richiederà all'utente di selezionare i dati della telecamera 1 o della fotocamera 2 per le registrazioni a doppia tensione e calcio. Selezionare Camera 1 per il segnale di tensione.
   3. Ripetere il processo per caricare il segnale di calcio (Camera 2) in una delle finestre di visualizzazione adiacenti.
   4. Selezionare la casella di controllo Dual Data Linking tra le due finestre di visualizzazione selezionate per collegare le due finestre di visualizzazione, poiché i due set di dati vengono registrati dalla stessa area nella sezione.
      NOTA: In alternativa, se viene mantenuto lo stesso campo visivo, questa funzione può essere utilizzata per collegare due immagini ottenute in punti temporali separati per vedere la risposta temporale in elettrofisiologia del farmaco in da studiare. Fare doppio clic su una finestra di visualizzazione consente di ingrandire una finestra per facilitare l'analisi.
2. Condizionamento del segnale
   1. Selezione dell'analisi dei dati Condizione Parametri per la condizione dei dati di mappatura ottica di tensione e calcio prima di un'ulteriore analisi.
   2. Utilizzare la funzione "Rimuovi sfondo" per rimuovere i pixel che non contengono alcun segnale in base a una soglia di intensità fluorescente (soglia di scarico [BG]) e grado di clustering dei pixel (soglia di eccitazione [EX]).
   3. Eseguire la media spaziale dei dati di mappatura ottica utilizzando la funzione "Bin" per migliorare la qualità del segnale.
   4. Filtrare i dati di mappatura ottica utilizzando un filtro passa banda con la funzione "Filtro".
   5. Utilizzare la funzione "Drift" per rimuovere la deriva della linea di base nel segnale di mappatura ottico.
   6. Utilizzando la funzione "Normalizza", normalizzare i dati di mappatura ottica di ogni pixel per avere un'ampiezza massima di 1.
   7. Utilizzare la funzione "Segnale inverso" per invertire le tracce di calcio per ulteriori analisi.
   8. Fare clic su Mostra ondata per selezionare la traccia condizionata da un determinato punto della finestra di visualizzazione e stamparla nella finestra Forma d'onda. Regolare i parametri di condizionamento del segnale per ottenere un potenziale di azione ottimale e tracce transitorie di calcio.
3. Calcolo della velocità di conduzione (CV)
   NOTA: il tempo di attivazione è definito come il tempo di derivazione massima del segnale ottico (dF/dt_max).
   1. Selezione dell'analisi dei dati Mappa di attivazione e immettere un'ora di inizio e un'ora di fine per includere un singolo potenziale di azione nella traccia. Premere Calcola e selezionare la regione di interesse (ROI) per visualizzare la mappa di attivazione della regione selezionata (Figura 1G).
   2. Selezione dell'analisi dei dati Mappa CV e allo stesso modo, scegliere l'ora di inizio e l'ora di fine. Immettere i valori di risoluzione interpixel in base alla configurazione.
      NOTA: per i sistemi di ingrandimento 1x, la risoluzione interpixel è 0,1 mm nella direzione X e Y.
   3. Premere il pulsante Genera Vec. Pulsante Mappa per selezionare un ROI e visualizzare i vettori CV all'interno di tale regione. La media, la mediana, la deviazione standard e il numero di vettori inclusi nell'analisi, nonché l'angolo medio di propagazione dei vettori CV nella regione selezionata vengono calcolati e visualizzati nella sezione Statistiche.
   4. Fare clic sul pulsante Disegna linea per disegnare una linea lungo una determinata direzione di propagazione. Verranno selezionati tutti i vettori CV in quella direzione. Fare clic su Calcola CV per utilizzare solo i vettori CV selezionati per calcolare le statistiche che verranno visualizzate nella sezione Statistiche.
4. Azione durata potenziale (APD) e calcio transitorio durata (CaTD) calcolo
   NOTA: L'APD è un altro parametro fondamentale dell'elettrofisiologia cardiaca. Le mappe APD possono essere generate determinando la differenza di tempo tra l'attivazione e una percentuale specificata di ripolarizzazione di ogni potenziale di azione ottica. L'eterogeneità APD o il prolungamento e l'accorciamento dell'APD possono essere utilizzati per prevedere la suscettibilità all'aritmia.
   1. Per calcolare APD in RHYTHM1.2, selezionare Analisi dei dati Mappa APD/CaT.
   2. Selezionare l'ora di inizio e l'ora di fine per includere un potenziale di azione completo. Impostare un valore minimo e massimo di APD/CaTD per rimuovere eventuali outlier (ad esempio, 0 e 1.000 ms, rispettivamente). Immettere la percentuale di ricorsiva che determinerà l'APD, ad esempio 0,8 per APD₈₀/CaTD₈₀ o 0,5 per APD₅₀/CaTD₅₀.
   3. Fare clic su Calc APD regionale per selezionare un ROI e generare la mappa APD. La media, la mediana, la deviazione standard e il numero di pixel inclusi nell'analisi verranno visualizzati nella sezione Statistiche.
5. Tempo di salita
   NOTA: Il tempo di aumento è un altro parametro elettrofisiologico che può essere misurato dai segnali ottici di tensione e tracce transitorie di calcio. Fornisce una stima di quanto tempo ci vuole per i canali ionici depolarizzanti per innescare un potenziale di azione, o quanto tempo ci vuole per il calcio per essere rilasciato nel citoplasma dal reticolo sarccoplasmico. Il tempo di ascesa ottico non è un sostituto perfetto per i tempi di ascesa misurati dai microelettrodi e potrebbe non essere così sensibile ai cambiamenti nella depolarizzazione, perché i potenziali di azione ottica sono una media del potenziale transmembrana di molte cellule. La risoluzione spaziale e temporale del sistema può anche influenzare i valori del tempo di aumento ottico. Tuttavia, può ancora essere utilizzato per prevedere grandi cambiamenti nella depolarizzazione²⁷.
   1. Per determinare il tempo di aumento, selezionare Analisi dei dati Tempo di salita.
   2. Selezionare Ora di inizio e Ora di fine per selezionare l'upstroke di una singola azione potenziale o transitorio di calcio. Immettere i valori di Start% e End% (in genere 10-90% è consigliato per i segnali non rumorosi), che consente all'utente di selezionare solo le parti del segnale senza includere il rumore nel caso di segnali rumorosi.
   3. Fare clic su Calcola per selezionare il ROI e determinare la media, la mediana, la deviazione standard e il numero di pixel inclusi nell'analisi del tempo di salita.
6. Decadimento del calcio
   NOTA: Per le tracce di calcio, è possibile determinare la costante temporale del decadimento del calcio transitorio. Ciò consente l'analisi dei cambiamenti nella rimozione degli ioni di calcio dal citoplasma nella SR.
   1. Selezione dell'analisi dei dati Calcio Decay ed entrare nell'ora di inizio e all'ora di fine per includere l'intera porzione di decadimento di un singolo segnale transitorio di calcio.
   2. Fare clic su Calcola Tau per selezionare il ROI e determinare la media, la mediana, la deviazione standard e il numero di pixel inclusi nell'analisi della costante del tempo di decadimento del calcio.

Risultati

Le fette organotpice umane sono state raccolte dal ventricolo sinistro di un cuore umano del donatore secondo il protocollo descritto sopra e illustrato inFigura 1. Un sistema di mappatura ottica a doppia fotocamera come quello inFigura 2è stato utilizzato nella configurazione di imaging verticale per eseguire la mappatura ottica simultanea di tensione e calcio circa 1 h dopo il completamento del protocollo di taglio. I dati sono stati analizzati utilizzando RH...

Discussione

Qui, presentiamo metodi passo-passo per ottenere fette cardiache vitali da cuori umani arrestati cardioplegically e per caratterizzare funzionalmente le fette utilizzando la doppia mappatura ottica del potenziale transmembrana e del calcio intracellulare. Con l'ambiente extracellulare preservato e l'accoppiamento nativo delle cellule cellulari, le fette cardiache umane possono essere utilizzate come modello accurato del cuore umano per la scoperta scientifica fondamentale e per i test di efficacia e cardiotossicità di a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1mL BD Syringe	Thomas Scientific	309597
2,3-butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
6 well culture plates	Corning	3516
Biosafety cabinet	ThermoFisher Scientific	1377
Blebbistatin	Cayman	13186
Bubble Trap	Radnoti	130149
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Corning Cell Strainers	Fisher Scientific	07-201-432
Di-4-ANEPPS	Biotium		stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Dumont #3c Forceps	Fine Science Tools	11231-20
Emission dichroic mirror	Chroma	T630LPXR-UF1
Emission filter (RH237)	Chroma	ET690/50m
Emission Filter (Rhod2AM)	Chroma	ET590/33m
Excitation dichroic mirror	Chroma	T550LPXR-UF1
Excitation Filter	Chroma	ET500/40x
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49A
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Heat exchanger	Radnoti	158821
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Incubator	ThermoFisher Scientific	50145502
Insulin Transferrin Selenium (ITS)	Sigma-Aldrich	I3146
LED excitation light source	Prizmatix	UHP-Mic-LED-520
Magnessium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272
Medium 199	ThermoFisher Scientific	11150059
Micam Ultima L type CMOS camera	Scimedia	N/A
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Pennicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Peristaltic Pump	Cole Parmer	EW-07522-20
Platinum pacing wire	Alfa Aesar	43275
Pluronic F127	ThermoFisher Scientific	P6867	nonionic, surfactant polyol
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Powerlab data acquisition and stimulator	AD Instruments	Powerlab 4/26
RH237	Biotium	61018
Rhod2AM	ThermoFisher Scientific	R1245MP
Rhod-2AM	Invitrogen, Carlsbad, CA
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625
Sterilizer, dry bead	Sigma-Aldrich	Z378550
Stone Oxygen Diffuser	Waterwood	B00O0NUVM0
TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive	gobiomed	AESCULAP
UltraPure Low Melting Point Agarose	Thermo Fisher Scientific	16520100
Ultrasound sonicator		Branson 1800
Vibratome	Campden Instruments	7000 smz