İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi

Özet

Bu protokol, preklinik ilaç testi için insan kardiyak dilimlerinin kesilmesi ve kültüre edilmesi prosedürünü açıklar ve bu dilimlerden aynı anda transmembran voltajı ve hücre içi kalsiyum sinyallerini kaydetmek için optik haritalamanın kullanımını ayrıntılarıyla açıklar.

Özet

İnsan kardiyak dilim preparatları son zamanlarda hayvan ve klinik çalışmalar arasındaki boşluğu köprü için insan fizyolojisi çalışmaları ve tedavi testleri için bir platform olarak geliştirilmiştir. Çok sayıda hayvan ve hücre modelleri ilaçların etkilerini incelemek için kullanılmıştır, ancak bu tepkiler genellikle insanlarda farklıdır. İnsan kardiyak dilimleri doğrudan canlı insan kalplerinden türetilmiştir bu ilaç testi için bir avantaj sunuyoruz. Korunmuş çok hücreli yapılara sahip olmanın yanı sıra, hücre-hücre kaplini ve hücre dışı matriks ortamları, insan kardiyak doku dilimleri doğrudan yetişkin insan kardiyak fizyolojisi üzerinde sayısız ilaçların etkisini test etmek için kullanılabilir. Bu modeli tüm kalpler veya takozlar gibi diğer kalp preparatlarından ayıran şey, dilimlerin uzun vadeli kültüre maruz kalınmasıdır. Bu nedenle, kardiyak dilimleri ilaçların akut yanı sıra kronik etkileri incelenmesi için izin verir. Ayrıca, tek bir kalpten birkaç yüz bin dilim toplamak için yeteneği bu aynı anda diğer ilaçlar ile değişen konsantrasyonlarda ve kombinasyonları çeşitli ilaçlar test etmek için yüksek iş yapma modeli yapar. Dilimler kalbin herhangi bir bölgesinden hazırlanabilir. Bu protokolde, sol ventrikül serbest duvardan doku küpleri izole ve yüksek hassasiyetli titreşimli mikrotom kullanarak dilimler halinde kesitler halinde keserek sol ventrikül dilimleri hazırlanması nı açıklıyoruz. Bu dilimler daha sonra ya temel kardiyak elektrofizyolojik fonksiyonu ölçmek için akut deneylere tabi tutulabilir ya da kronik ilaç çalışmaları için kültürlü. Bu protokol aynı zamanda, araştırılan ilaçların etkilerini belirlemek için transmembran potansiyellerinin ve hücre içi kalsiyum dinamiğinin eşzamanlı kayıtları için kardiyak dilimlerin çift optik haritalamasını da açıklamaktadır.

Giriş

Hayvan modelleri insan fizyolojisi ve patofizyolojisi altta yatan mekanizmaları anlamak için kullanılan değerli bir araç olmuştur, hem de çeşitli hastalıkların tedavisinde tedavilerin ön test için bir platform¹. Büyük adımlar bu hayvan çalışmaları 2 dayalı biyomedikal araştırma²alanında alınmıştır. Ancak, fareler, sıçanlar, kobaylar, tavşanlar, koyun, domuzlar ve köpekler^3,4dahil olmak üzere insan ve hayvan fizyolojisi arasında önemli türler arası farklılıklar vardır. Sonuç olarak, çok sayıda ilaç olmuştur, gen, ve hayvan test aşamasında umut gösterdi hücre tedavileri ama klinik çalışmalarda sonuçlara kadar yaşamak için başarısız^{oldu 5}. Bu boşluğu kapatmak için, izole kardiyak miyositler ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) çeşitli ilaçlar ve hastalıklara insan fizyolojisi yanıtını test etmek için model olarak geliştirilmiştir⁶. Kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler yaygın kalp bir vekil olarak organ-on-a-chip sistemlerinde kullanılmaktadır^6,7,8. Ancak, iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin (iPSC-CMs) yararlılığı göreceli olarak olgunlaşmamış fenotipve kardiyomiyosit alt popülasyonunun temsil eksikliği ile engellenir; olgun miyokardiyum fibroblastlar, nöronlar, makrofajlar ve endotel hücreleri gibi birkaç birlikte hücre tiplerinden oluşan karmaşık bir yapıdır. Diğer taraftan, izole insan kardiyomiyositleri elektriksel olarak olgundur ve farklı kardiyomiyosit alt popülasyonları⁹9. Yine de, bu miyositler genellikle hücre-hücre kaplin eksikliği nedeniyle değişmiş eylem potansiyeli morfolojileri sergilemek, hızlı de-farklılaşma, ve in vitro proaritmik davranış oluşumu^10,11. Bazı sınırlamalar iPSC-CM'ler ve kardiyak miyositlerin 3D hücre kültürü modelleri ile ele alınmıştır. Küresel balıklar, hidrojel iskelesi kapsüllü 3D kültürler, mühendislik kalp dokuları (EHTs) ve kalp-on-a-chip sistemleri içeren bu modeller, kardiyomiyositler gibi birden fazla kardiyak hücre popülasyonları kullanın, fibroblastlar, ve endotel hücreleri. Ya kendi kendine monte ya da 3D yapılar oluşturmak için bir iskele boyunca monte, ve hatta bazı miyokardin karmaşık anizotropik doğasını çoğaltmak. Bu modellerin olgun fenotip, kontraktil özellikleri ve kardiyak dokuya benzer moleküler profillere sahip olduğu bildirilmiştir. Kalp-on-a-chip sistemi de ilaç testi ve hastalık modellerinde sistemik etkileri çalışma sağlar. Ancak, in vitro hücre tabanlı modeller yerli ekstrasellüler matris eksikliği ve bu nedenle doğru organ düzeyinde elektrofizyoloji taklit edemez. Buna karşılık, insan kardiyak dilimleri, bozulmamış bir hücre dışı matris ve yerli hücre-hücre temasları var, daha doğru insan miyokardiyum aritmiojenik özelliklerini incelemek için yararlı hale.

Araştırmacılar akut ve kronik ilaç testi için fizyolojik bir preklinik platform olarak insan kardiyak organotipik dilimler geliştirdik ve kardiyak elektrofizyoloji ve kalp hastalığı ilerlemesi¹²çalışma^{,13,14,15,16,17,18,19}. iPSC türetilmiş kardiyomiyositler ile karşılaştırıldığında, insan kardiyak dilimleri daha sadakatle olgun bir kardiyomiyosit fenotip ile yetişkin insan kardiyak elektrofizyoloji çoğaltmak. İzole insan kardiyomiyositleri ile karşılaştırıldığında, kardiyak dilimler iyi korunmuş hücre-hücre kaplini ve doğal hücre içi ve hücre dışı ortamların içsel varlığı nedeniyle fizyolojik etki potansiyel süreleri sergilerler.

Bu protokol, tüm donör kalplerden insan kardiyak dilimleri üretme, optik haritalama yoluyla kardiyak elektrofizyoloji parametrelerini test etmek için akut (yani, saatler süren) ve kronik (yani günler boyu) çalışmalar yapma sürecini tanımlar. Bu protokol sadece sol ventrikül (LV) dokusunun kullanımını açıklarken, başarıyla kalbin diğer bölgelerinyanı sıra fareler, sıçanlar, kobay gibi diğer türler için uygulanmıştır ve domuz^14,20,21,22. Laboratuvarımız son 5 yıldır transplantasyon için reddedilen tüm insan donör kalplerini kullanmektedir, ancak dokular küpler halinde kesitlenme yeteneğine sahip olduğu sürece, alternatif yollarla elde edilen herhangi bir donör kalp örnek dokuları (örneğin, sol ventriküler yardımcı cihaz [LVAD] implantasyonları, biyopsiler, miektomies) üzerinde aynı işlemlerin yapılması mümkündür. Optik haritalama, yüksek uzamsal (100 x 100 piksel) ve zamansal (>1.000 kare/s) çözünürlüğe sahip optik eylem potansiyellerini ve kalsiyum geçicilerini eş zamanlı olarak haritalama kapasitesi nedeniyle bu çalışmada analiz için kullanılmaktadır. Çoklu elektrot dizileri (MEA) veya mikroelektrotlar gibi alternatif yöntemler de kullanılabilir, ancak bu teknikler nispeten düşük uzamsal çözünürlükleri ile sınırlıdır. Ayrıca, MEAs hücre kültürleri ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır, ve keskin mikroelektrotlar daha kolay tüm kalpleri veya büyük doku takozları ile kullanılmak üzere yönetilir.

Makalenin amacı, daha fazla araştırmacının kardiyak elektrofizyoloji çalışmaları için insan kalp dokularını kullanmasını sağlamaktır. Bu makalede açıklanan teknoloji nispeten basit ve kısa vadeli çalışmalar için yararlı olduğu unutulmamalıdır (gün birkaç saat sırayla). Uzun vadeli çalışmalar için daha fizyolojik biyomimetik kültür (hafta sırasına göre) tartışıldı ve diğer çalışmaların bir dizi tarafından açıklanan^12,18,23. Elektriksel stimülasyon, mekanik yükleme ve doku germe in vitro doku remodelling başlangıcını sınırlamak yardımcı olabilir avantajlı klima mekanizmaları^{vardır 12,18,23}.

Protokol

Açıklanan tüm yöntemler, insan refahı için tüm kurumsal, ulusal ve uluslararası kurallara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Araştırma, George Washington Üniversitesi'ndeki Kurum İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylandı.

NOT: Donör insan kalpleri George Washington Üniversitesi IRB onayı ile deidentified atılmış doku olarak Washington Bölgesel Transplant Topluluk elde edilmiştir. Ekrende kalpler kalp buz gibi kardiyopleji çözeltisi ile kalp kızartılarak kardiyetik olarak tutuklanur (bu süreçte kan kalpten temizlenir) ve standart organ nakli koşulları altında laboratuvara aktarılır.

1. Çözümlerin hazırlanması

1. Her kalp için 4 L kardiyoplegic solüsyon yapın (110 mM NaCl, 16 mM KCl, 16 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 1,2 mM CaCl_2;pH = 7.4). 4 °C'de 3 L, -20 °C'de kalan 1 L'yi saklayın.
   NOT: Bu çözüm birkaç gün önceden yapılabilir.
2. Tyrode'un dilimleme çözeltisinin her biri için taze olarak 1 L hazırlayın (140 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1,8 mM CaCl₂, 10 mM glukoz, 10 mM HEPES, 10 mM 2,3-butanedione monoxime [BDM]; pH = 7.4) ve Tyrode kurtarma çözeltisi (140 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1.8 mM CaCl₂, 10 mM glikoz, 10 mM BDM; pH = 7.4).
   NOT: Hem dilimleme hem de geri kazanım çözeltileri deney günü yapılmalı ve 4 °C'de saklanmalıdır.
3. Floresan boyaların stok çözümlerini hazırlayın. Voltaj duyarlı boya RH237'yi 1,25 mg/mL'de dimetil sülfoksitte (DMSO) yeniden kurun ve 4 °C'de 30 μL aliquots'ta saklayın. DMSO'da 1 mg/mL'de Rhod-2AM kalsiyum indikatörü yeniden oluşturul. -20 °C'de 30 μL aliquots'ta saklayın.
   NOT: Di-4-ANEPPS (DMSO'da 1.25 mg/mL stok çözeltisi) sadece transmembran potansiyelinin tek kameralı görüntülemesi için deneylerde kullanılabilir.
   1. Deney başlamadan önce, en az 10 dakika ultrason sonicator kullanarak boyalar sonicate ve kurtarma çözeltisi 1 mL floresan boyalar her aliquot seyreltmek. Kurtarma çözeltisinde seyreltmeden önce 1:1 oranında Rhod-2AM'a Pluronik F-127(Malzeme Tablosu)ekleyin.
4. DMSO'da 2 mg/mL çözeltide uyarma-kontraksiyon uncoupler blebbistatin bir stok çözeltisi hazırlayın. -20 °C'de aliquots'ta saklayın. Optik haritalama deneyleri sırasında, bibbistatin stok çözeltisini Tyrode'un kurtarma çözeltisinde 5−10 μM'lik bir çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
5. Orta 199'u %2 penisilin-streptomisin, 1x insülin-transferrin-selenyum (ITS) sıvı ortam takviyesi ve 10 mM BDM ile tamamlayarak taze kültür ortamı yaratın. Ortamı 0,2 μm steril filtre kullanarak filtreleyin.
   NOT: Farmakolojik pertürbasyon çalışmaları için ilaçlar doğrudan kültür ortamına eklenebilir. Kültür ortamı 37 °C'de saklanabilir.
6. Distile suda düşük erime noktası agarose eriterek ve tamamen çözülene kadar bir mikrodalga karışımı ısıtma tarafından doku montaj için% 4 agarose jel olun. Agarose'u petri kabında 5 mm kalınlığında tedavi edin ve 4 °C'de saklayın.

2. Ekipman kurulumu

1. Titreşimli mikrotom kurulumu
   1. Her deneyden önce titreşen mikrotomu kalibre edin.
      1. Yüksek hassasiyetli titreşimli titreşimli mikrotomu(Malzeme Tablosu)kullanarak, seramik kesme bıçağını tutucuya yükleyin ve titreşimli mikrotomla sağlanan kalibrasyon cihazını takın. Menüden bıçak ayarlama seçeneğini seçin ve bıçak türü için seramik seçin.
      2. Titreşim seçeneğini seçin, Z ekseni değerini kontrol edin. Bu değer <1 μm ise kalibrasyon menüsünden çıkın. Değilse, titreşimli başlığın üst kısmına bağlı kalibrasyon vidasını hassas bir şekilde ayarlayın ve titreşim seçeneğini seçin. Z eksenini <1 μm olarak ayarlamak için gereken süreyi tekrarlayın.
   2. Vibratom ayarlarını 400 μm kesme kalınlığına, atriyal doku için 0,02 mm/s ileri hıza ve ventriküler doku için 0,04 mm/s ileri hıza, 2 mm yatay titreşim genliğine ve 80 Hz titreşim frekansına ayarlayın.
      NOT: Dilimin kesme yüzeylerinde hücre hasarını telafi etmek için önerilen kalınlık 400 m iken, daha ince dilimler de hazırlanabilir. Oksijen difüzyon sınırının 150 μm civarında olduğu düşünülürse, 300 μm civarındaki dilimler genellikle 14 ,^17,,1817,24olarak kullanılır.
   3. Titreşimli mikrotomun banyosunu 4 °C'de dilimleme çözeltisi ile doldurun ve banyonun dışını buzla çevreleyerek sıcaklığı koruyun, dilimleme protokolü boyunca gerektiği gibi doldurulun. Dilimleme sırasında %100 oksijen köpürterek banyodaki dilimleme çözeltisini sürekli olarak oksijenlendirin.
   4. Gerektiğinde 100 μm'lik naylon kafes hücresüzler ve kafesli yıkayıçlarla ikinci bir çanak ayarlayın (dilim başına bir hücresüzsüz). Bu kabı geri kazanım çözeltisi ile doldurun ve oda sıcaklığında %100 oksijen (RT) ile köpürerek oksijenverin.
      NOT: Bu çözüm deneme sırasında RT'de tutulur.
2. Optik haritalama kurulumu
   NOT: Optik haritalama sisteminin daha ayrıntılı bir açıklaması önceki yayınlarda^16,25,26olarak verilmektedir.
   1. Bir perfüzyon sistemine altında polidimethylsiloxane (PDMS) jel tabakası ile bir doku banyosu takın (dilimleri pinlemek için). 37 °C'de geri kazanım çözeltisinin 1 L'sini dağıtın ve perfüzyon sistemi üzerinden %100 oksijen verin, sıcaklık ve berrak banyo perfusat birikimini koruyacak kadar hızlı bir akış hızında.
   2. İki CMOS kameranın(Malzeme Tablosu)odak noktasını ve hizalanmasını bir hedef kullanarak ayarlayın.
      NOT: Hizalama hakkında daha fazla bilgi önceki çalışmalarda bulunabilir²⁶.
   3. Voltaj duyarlı ve kalsiyum gösterge boyaları aynı anda heyecanlandırmak için dalga boyu 520 ± 5 nm olan yeşil led ışık kaynağı kullanın.
      NOT: Uyarma ışık kaynağı optik haritalama sisteminin uyarma filtre küpüne takılır ve episentrik aydınlatma için 550 nm dikroik aynadan yansıtılır. Yayılan ışık 1x lens tarafından toplanır ve sırasıyla 690 ± 50 nm ve 590 ± 33 nm filtreler tarafından süzülmeden önce gerilim ve kalsiyum bileşenlerine 630 nm'de ikinci bir dikroik ayna ile bölünür ve iki kamera tarafından kaydedilir.

3. Dilimleme protokolü

1. Doku diseksiyonu ve deneyiçin hazır olduğunuzda, dondurulmuş ve sıvı kardiyopleji karıştırarak buz gibi kardiyopleji bir banyo hazırlamak. Dilimleme için doku toplama kadar kardiyopleji banyosunda kalp batık tutun (Şekil 1A).
2. Tutkal vibratom metal doku tutucuları arkasına premade agarose jel.
3. Sol ventrikül serbest duvar belirleyin ve soğuk kardiyoplejik çözelti doku 1 cm³ küp kesti. Daha sonra, hızlı bir şekilde endokardiyal yüzeyler yukarı bakacak şekilde metal doku tutucuları üzerine doku blokları monte ve topikal deri yapıştırıcı kullanarak agarose jel onları takın(Şekil 1B).
   NOT: Seçili doku bölgesi, dilimlerde delikleri önlemek için büyük kan damarlarından uzak olmalıdır. Kesit düzlemi endokardiyal tabakadaki(Şekil 1E)lif oryantasyonuna yaklaşık olarak paraleldir ve kesit düzlemi LV duvarının daha derin bir katmanındaki dönme aisotropi nedeniyle hafif bir açıda olabilir. İş bünyesini artırmak için, aynı tutucuya yan yana iki doku bloğu monte edilebilir.
4. Metal tutucuları buz gibi oksijenli dilimleme çözeltisi ile dolu vibratom banyosuna aktarın. Doku küplerinin tamamen batırılmış olduğundan emin olun.
5. Bıçağı dokunun ön kenarına taşıyın ve önceden ayarlanmış parametrelerle dilimleme başlamak için vibratom açın. Bıçak pürüzsüz endokardiyal doku içine trabeculae ötesine ulaşana kadar ilk birkaç dilim atın.
6. Her dilim kesildikten sonra, dilimi dikkatlice Tyrode'un RT'deki iyileşme solüsyonunun oksijenli(%100O₂₎banyosuna aktarın. Dilimleri en az 20 dakika kurtarma çözümünde saklayın.
   NOT: Dilimler bu koşullar altında, zararlı elektrofizyolojik etkiler olmaksızın 3−4 saate kadar banyoda tutulabilir.

4. Statik koşullarda dilim leme

NOT: Kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için, her transfer adımından önce bir boncuk sterilizatörü kullanarak büşnatları sterilize edin.

1. Kültüre hazır olduğunuzda, her dilimi steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile dolu 6 kuyulu bir plakanın ayrı kuyularına dikkatlice aktarın. Yavaşça kurtarma çözeltisi dilimleri durulamak için iyi plaka kaya.
   NOT: Bu noktadan itibaren, dilimler sadece Bir BSL2 laminar akış kültür başlık maruz olmalı ve steril çalgılar doku işlemek için kullanılmalıdır.
2. Dilimleri taze PBS kuyularına aktarın ve dilimleri iyice durulayın ve kültür için sterilize edin. Bu yıkama adım 3x dilimleri kurtarma çözeltisi tam kaldırılmasını sağlamak için gerçekleştirin.
3. Dilimleri, önceden ısıtılmış (37 °C) kültür ortamının 3 mL'si (uyuşturuculu veya uyuşturucusuz, Şekil 1D)ile dolu 6 kuyulu bir plakanın tek tek kuyularına aktarın. Plakaları 20 rpm'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37 °C'de %30 O₂ ve %5 CO₂ile orbital shaker üzerine yerleştirin. Aspire ve kültür ortamı her 48 saat değiştirin.

5. Fonksiyonel karakterizasyon―optik haritalama

1. Dilimlemeden hemen sonra veya kültürden sonra yapılan optik haritalama çalışmaları için, tyrode'un kurtarma çözümünde %100 O₂ ile 37 °C'de ilgi dilimini perfüzyon sisteminin doku banyosuna dikkatlice aktarın ve en az streç uygularken dört köşeyi PDMS jel katmanına sabitleyin (yani dilimin akış koşullarında kolayca hareket etmesini engellemeye yetecek kadar). Yaklaşık 10 dakika boyunca dolaşan kurtarma çözeltisi ile bu banyoda dilimleri dinlenmek için izin verin.
2. Redüpara çözeltisini içeren rezervuara seyreltilmiş blebbistatin 0,3−0,5 mL ekleyin. Yaklaşık 10 dakika blebbistatin ile dilim kuluçkaya bırakın.
3. 37 °C'de 1 mL geri kazanım çözeltisi içinde stok gerilimine duyarlı boya RH237'nin 30 μL'sini yeniden oluşturun. Pompaları kapatın ve 30 s'lik bir süre boyunca dilimin yüzeyine 0,2−0,3 mL'lik boyama çözeltisini yavaşça yükleyin. Dilimin 90 s'ye kadar bir süre boyunca boyayla boyanın içinde kuluçkaya yatmasını bekleyin, sonra fazla boyanın yıkanmasını sağlamak için pompaları tekrar açın.
   NOT: Boyayı dilimin her yerine eşit olarak uygulamak için dikkatli olunmalıdır. Ayrıca, çok yavaş boya uygulaması dilim den uzağa yüzen boya önlemek için çok önemlidir.
4. Stok kalsiyum göstergesi Rhod-2AM'yi yeniden oluşturmak ve dilime yüklemek için adım 5.3'ü tekrarlayın.
5. Dilimin lensten uzaklığı ayarlayarak kameraları dilimin üzerine odakla.
6. Ucu dilimin ortasıyla temas halinde olacak şekilde iki kutuplu platin-iridyum pacing elektrodu yerleştirin ve elektriksel bir tepki çıkarmak için gereken minimum pacing eşiğini belirlemek için genliği artıran pacing uyaranları uygulayın. Önceden belirlenmiş tempo eşiğinin genliğini 1,5 kat 2 ms darbe genişliği süresiyle 1 Hz hızında hızlandırın. Doku diliminin üzerine bir kapak kaydırın.
7. 520 ± 5 nm LED uyarma ışık kaynağı kullanarak dilimi aydınlatın. Yayılan voltaj ve kalsiyum sinyallerini iki CMOS kamerayla 1.000 kare/s'ye kaydedin.
8. İyi sinyal kalitesi ve bastırılmış hareket yapıları için kaydı kontrol edin (Şekil 1F). Hareket artık optik sinyallerde eserler üretene kadar 0,1 mL adımda rezervuara daha fazla blebbistatin ekleyin. Sinyal kalitesini artırmak için gerekirse daha fazla boya ekleyin.
   NOT: İyi sinyal kalitesi, kaydedilen optik sinyallerdeki nitel olarak değerlendirilmiş büyük sinyal genliği ve düşük arka plan gürültüsü anlamına gelir.

6. RHYTHM1.2 ile veri işleme

NOT: RHYTHM1.2, tek veya çift kameralı optik haritalama sistemleri tarafından elde edilen optik haritalama verilerini görüntülemek, duruma getirmek ve analiz etmek için kullanılan MATLAB tabanlı bir kullanıcı arabirimidir(Şekil 3). Görüntüleme sistemi ile birlikte kullanılır.

1. Veri dosyalarını yükleme
   1. Ekrandaki dört ekran penceresinden herhangi birini seçerek ve Dizin seç ve Yükle düğmelerini kullanarak veri dosyalarını RHYTHM1.2'ye yükleyin.
   2. Program çift voltaj ve kalsiyum kayıtları için Kamera 1 veya Kamera 2 verileri seçmek için kullanıcı ister. Voltaj sinyali için Kamera 1'i seçin.
   3. Kalsiyum sinyalini (Kamera 2) bitişik ekran pencerelerinden birine yüklemek için işlemi tekrarlayın.
   4. İki veri kümesi dilimdeki aynı bölgeden kaydedildiğından, iki ekran penceresini bağlamak için seçili iki ekran penceresi arasındaki Çift Veri Bağlantısı onay kutusunu seçin.
      NOT: Alternatif olarak, aynı görüş alanı korunursa, bu fonksiyon araştırılan ilacın elektrofizyolojisinde zaman tepkisini görmek için ayrı zaman noktalarında elde edilen iki görüntüyü birbirine bağlamak için kullanılabilir. Herhangi bir ekran penceresine çift tıklayarak, analiz kolaylığı sağlamak için bir pencerenin en üst düzeye çıkarılabilmesini sağlar.
2. Sinyal koşullandırma
   1. Veri Analizi seçin | Durum Parametreleri daha fazla analiz öncesinde voltaj ve kalsiyum optik haritalama verileri koşullandırmak için.
   2. Floresan yoğunluk eşiğine (arka plan [BG] eşiği) ve piksel kümeleme derecesine (uyarma [EX] eşiği) dayalı herhangi bir sinyal içermeyen pikselleri kaldırmak için "Arka Planı Kaldır" işlevini kullanın.
   3. Sinyal kalitesini artırmak için "Bin" işlevini kullanarak optik haritalama verilerinin mekansal ortalamasını gerçekleştirin.
   4. "Filter" işleviile bant geçiş filtresi kullanarak optik haritalama verilerini filtreleyin.
   5. Optik haritalama sinyalindeki taban çizgisi sürüklenmesini kaldırmak için "Drift" işlevini kullanın.
   6. "Normalize et" işlevini kullanarak, her pikselden gelen optik haritalama verilerini normalleştirin ve maksimal genlik 1'e sahip olur.
   7. Daha fazla analiz için kalsiyum izlerini tersine çevirmek için "Ters Sinyal" işlevini kullanın.
   8. Görüntü penceresindeki herhangi bir noktadan koşullandırılmış izlemeyi seçmek ve Dalga Formu penceresinde çizmek için Görüntü Lekesi'ni tıklatın. Optimum etki potansiyeli ve kalsiyum geçici izlerini elde etmek için sinyal koşullandırma parametrelerini ayarlayın.
3. İletim hızı (CV) hesaplama
   NOT: Aktivasyon süresi optik sinyalin maksimum türevi (dF/dt_max)zamanı olarak tanımlanır.
   1. Veri Analizi seçin | Etkinleştirme Haritası ve izleme tek bir eylem potansiyelini kapsayacak şekilde bir Başlangıç Saati ve Bitiş Saati girin. Seçilen bölgenin aktivasyon haritasını(Şekil 1G)görüntülemek için İlgi Bölgesini (YG) hesapla ve seçin.
   2. Veri Analizi seçin | CV Haritası ve benzer şekilde Başlangıç Saati ve Bitiş Saatini seçin. Kuruluma göre pikseller arası çözünürlük değerlerini girin.
      NOT: 1x büyütme sistemleri için pikseller arası çözünürlük X ve Y yönünde 0,1 mm'dir.
   3. Oluştur Vec tuşuna basın. Bir YG seçmek ve o bölgedeki CV vektörlerini görüntülemek için harita düğmesi. Analizde yer alan vektörlerin ortalaması, ortancası, standart sapması ve sayısı ile seçilen bölgedeki CV vektörlerinin ortalama yayılma açısı hesaplanır ve İstatistik bölümünde görüntülenir.
   4. Belirli bir yayılma yönü boyunca bir çizgi çizmek için Çizgi Çiz düğmesini tıklatın. Bu yöndeki tüm CV vektörleri seçilecektir. İstatistikler bölümünde görüntülenecek istatistikleri hesaplamak için yalnızca seçili CV vektörlerini kullanmak için CV Hesapla'yı tıklatın.
4. Eylem potansiyeli süresi (APD) ve kalsiyum geçici süresi (CaTD) hesaplaması
   NOT: APD kardiyak elektrofizyolojinin bir diğer temel parametresi. APD eşlemleri, etkinleştirme arasındaki saat farkı ile her optik eylem potansiyelinin belirli bir yüzdesi arasında belirlenerek oluşturulabilir. Aritmi duyarlılığını tahmin etmek için APD heterojenite veya APD uzaması ve kısaltılması kullanılabilir.
   1. RHYTHM1.2'de APD hesaplamak için Veri Analizi | APD/CaT Haritası.
   2. Tam bir eylem potansiyelini kapsayacak şekilde Başlangıç Saati ve Bitiş Saatini seçin. Herhangi bir aykırılığı (örneğin, sırasıyla 0 ve 1.000 ms) kaldırmak için APD/CaTD'nin minimum ve maksimum değerini ayarlayın. APD'yi belirleyecek yüzde repolarizasyonunu girin, örneğin APD 80 /CaTD₈₀ için 0,8 veya APD_50/CaTD50için 0,5.₅₀
   3. YG seçmek ve APD eşlemi oluşturmak için Bölgesel APD Calc'yi tıklatın. Analizde yer alan piksellerin ortalaması, ortancası, standart sapması ve sayısı İstatistikler bölümünde görüntülenir.
5. Yükselme süresi
   NOT: Yükselme süresi, gerilim ve kalsiyum geçici izlerinin optik sinyallerinden ölçülebilen başka bir elektrofizyolojik parametredir. Bir eylem potansiyelini tetiklemek için depolarize iyon kanalları için ne kadar sürer, ya da sarcoplasmic retikulum gelen sitoplazma içine salınan kalsiyum için ne kadar sürer için bir tahmin sağlar. Optik yükselme süresi mikroelektrotlarla ölçülen yükselme süreleri için mükemmel bir alternatif değildir ve depolarizasyondaki değişikliklere karşı hassas olmayabilir, çünkü optik etki potansiyelleri birçok hücrenin transmembran potansiyelinin ortalamasıdır. Sistemin mekansal ve zamansal çözünürlüğü optik yükselme süresi değerlerini de etkileyebilir. Ancak, yine depolarizasyon²⁷büyük değişiklikleri tahmin etmek için kullanılabilir.
   1. Artış süresini belirlemek için Veri Analizi | Yükselme Zamanı.
   2. Tek bir eylem potansiyelinin veya kalsiyum geçicinin yukarı vuruşunu seçmek için Başlangıç Zamanı ve Bitiş Saati'ni seçin. Başlat ve Bitiş% değerlerini girin (genellikle gürültülü olmayan sinyaller için %10-90 önerilir), bu da kullanıcının gürültülü sinyaller de dahil olmadan sinyalin yalnızca bölümlerini seçmesine olanak tanır.
   3. YG'yi seçmek ve artış zamanının analizinde yer alan piksellerin ortalamasını, ortancasını, standart sapmasını ve sayısını belirlemek için Hesapla'yı tıklatın.
6. Kalsiyum bozunumu
   NOT: Kalsiyum izlerinde, kalsiyum geçici çürümesinin zaman sabiti belirlenebilir. Bu sitoplazmadan kalsiyum iyonlarının sitoplazmadan sr geri kaldırılması değişikliklerin analizi için izin verir.
   1. Veri Analizi seçin | Kalsiyum Bozunması ve tek bir kalsiyum geçici sinyalin tüm çürüme kısmını kapsayacak şekilde başlangıç ve bitiş saati girin.
   2. Yatırım Getirisi'ni seçmek ve kalsiyum bozunma süresi sabitinin analizinde yer alan piksellerin ortalamasını, ortancasını, standart sapmasını ve sayısını belirlemek için Tau'yu Hesapla'yı tıklatın.

Sonuçlar

İnsan organotipik dilimleri yukarıda ayrıntılı ve resimli protokole göre bir donör insan kalbinin sol ventrikül toplanmıştırŞekil 1. Böyle bir çift kamera optik haritalama sistemiŞekil 2dilimleme protokolünün tamamlanmasından sonra yaklaşık 1 saat voltaj ve kalsiyumeşzamanlı optik haritalama gerçekleştirmek için dik görüntüleme yapılandırmasında kullanılmıştır. Veriler RHYTHM1.2 kullanılarak analiz edildi (

Tartışmalar

Burada, kardiyoplegically tutuklanmış insan kalplerinden canlı kardiyak dilimler elde etmek ve transmembran potansiyeli ve hücre içi kalsiyumun çift optik haritalamasını kullanarak dilimleri işlevsel olarak karakterize etmek için adım adım yöntemler salıyoruz. Korunmuş hücre dışı ortam ve yerli hücre-hücre kaplini ile, insan kardiyak dilimleri temel bilimsel keşif ve farmakolojik ajanlar ve gen tedavileri etkinliği ve kardiyotoksisite testi için insan kalbinin doğru bir model olarak kullanılabil...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1mL BD Syringe	Thomas Scientific	309597
2,3-butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
6 well culture plates	Corning	3516
Biosafety cabinet	ThermoFisher Scientific	1377
Blebbistatin	Cayman	13186
Bubble Trap	Radnoti	130149
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Corning Cell Strainers	Fisher Scientific	07-201-432
Di-4-ANEPPS	Biotium		stock solution at 1.25 mg/mL in DMSO
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Dumont #3c Forceps	Fine Science Tools	11231-20
Emission dichroic mirror	Chroma	T630LPXR-UF1
Emission filter (RH237)	Chroma	ET690/50m
Emission Filter (Rhod2AM)	Chroma	ET590/33m
Excitation dichroic mirror	Chroma	T550LPXR-UF1
Excitation Filter	Chroma	ET500/40x
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49A
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Heat exchanger	Radnoti	158821
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Incubator	ThermoFisher Scientific	50145502
Insulin Transferrin Selenium (ITS)	Sigma-Aldrich	I3146
LED excitation light source	Prizmatix	UHP-Mic-LED-520
Magnessium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272
Medium 199	ThermoFisher Scientific	11150059
Micam Ultima L type CMOS camera	Scimedia	N/A
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Pennicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Peristaltic Pump	Cole Parmer	EW-07522-20
Platinum pacing wire	Alfa Aesar	43275
Pluronic F127	ThermoFisher Scientific	P6867	nonionic, surfactant polyol
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Powerlab data acquisition and stimulator	AD Instruments	Powerlab 4/26
RH237	Biotium	61018
Rhod2AM	ThermoFisher Scientific	R1245MP
Rhod-2AM	Invitrogen, Carlsbad, CA
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625
Sterilizer, dry bead	Sigma-Aldrich	Z378550
Stone Oxygen Diffuser	Waterwood	B00O0NUVM0
TissueSeal - Histoacryl Topical Skin Adhesive	gobiomed	AESCULAP
UltraPure Low Melting Point Agarose	Thermo Fisher Scientific	16520100
Ultrasound sonicator		Branson 1800
Vibratome	Campden Instruments	7000 smz