מורנה דיוק-גזור פרוסות הכבד כמודל Vivo Ex של ביולוגיה של הכבד

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ואמינה לייצור פרוסות כבד בר קיימא לחתוך מפני עכברים. Vivo דגימות רקמות לשעבר יכול להישמר תחת רקמת המעבדה התנאים התרבות במשך ימים מרובים, מתן מודל גמיש לבחון פתוביולוגיה בכבד.

Abstract

הבנת המנגנונים של פגיעה בכבד, פיברוזיס בצהבת, ושחמת כי התחתון מחלות כבד כרונית (כלומר, נגיפי הפטיטיס, מחלת כבד שומני לא אלכוהוליים, מחלת כבד מטבולית, סרטן הכבד) דורש מניפולציה ניסויית של מודלים של בעלי חיים. ובתרבויות של תאי מבחנה שתי טכניקות יש מגבלות, כגון הדרישה של מספר גדול של בעלי חיים עבור מניפולציה vivo. עם זאת, בתרבויות מחוץ לגופית לא לשכפל את המבנה ואת התפקוד של הסביבה הכבד הרב-תאיים. השימוש של פרוסות הכבד בדיוק לחתוך היא טכניקה שבה פרוסות אחיד של כבד העכבר הקיימא נשמרים בתרבות רקמת המעבדה לטיפול ניסיוני. טכניקה זו ממלאת את הנישה הניסיונית הקיימת בין לימודי בעלי חיים ובשיטות תרבות של תאי מבחנה. הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה פשוטה ואמינה לבידוד והתרבות לחתוך בדיוק פרוסות הכבד מעכברים. כיישום של טכניקה זו, פרוסות vivo הכבד לשעבר מטופלים עם חומצות מרה כדי לדמות פציעה בכבד כולסטטי ובסופו של דבר להעריך את המנגנונים של פיברוגנזה הכבד.

Introduction

הפתוגנזה של רוב מחלות הכבד כרונית (כלומר, דלקת הכבד ויראלי, steatohepatitis שאינם אלכוהוליים, פגיעה בכבד כולסטטי וסרטן הכבד) כרוך אינטראקציות מורכבות בין סוגים שונים של תאי הכבד הכונן הדלקת, פיברוגנזה, סרטן התפתחות^1,2. כדי להבין את המנגנונים המולקולריים הנמצאים בבסיס המחלות הכרוניות המבוססות על הכבד, יש לחקור את האינטראקציות בין סוגי תאי הכבד המרובים. בעוד קווי הכבד מרובים (ולאחרונה, אורגנואידים) יכול להיות תרבותי בתוך מבחנה, מודלים אלה לא לחקות במדויק את המבנה המורכב, פונקציה, ומגוון הסלולר של מיקרוסביבה הכבד³. יתרה מזאת, תאי כבד מתורבתים (בפרט, קווי תאים שעברו טרנספורמציה) עלולים לסטות מהביולוגיה המקורית של המקור. מודלים בעלי חיים משמשים ניסויים כדי לחקור את האינטראקציות בין סוגי תאי הכבד המרובים. עם זאת, הם עשויים להיות מופחתים באופן משמעותי בהיקף של מניפולציה ניסויית, בשל השפעות משמעותיות מחוץ ליעד באיברים הכבד ביותר (למשל, כאשר בדיקת therapeutics פוטנציאלי).

השימוש המדויק בפרוסות הכבד (pcls) בתרבות הרקמה היא טכניקה ניסיונית המשמשת לראשונה מטבוליזם של תרופות ומחקרים רעילות, והוא כולל את החיתוך של קיימא, בדיקת דק (סביב 100 לערך 250 יקרומטר עבה) הכבד פרוסות. זה מתיר את מניפולציה ניסיוני ישיר של רקמת הכבד לשעבר vivo⁴. הטכניקה מגשרת על פער ניסיוני בין מחקרי בעלי חיים vivo ובשיטות תרבות של תאי מבחנה, התגברות על החסרונות הרבים של שתי השיטות (כלומר, מגבלות מעשיות על מגוון הניסויים שניתן לבצע בחיות שלמות, כמו גם אובדן מבנה/תפקוד ומגוון הסלולר עם שיטות התרבות של תאי מבחנה).

יתר על כן, PCLS מגביר במידה רבה את הקיבולת הניסיונית בהשוואה למחקרים בעלי חיים שלמים. כמו עכבר אחד יכול לייצר יותר מ 48 פרוסות הכבד, זה גם מקל על השימוש הן בשליטה והן קבוצות טיפול מאותו כבד. בנוסף, הטכניקה מפרידה פיזית את רקמת הכבד ממערכות איברים אחרים; לכן, הוא מסיר תופעות פוטנציאליות מחוץ ליעד שיכולות להתרחש בחיות שלמות בעת בדיקת ההשפעות של גירוי אקסוגני.

בפרוטוקול זה, PCLS מופקים באמצעות הרטט עם להב רוטט. מחקרים אחרים השתמשו בהצלחה Krumdieck רקמת רקמה, כפי שמתואר Olinga ו שוסטר⁵. בתוך הרטט, רטט לרוחב של הלהב מונע קריעה של הרקמה האולטרה דקה הנגרמת על ידי מתח הטיה, כמו להב נדחף לתוך הרקמה. הן מבצעה הרטט ו Krumdieck רקמות לעבוד ביעילות ללא הטבעה מבנית של רקמת הכבד, אשר מייעל את הליך הפרוסות. טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי ליצור PCLS מכבדים חולים, כולל אלה מדגמי העכבר פיברוזיס/שחמת⁶ ו steatosis הכבד⁷.

בנוסף להדגים את הטכניקות הדרושות לתרבות ההכנה והרקמה של pcls, דו ח זה גם בוחן את הכדאיות של רקמות אלה vivo ex על ידי מדידת אדנוזין טריפוספט (ATP) רמות בדיקת היסטולוגיה רקמות להעריך נמק פיברוזיס. כהליך ניסיוני מייצג, pcls מטופלים עם ריכוזי pathophysiological של שלוש חומצות מרה שונות (גליקולפילית, טאורוכופילית, חומצות כולית) כדי לדמות פציעה בכבד כולסטטי. בהקשר של פציעה בכבד כיס המרה, חומצה taurocholic בפרט הוכח להיות גדל באופן משמעותי הן סרום ומרה של ילדים עם סיסטיק פיברוזיס הקשורים בכבד המחלה⁸.

תאים מחולל הכבד גם טופלו בחלל החוץ עם חומצה taurocholic לדמות את רמות החומצה הגבוהות taurocholic נצפתה בחולים, טיפול זה גרם התפשטות מוגברת ובידול של תאים מחולל הכבד לקראת המרה (המרה) פנוטיפ⁹. לאחר מכן, PCLS טופלו לשעבר vivo עם רמות גבוהות של חומצה taurocholic, ומוגברת סמנים המרה הלוציט נצפו. זה תומך בהתבוננות מחוץ לגופית כי חומצה taurocholic מניע התפשטות המרה ו/או בידול בהקשר של רפואת ילדים סיסטיק פיברוזיס הקשורים מחלת כבד⁹.

Protocol

כל ניסויי החיות בוצעו בהתאם לקוד האוסטרלי לטיפול ולשימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות במכון למחקר רפואי ע י מכון ברגפר, באישור ועדת האתיקה של בעלי החיים. זכר C57BL/6 עכברים (15 עד 20 שבועות) התקבלו ממרכז משאבי בעלי חיים, WA, אוסטרליה.

הערה: כל הפתרונות, המדיה, המכשירים, החומרה והצינורות הקשורים לדגימות חייבות להיות מעקרים או מעוקרים באופן יסודי עם תמיסת אתנול 70% ומטופלת באמצעות טכניקות סטריליות כדי למזער את הסיכון לזיהום תרבותי.

1. ההתקנה של התאמת הרטט

1. הכנת פתרון מאגר קרבס סטרילי-Henseleit עם 2 g/L גלוקוז (). בדוק כי ה-pH של המאגר הוא 7.4. אם ה-pH הוא גבוה יותר, לרוויה המאגר עם קרבוגן (95% O₂ + 5% CO₂) או מודונט בתוך 5% co₂ חממה התרבות רקמה כדי לתקן את המערכת ביקרבונט אגירה. להכניס למקרר את הפתרון האטום של מאגר סטרילי ב-4 ° c.
2. הכנס את להב הרטט לתוך הזרוע החותכת. ודא כי הלהב הוא קבוע היטב את הזרוע חיתוך, כמו תנודות יכול לגרום ללהב לבוא רופף.
3. חטא את הלהב ואת הזרוע חיתוך עם פתרון אתנול 70%.
   התראה: הימנע ממגע עם הלהב.
4. לחטא את מגש מאגר עם פתרון אתנול 70% ולנגב אותו עם רקמה סטרילית.
5. הכנס את מגש המאגר לתוך הרטט והדק את מנגנון ההרכבה.
6. הגדר את הזרוע החותכת לגובה המרבי הזמין.
7. הגדר את זווית הלהב ל-10 ° מתחת לאופקי, משופע מטה למדגם. ודא שזווית הלהב תוקנה באופן הדוק.
   הערה: זווית הלהב האופטימלית עשויה להיות שונה בהתאם למודל הרטט ולמאפייני הרקמה.
8. לחטא את מחזיק הדגימה בתמיסה. של 70% אתנול
9. חברו את המים הצוננים לצידנית התרמואלקטריים של פלטייר הממוקם מתחת למגש המאגר.
   הערה: חלק מדגמי הרטט משתמשים באמבט קרח לצינון במקום.
10. התקן את צינור המים לניקוז. והפעל את המים הגדר את הצידנית ל-4 ° c. הפעל מים מצוננים בקצב של > 400 מ ל/דקה.
11. למלא את מגש המאגר כמעט למעלה עם סטרילי קר מאגר קרבס-Henseleit (עם גלוקוז 2 g/L). השאר פתרון מאגר נוסף של Krebs-Henseleit על הקרח.

2. הסרת כבד והכנה

1. חטא או חטא את כל כלי הניתוח כולל מלקחיים מעוקלים, מלקחיים שטוחים מרובע טיפ, מלקחיים, מלחציים כירורגיים, ומספריים באמצעות אוטוקלינג.
2. לפני הסרת הכבד, עכברים מורדם עמוקות באמצעות הזרקה התוך הצפק של 100 mg/ק"ג ו 12.5 מ"ג/ק"ג xylazine.
   הערה: ניתן להשתמש בהרדמה אחרת, או שעכברים יכולים להיות מורדמים על ידי שיתוף₂ חנק צוואר הרחם אם הכבד מוסר במהירות כדי למנוע נזק בהשפעת היפוקסיה.
3. חיטוי משטחי העור על עכברים על ידי הרטבה עם 70% אתנול פתרון. עכברים מאובטחים על גבם. עם כל הגפיים המוצמדים ללוח מבתר
4. להפוך את קו האמצע אנכית חתך לתוך העור מהבסיס של חלל הבטן כדי ממש מעל הסרעפת.
   הערה: חתכים לעבר הגפיים עשויים להקל על הנסיגה של העור.
5. משוך את העור לאחור תוך חיתוך כל רקמת החיבור בין העור לבין חלל הבטן. למנוע העברת שיער לחלל הבטן ככל האפשר. להצמיד או להדק את העור הרחק מחלל הבטן.
6. באמצעות מלקחיים ומספריים נקיים, פתח את חלל הבטן ואת חלל החזה התחתון.
7. הסרת הכבד במהירות מבלי לפגוע באונות
   1. באמצעות כלים בוטה (למשל, מלקחיים שטוח קצה מרובע), מדריך את האונות בכבד העליון כלפי מטה לכיוון הבטן. חותכים את רקמת החיבור סביב האונות בכבד העליון באמצעות מספריים.
   2. מדריך את האונות הכבד כלפי מעלה לכיוון הסרעפת. להחזיק את צרור כלי הדם המרכזי של הכבד עם מלקחיים.
      הערה: הוא לא ישפיע על ההליך אם צרור כלי הדם המרכזי ניזוק.
   3. משוך את צרור כלי הדם המרכזי הרחק מהעכבר וחותכים את רקמת החיבור הנותרת, כלי הדם, וכו ' כדי להסיר את הכבד. לטפל לא 1) לפגוע באונות הכבד 2) חותכים למערכת העיכול, כמו זה עשוי לזהם את הכבד עם מיקרואורגניזמים.
8. מניחים את הכבד הוסר לתוך סטרילי 10 ס מ רקמת העור מאכל חצי מלא עם הקרח קר קרבס-Henseleit מאגר פתרון. באמצעות כלי קהה להנחות את האונות, לחתוך את מרכז הכבד כדי לחלק אותו לאונות נפרדות.
9. בחר אונה אחת הכבד (להשתמש הגדול ביותר הראשון), ולמקם אותו בצד שטוח למטה אל הצלחת חדש סטרילי 10 ס מ. לשמור את כל האונות הכבד האחרים בצלחת של הפתרון באגירה Krebs-Henseleit מאוחסן בקרח לשימוש הבאים.
10. קיצוץ סביב 10% של החומר מהקצה הגבוה ביותר של אונה הכבד תוך שכיבה שטוח.
    הערה: זמירה חשוב, כמו קצה הרקמה הזאת יהיה ליצור קשר עם להב החיתוך הראשון; לכן, קצה רקמת כי הוא בניצב יחסית להב חיתוך ימנע דחיסת רקמות שיכול להתרחש בגלל זוויות שטחיות באונות הכבד נימולים.
11. חתוך את שלושת הקצוות האחרים של הרקמה.
    הערה: פעולה זו מסירה חלק מהקפסולה של גליסון הסיבי ותהפוך את הפרדת הרקמה לקלה יותר.
12. הרכבת את אונה הכבד על מחזיק הדגימה
    1. מניחים שכבה דקה של דבק ציאנואקרילי (דבק-דביק או רפואי/וטרינרי דבק ציאנואקרילי) על מחזיק הדגימה כלפי החזית, בגודל קצת יותר גדול מאשר אונה הכבד גזוז.
       הערה: בדוק שדבק הציאנואקריאקרילי אינו כולל תוספים שאינם מוספים לציאנואקריל.
    2. בעדינות להרים את האונה הכבד עם מלקחיים סטרילי באמצעות פינה הרחק את חוד החיתוך, ואז טפיחה יבש כל מאגר שיורית מהצד השטוח של אונה הכבד באמצעות חומר סופג סטרילי.
    3. מניחים את הצד השטוח הגדול של אונה הכבד על טלאי דבק כציאנואקרילי עם הקצה הגדול ביותר הפונה לכיוון החזית. הרשו לו לרפא באוויר במשך 1-2 דקות.
       הערה: דבקים ציאנואקריל מרפאים במהירות (~ 2 דקות) בתגובה ללחות שיורית וחלבונים ברקמות, והם יחברו בחוזקה את הרקמה למחזיק הדגימה.

3. ייצור פרוסות כבד

1. מניחים את מחזיק הדגימה עם אונה של הכבד המצורפת לתוך מגש מאגר הרטט. ודא שאונה הכבד מכוסה במלואו במאגר.
   הערה: במידת הצורך, מעלה את רמת הפתרון של מאגר קרבס-Henseleit הקרה. אם רמת המאגר מסתירה את תהליך החיתוך, הגדל או הקטן את הרמה.
2. . הגדר את מהירות החיתוך
   הערה: ייתכן שיהיה צורך באופן אמפירי בהתאם לדגם הרטט ולמאפייני הלהב. כמדריך התחלתי, להשתמש במהירות של 57 Hz/3420 rpm. מהירות הרטט ניתן למדוד באמצעות יישום מנתח הספקטרום אודיו על הטלפון החכם.
3. הנמך את להב החיתוך עד שהוא ממוקם ממש מעל אונה הכבד באמצעות חיוג גובה. תריץ את הזרוע החותכת. מעל הדגימה
4. החזר את הלהב בחזרה. בעזרת ידית הקראנק ברוורס הפעילו את הויברציות. תוך כדי החזרת הלהב לאחר שהלהב חזר ואינו מעל המדגם, הנמך את גובה הלהב על-ידי 250 μm.
5. חזרו על תהליך החיתוך עד להסרת החלק העליון של הרקמה. השמט את הפרוסות הראשונות, מכיוון שאלה יכילו את הקפסולה של גליסון ולכן אינן מכילות רקמת כבד תפקודית במיוחד בהשוואה לפרוסות אחרות.
6. כדי לחתוך פרוסות כבד, התקדם לאט את הלהב הרוטט לתוך הרקמה על ידי הפעלת הידית. השתמש מכחול קטן (חיטוי עם 70% אתנול פתרון) כדי להנחות בעדינות את הרקמה במהלך תהליך החיתוך.
7. השתמש במכחול כדי להרים את פרוסות הרקמה לחתוך ולמקם את פרוסת הרקמה לתוך צינור סטרילי של מאגר קרבס-Henseleit קר-קרח. כשלא בשימוש, שמרו על השפופרת על הקרח בין הפרוסות.
   הערה: לעיתים, הרקמה מתבעת בתהליך החיתוך, אך לרוב המטרות הרקמה עדיין שימושית.
8. חזור על תהליך החיתוך עד לבסיס של אונה הכבד הגיע. להיפטר כל פרוסות הכבד שניתן לראות דבק נרפא.
   הערה: הדבק הנרפא נראה כאזורים לבנים על פרוסות הרקמה. האונה של הכבד אופייני רק יש עובי שמיש של סביב 2 מ"מ. לכן, רק סביב 8 250 יקרומטר פרוסות הכבד מיוצרים מכל אונה.
9. חותכים את פרוסות הרקמה עד לקרבת הדבק הארוך. . אל תחתוך את הדבק
10. חזור על התהליך כולו עם אונות אחרות הכבד עד המספר הנדרש של פרוסות רקמות מתקבל.
11. כדי לנקות את הדבק והרקמה הרפאקריניקה מבעל הדגימה, השתמשו בלהב כדי לגרד את הדבק/הרקמה הנרפאים מהתערובת, או לרכך ולנקות את התערובת עם אצטון או דימתיל סולפוקסיד.

4. תרבית רקמה

הערה: יש לבצע את כל העבודות של תרבות הרקמה במכסה זרימה סטרילית.

1. בתרבות רקמה למינטת זרימה כיפה, פיפטה 1 מ ל של ויליאם E בינונית המכילה 2.0 g/L גלוקוז, 10% סרום של שור עוברי (FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין תוסף, 100 U/mL פניצילין, ו 100 μg/mL סטרפטומיצין לתוך 12 ובכן לוחות תרבות רקמה.
   הערה: ניתן גם להוסיף אנטיביוטיקה וסוכני פטרת אחרים. מחקרים מסוימים השתמשו תוספים במדיום דגירה הרקמה (כלומר, דקסמטסון ואינסולין¹⁰), אבל אלה יכולים להפריע איתות התא.
2. מניחים את הצינור המכיל פרוסות כבד מקרח לתוך המכסה של תרבות הרקמה. כדי להסיר את פרוסות הרקמה, בעדינות מערבולת את התערובת בעדינות עצה לתוך מאכל 10 ס מ סטרילי בזמן מתערבל.
3. באמצעות מלקחיים חד-^שנתייםואזמל, חותכים את פרוסות הרקמה למידות אחיד (כגון 15 מ"מ 2).
   הערה: שלב זה מבוצע כדי להבטיח שטח משטח עקבי. בגלל האונות בכבד העכבר שונים באופן משמעותי בגודל וכמה פרוסות רקמה יקרעו, זה יפיק מגוון של PCLS עם משטח שונים באזורים. הגדלים האחרונים של שטח ה-PCLS תלויים בכמות החומר הדרושה ביישומי הניתוח הבאים ובמספר הפעולות הדרושות. חיתוך PCLS גדול לחתיכות מרובות קטן יותר באותו גודל משוער לאפשר מספר גדל ומוגבר של משכפל ניסיוני.
4. באמצעות מלקחיים סטריליים או מכחול קטן, להעביר את פרוסות רקמה לחתוך לבארות של 12 צלחת לוחית המכילה 1 מ ל של בינוני.
   הערה: דאג לאשר את העקביות של עובי וצורה של פרוסות רקמה. מקטעים הכהים יותר מהממוצע מצביעים על עובי הרקמה גדול יותר וצריך להיפטר מהם. פרוסות קלות יותר מציעות נוכחות של דבק ציאנואקרילי מרפא וצורך להיפטר ממנו.
5. מודטה את פרוסות הכבד ב 37 ° צ' ו 5% CO₂ תחת 95% לחות.
   הערה: קבוצות אחרות השתמשו בשיטות כדי לשפר את אספקת החמצן ל-pcls, אשר מופיעים כדי להאריך את זמן הישרדות הרקמה^6,10,^11,12,13 (ראה^מקטעהדיון).
6. ביום שלמחרת, שנו את אמצעי התרבות באמצעות פיפטה ידני (במקום יניקה) כדי למנוע אובדן רקמות באמצעות שגיאות יניקה. לאחר מכן, שנה את המדיום ב-PCLS מדי יום. ה-PCLS מוכנים כעת לשימוש ניסיוני.

5. לדוגמה יישום של PCLS

1. ב 16 h לאחר הדור, לטפל pcls עם שלוש חומצות מרה שונות: חומצה גליכופילית (gca), חומצה taurocholic (tca), וחומצה כולית (CA) (כמו מלחי נתרן, הכל בריכוז של 150 μm) עבור 2 ימים.
2. לאחר 2 ימים של טיפול בחומצת מרה, חלץ mRNA על-ידי הצבת פרוסות רקמה במאגר לפירוק הקרח הקר של RNA והומוגון במהירות באמצעות חרוזים עם הומוגניצר חרוז ().
3. לטהר את ה-RNA באמצעות ערכת בידוד RNA () וליצור cdna מתוך rna מטוהרים.
4. ביצוע תגובת שרשרת פולימראז כמותית () באמצעות צבעי יסוד ספציפיים (שולחן 1) על cdna כדי לבחון את הביטוי הגנטי.

תוצאות

כדי לקבוע את הכדאיות התאית של PCLS לאורך זמן, רמות ATP של רקמות נמדדו. רמות ATP הן יחסיות בדרך כלל לכדאיות. PCLS (סביב 15 מ"מ² באזור) היו תרבותיים במדיום E של ויליאם רגיל עם 10% fbs, ואז בנקודות זמן ספציפיות, פרוסות הכבד הוסרו מן התרבות רקמה הומוגניים עם ATP ו חלבון (עבור נורמליזציה) ריכוזי (

Discussion

הפרוטוקול ממחיש את היישום של מורטין PCLS בידוד ותרבות רקמות, ואת ההליכים נועדו להעריך הן הכדאיות ואת כלי השירות, כמו גם לבחון את ההשפעות של מגשרים אקסוגני של הכבד ביולוגית באמצעות assays היסטולוגיה הביוכימי, ו qPCR. השירות הניסיוני של התרבות רקמות pcls במכרסמים ובבני אדם כבר הפגינו במגוון רחב של יי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri Dish	GREINER	664160	Sterile Dish
12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom	Greiner Bio-one	665180
70% Ethanol Solution (made with AR Grade)	Chem-Supply Pty Ltd	EA043-20L-P	Disinfection solution
Acetone	Chem-Supply Pty Ltd	AA008-2.5L
Cholic acid	Sigma-Aldrich	C1129-100G
Cyanoacrylate Super Glue	Parfix, DuluxGroup (Australia)		Other brands should work
Disposable Single Edge Safety Razor Blades	Mixed
Dissection Board	Made in-house		Sterile material over polystyrene
Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.02
Forceps sharp point 130 mm long	ThermoFisher Scientific	MET2115-130
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator	ThermoFisher Scientific	371
Glutamine	Life Technologies Australia Pty Ltd	25030081
Glycocholic acid hydrate	Sigma-Aldrich	G2878-100G
ISOLATE II RNA Mini Kit	Bioline (Aust) Pty Ltd	BIO-52073
Ketamine 50 ml	Provet	KETAI1
Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L	Sigma-Aldrich	K3753	Can also be made in house
Laminar Flow Hood			Hepa air filtration
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	ThermoFisher Scientific
Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml	Life Technologies Australia Pty Ltd	15140-122
Picro Sirius Red	ABCAM Australia Pty Ltd	ab246832
Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath	Interpath	24800
Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath	Interpath	24300
Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath	Interpath	24700
Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath	Interpath	24500
Precellys Homogeniser	Bertin Instruments	P000669-PR240-A
Protractor	Generic		To measure blade angle
Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block	Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific
Scalpel Blade	Mixed
Scalpel Blade Holder	Mixed
SensiFAST cDNA Synthesis Kit	Bioline (Aust) PTY LTD
Small Paintbrush with Plastic Handle	Mixed		Plastic handle resists ethanol
Square-Head Foreceps	Mixed
Sterile 50 ml Plastic Tubes	Corning Falcon	352098
Surgical Clamps	Mixed
Surgical Forceps	Mixed
Surgical Pins	Mixed
Surgical Scissors	Mixed
Taurochoic acid	Sigma-Aldrich	T-4009-5G
Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice	World Precision Instruments	SYS-NVSLM1	With thermoelectric cooling
Williams Medium E	Life Technologies Australia Pty Ltd	12551032	2.0 g/l glucose
Xylazine 100 mg/mL 50 mL	Provet	XYLAZ4