Murine Precision-Cut Liver Slices comme un modèle Ex Vivo de biologie du foie

Résumé

Ce protocole fournit une méthode simple et fiable pour la production de tranches de foie de précision viables de souris. Les échantillons de tissu ex vivo peuvent être maintenus dans des conditions de culture tissulaire de laboratoire pendant plusieurs jours, fournissant un modèle flexible pour examiner la pathobiologie de foie.

Résumé

Comprendre les mécanismes des lésions hépatiques, de la fibrose hépatique et de la cirrhose qui sous-tendent les maladies chroniques du foie (c.-à-d. l’hépatite virale, l’affection hépatique non alcoolique, l’affection hépatique métabolique et le cancer du foie) nécessite une manipulation expérimentale de modèles animaux et les cultures cellulaires in vitro. Les deux techniques ont des limites, telles que l’exigence d’un grand nombre d’animaux pour la manipulation in vivo. Cependant, les cultures cellulaires in vitro ne reproduisent pas la structure et la fonction de l’environnement hépatique multicellulaire. L’utilisation de tranches de foie coupées avec précision est une technique dans laquelle des tranches uniformes de foie de souris viable sont maintenues dans la culture tissulaire de laboratoire pour la manipulation expérimentale. Cette technique occupe une niche expérimentale qui existe entre les études animales et les méthodes de culture cellulaire in vitro. Le protocole présenté décrit une méthode simple et fiable pour isoler et culture des tranches de foie de précision-coupé de souris. Comme application de cette technique, les tranches de foie ex vivo sont traitées avec des acides biliaires pour simuler des lésions hépatiques cholestatiques et finalement évaluer les mécanismes de la fibrogenèse hépatique.

Introduction

La pathogénie de la plupart des maladies chroniques du foie (c.-à-d. l’hépatite virale, la stéatohépatite non alcoolique, les lésions hépatiques cholestatiques et le cancer du foie) implique des interactions complexes entre plusieurs types de cellules hépatiques différentes qui conduisent l’inflammation, la fibrogenèse, et le développement du cancer^1,2. Pour comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces maladies chroniques à base de foie, les interactions entre les multiples types de cellules hépatiques doivent être étudiées. Bien que les lignées cellulaires hépatiques multiples (et plus récemment, les organoïdes) peuvent être cultivées in vitro, ces modèles n’imitent pas exactement la structure complexe, la fonction et la diversité cellulaire du microenvironnement hépatique³. En outre, les cellules hépatiques cultivées (en particulier, les lignées cellulaires transformées) peuvent s’écarter de leur biologie source originale. Les modèles animaux sont utilisés expérimentalement pour étudier les interactions entre les multiples types de cellules hépatiques. Cependant, ils peuvent devenir considérablement réduits dans la portée pour la manipulation expérimentale, en raison d’effets hors cible significatifs dans les organes extrahépatiques (par exemple, lors de l’essai thérapeutiques potentielles).

L’utilisation de tranches de foie découpées de précision (PCLS) dans la culture tissulaire est une technique expérimentale utilisée pour la première fois dans les études sur le métabolisme des médicaments et la toxicité, et elle implique la coupe de tranches de foie viables, ultrathines (environ 100 à 250 m d’épaisseur). Cela permet la manipulation expérimentale directe du tissu hépatique ex vivo⁴. La technique comble un fossé expérimental entre les études animales in vivo et les méthodes de culture cellulaire in vitro, surmontant de nombreux inconvénients des deux méthodes (c.-à-d. des limites pratiques sur la gamme d’expériences qui peuvent être effectuées chez des animaux entiers ainsi que la perte de structure/fonction et de diversité cellulaire avec des méthodes de culture cellulaire in vitro).

En outre, pcLS augmente considérablement la capacité expérimentale par rapport aux études animales entières. Comme une souris peut produire plus de 48 tranches de foie, cela facilite également l’utilisation de groupes de contrôle et de traitement à partir du même foie. En outre, la technique sépare physiquement le tissu hépatique des autres systèmes d’organes ; par conséquent, il élimine les effets potentiels hors cible qui peuvent se produire chez les animaux entiers lors de l’essai des effets des stimuli exogènes.

Dans ce protocole, les PCLS sont générés à l’aide d’un vibratome avec une lame qui vibre latéralement. D’autres études ont utilisé avec succès un trancheur de tissu Krumdieck, tel que décrit dans Olinga et Schuppan⁵. Dans le vibratome, la vibration latérale de la lame empêche la déchirure du tissu ultrathin causé par le stress de cisaillement, comme la lame est poussée dans le tissu. Le vibratome et le trancheur de tissu de Krumdieck fonctionnent efficacement sans l’intégration structurelle du tissu de foie, qui simplifie la procédure de tranchement. Cette technique peut également être utilisée pour créer des PCLS à partir de foies malades, y compris ceux des modèles murins de la fibrose/cirrhose⁶ et la stéatose hépatique⁷.

En plus de démontrer les techniques requises pour la préparation et la culture tissulaire de PCLS, ce rapport examine également la viabilité de ces tissus ex vivo en mesurant les niveaux de triphosphate d’adénosine (ATP) et en examinant l’histologie de tissu pour évaluer la nécrose et la fibrose. En tant que procédure expérimentale représentative, les PCLS sont traités avec des concentrations pathophysiologiques de trois acides biliaires différents (acides glycocholiques, taurochiques et choliques) pour simuler des lésions hépatiques cholestatiques. Dans le contexte des lésions hépatiques cholestatiques, l’acide taurocholic en particulier s’est avéré être sensiblement augmenté dans le sérum et la bile des enfants atteints de fibrose kystique-associée à la maladie du foie⁸.

Les cellules progénitrices de foie ont également été traitées in vitro avec l’acide taurocholic pour simuler les niveaux élevés d’acide taurocholic observés dans les patients, et ce traitement a causé la prolifération accrue et la différenciation des cellules progénitrices de foie vers un phénotype biliaire (cholangiocyte)⁹. Par la suite, les PCLS ont été traités ex vivo avec des niveaux élevés d’acide taurocholic, et des marqueurs cholangiocytes accrus ont été observés. Ceci soutient l’observation in vitro que l’acide taurocholic conduit la prolifération biliaire et/ou la différenciation dans le contexte de la maladie hépatique kystique-associée pédiatrique⁹.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément au code australien pour les soins et l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques au QIMR Berghofer Medical Research Institute avec l’approbation du comité d’éthique animale de l’institut. Des souris mâles C57BL/6 (15-20 semaines) ont été obtenues auprès du Animal Resources Centre, WA, Australie.

REMARQUE : Toutes les solutions, médias, instruments, matériels et tubes qui contactent les échantillons doivent être stérilisés ou complètement désinfectés avec une solution d’éthanol de 70 % et manipulés à l’aide de techniques stériles pour minimiser le risque de contamination de la culture.

1. Configuration du vibratome

1. Préparer la solution tampon stérile Krebs-Henseleit avec 2 g/L de glucose Vérifiez que le pH du tampon est de 7,4. Si le pH est plus élevé, saturer le tampon avec du carbogène (95 % O₂ et 5 % de CO₂) ou incuber dans un incubateur de culture tissulaire de 5 % de CO₂ pour corriger le système de mémoire tampon du bicarbonate. Réfrigérer la solution tampon stérile scellée à 4 oC.
2. Insérez la lame vibratome dans le bras de coupe. Assurez-vous que la lame est bien fixée au bras de coupe, car les vibrations peuvent faire en sorte que la lame se détache.
3. Désinfecter la lame et couper le bras avec une solution d’éthanol à 70 %.
   AVERTISSEMENT : Évitez tout contact avec la lame.
4. Désinfecter le plateau tampon avec une solution d’éthanol de 70 % et essuyez-le avec un tissu stérile.
5. Insérez le plateau tampon dans le vibratome et resserrez le mécanisme de montage.
6. Réglez le bras de coupe à la hauteur maximale disponible.
7. Placez l’angle de la lame à 10 degrés au-dessous de l’horizontale, en pente vers le bas vers l’échantillon. Assurez-vous que l’angle de la lame est bien fixé.
   REMARQUE : L’angle optimal de la lame peut différer selon le modèle vibratome et les caractéristiques tissulaires.
8. Désinfecter le porte-échantillons avec une solution d’éthanol de 70 %.
9. Connectez l’eau de refroidissement pour la glacière thermoélectrique Peltier située sous le plateau tampon.
   REMARQUE : Certains modèles de vibratome utilisent plutôt un bain de glace pour se rafraîchir.
10. Fixer le tube d’eau à un drain et allumer l’eau. Réglez la glacière à 4 oC. Exécuter l’eau de refroidissement à un taux de 400 mL/min.
11. Remplissez le plateau tampon presque vers le haut avec le tampon sterile de glace-froid Krebs-Henseleit (avec 2 g/L de glucose). Laissez une solution tampon Krebs-Henseleit supplémentaire sur la glace.

2. Enlèvement et préparation du foie

1. Stérilisez ou désinfectez tous les instruments chirurgicaux, y compris les forceps incurvés, les forceps plats à pointe carrée, les pincettes, les pinces chirurgicales et les ciseaux à l’aide d’autoclaving.
2. Avant l’ablation du foie, anesthésiez profondément les souris à l’aide d’une injection intrapétonéale de 100 mg/kg de kétamine et de 12,5 mg/kg de xylazine.
   REMARQUE : D’autres anesthésiques peuvent être utilisés, ou les souris peuvent être euthanasiées par asphyxie de CO_{2/dislocation} cervicale si le foie est rapidement enlevé pour prévenir les dommages induits par l’hypoxie.
3. Désinfectez les surfaces cutanées sur les souris en mouillant avec une solution d’éthanol de 70 %. Sécurisez les souris sur le dos avec toutes les extrémités épinglées sur une planche de dissection.
4. Faire une incision verticale de ligne médiane dans la peau de la base de la cavité abdominale à juste au-dessus du diaphragme.
   REMARQUE : Des incisions vers les extrémités sont faites pour faciliter la rétraction de la peau.
5. Retirez la peau tout en coupant tout tissu conjonctif entre la peau et la cavité abdominale. Empêcher les cheveux d’être transférés à la cavité abdominale autant que possible. Épinglez ou serrez la peau loin de la cavité abdominale.
6. À l’aide de forceps et de ciseaux propres, ouvrez la cavité abdominale et la cavité thoracique inférieure.
7. Enlever le foie rapidement sans endommager les lobes
   1. À l’aide d’outils émoussés (p. ex., forceps plats à pointe carrée), guidez les lobes supérieurs du foie vers le bas vers l’abdomen. Couper le tissu conjonctif entourant les lobes du foie supérieur à l’aide de ciseaux.
   2. Guidez les lobes de foie vers le haut vers le diaphragme. Tenez le faisceau vasculaire central du foie avec des forceps.
      REMARQUE : Il n’affectera pas la procédure si le faisceau vasculaire central est endommagé.
   3. Éloignez le faisceau vasculaire central de la souris et coupez le tissu conjonctif restant, les vaisseaux sanguins, etc. pour enlever le foie. Prenez soin de ne pas endommager les lobes du foie et 2) coupés dans le tractus gastro-intestinal, car cela peut contaminer le foie avec des micro-organismes.
8. Placer le foie enlevé dans un plat stérile de culture tissulaire de 10 cm à moitié rempli de solution tampon Krebs-Henseleit glacée. À l’aide d’un instrument contondant pour guider les lobes, couper le centre du foie pour le diviser en lobes séparés.
9. Sélectionnez un lobe de foie (utiliser le plus grand premier), et placez-le côté plat vers le bas sur un nouveau plat stérile de 10 cm. Conservez tous les autres lobes hépatiques dans le plat de la solution tampon Krebs-Henseleit stockée sur la glace pour une utilisation ultérieure.
10. Couper environ 10% du matériel du bord le plus haut du lobe du foie tout en se trouvant à plat.
    REMARQUE : Le rognage est important, car ce bord tissulaire communiquera d’abord avec la lame de coupe ; par conséquent, un bord de tissu qui est relativement perpendiculaire à la lame de coupe empêchera la compression de tissu qui peut se produire en raison des angles peu profonds dans les lobes de foie non coupés.
11. Couper les trois autres bords de tissu.
    REMARQUE : Cela élimine une partie de la capsule fibreuse Glisson et facilitera la séparation des tranches de tissu.
12. Montage du lobe du foie sur le support du spécimen
    1. Placez une fine couche de colle cyanoacrylate (superglue ou colle cyanoacrylate de qualité médicale/vétérinaire) sur le support du spécimen vers l’avant, de taille légèrement plus grande que le lobe de foie paré.
       REMARQUE : Vérifiez que la colle cyanoacrylate ne contient pas d’additifs non cyanoacrylate.
    2. Ramassez doucement le lobe de foie avec des forceps stériles utilisant un coin loin du bord d’avant, puis tapotez n’importe quel tampon résiduel du côté plat du lobe de foie utilisant le matériel absorbant stérile.
    3. Placez le grand côté plat du lobe du foie sur le patch de colle cyanoacrylate avec le plus grand bord orienté vers l’avant. Laisser chauffer dans l’air pendant 1 à 2 minutes.
       REMARQUE : Les adhésifs cyanoacrylate guérissent rapidement (2 min) en réponse à l’humidité résiduelle et aux protéines tissulaires, et ils attacheront fermement le tissu au support du spécimen.

3. Production de tranches de foie

1. Placez le support du spécimen avec le lobe de foie attaché dans le plateau tampon vibratome. Assurez-vous que le lobe du foie est entièrement recouvert de tampon.
   REMARQUE : Si nécessaire, rechargez le niveau de solution tampon Krebs-Henseleit glacée. Si le niveau tampon obscurcit le processus de coupe, augmentez ou diminuez le niveau.
2. Réglez la vitesse de coupe.
   REMARQUE : Cela peut devoir être déterminé empiriquement en fonction du modèle vibratome et des caractéristiques de la lame. En tant que guide de départ, utilisez une vitesse de 57 Hz/3 420 tr/min. La vitesse vibratome peut être mesurée à l’aide d’une application d’analyseur de spectre audio sur un smartphone.
3. Abaissez la lame de coupe jusqu’à ce qu’elle soit située juste au-dessus du lobe du foie à l’aide du cadran de hauteur. Exécuter le bras vibrant de coupe sur l’échantillon.
4. Remettre la lame en arrière à l’aide de la poignée de manivelle à l’envers. Activer les vibrations tout en retournant la lame. Une fois la lame retournée et n’est pas au-dessus de l’échantillon, abaissez la hauteur de la lame de 250 m.
5. Répétez le processus de coupe jusqu’à ce que le dessus du tissu soit enlevé. Jetez les premières tranches, car celles-ci contiendront la capsule de Glisson et ne contiennent donc pas beaucoup de tissu hépatique fonctionnel par rapport à d’autres tranches.
6. Pour couper les tranches de foie, faites avancer lentement la lame vibrante dans le tissu en tournant la poignée. Utilisez un petit pinceau (désinfecté avec une solution d’éthanol à 70 %) pour guider doucement le tissu pendant le processus de coupe.
7. Utilisez le pinceau pour soulever les tranches de tissu coupé et placer la tranche de tissu dans un tube stérile de tampon Krebs-Henseleit glacé. Lorsqu’il n’est pas utilisé, gardez ce tube sur la glace entre les tranches.
   REMARQUE: Parfois, le tissu ne se déchire pendant le processus de coupe, mais pour la plupart des fins le tissu est encore utilisable.
8. Répétez le processus de coupe jusqu’à ce que la base du lobe du foie soit atteinte. Jetez les tranches de foie qui ont de la colle visible guérie.
   REMARQUE : La colle guérie est visible sous forme de zones blanches sur les tranches de tissu. Un lobe typique du foie n’aura qu’une épaisseur utilisable d’environ 2 mm. Par conséquent, seulement environ huit tranches de foie de 250 m sont produites à partir de chaque lobe.
9. Couper les tranches de tissu jusqu’à ce que près de la colle cyanoacrylate. Ne pas couper dans la colle.
10. Répétez le processus entier avec d’autres lobes de foie jusqu’à ce que le nombre requis de tranches de tissu soit obtenu.
11. Pour nettoyer la colle et le tissu de cyanoacrylate guéris du support de spécimen, soit utilisez une lame pour gratter le mélange de colle/tissu guéri, soit ramollissez et nettoyez le mélange avec de l’acétone ou du sulfure de diméthyle.

4. Culture tissulaire

REMARQUE : Tous les travaux de culture tissulaire doivent être exécutés dans un capot de flux laminar stérile.

1. Dans un capot de flux laminaire de culture tissulaire, pipette 1 ml de médium E de William contenant 2,0 g/L de glucose, 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM L-glutamine supplément, 100 U/mL pénicilline, et 100 'g/mL streptomycine en 12 plaques de culture de tissu bien.
   REMARQUE : D’autres antibiotiques et agents antifongiques peuvent également être ajoutés. Certaines études ont utilisé des additifs dans le milieu d’incubation des tissus (c.-à-d. la dexaméthasone et l’insuline^10),mais ceux-ci peuvent interférer avec la signalisation cellulaire.
2. Placez le tube contenant des tranches de foie de la glace dans le capot de la culture tissulaire. Pour enlever les tranches de tissu, faire tourbillonner doucement le mélange et verser délicatement dans un plat stérile de 10 cm tout en tourbillonnant.
3. À l’aide de forceps stériles à pointes pointues et d’un scalpel, coupez les tranches de tissu en tailles à peu près uniformes (p. ex., 15 mm^2).
   REMARQUE : Cette étape est effectuée pour assurer une surface uniforme. Puisque les lobes de foie de souris sont sensiblement différents dans la taille et quelques tranches de tissu se déchireront, ceci produira une gamme de PCLS avec des secteurs variables de surface. La taille finale de la surface du PCLS dépend de la quantité de matière nécessaire dans les applications d’analyse ultérieures et du nombre de répliques nécessaires. Couper de gros PCLS en petits morceaux multiples de la même taille approximative permettra innée un nombre accru de répliques expérimentales.
4. À l’aide de forceps stériles ou d’un petit pinceau, transférer les tranches de tissu coupé dans les puits d’une plaque de 12 puits contenant 1 ml de milieu.
   REMARQUE : Prenez soin de confirmer la consistance de l’épaisseur et de la forme des tranches de tissu. Les sections plus foncées que la moyenne suggèrent que l’épaisseur du tissu est plus grande et doit être jetée. Des tranches plus légères suggèrent la présence de colle cyanoacrylate guérie et doivent être jetées.
5. Incuber les tranches de foie à 37 oC et 5% de CO₂ sous 95% d’humidité.
   REMARQUE : D’autres groupes ont utilisé des méthodes pour améliorer la livraison d’oxygène aux PCLS, qui semblent prolonger le temps de survie des tissus^{6,10,11,12,13} (voir la section de discussion).
6. Le lendemain, changer le milieu de la culture à l’aide d’une pipette manuelle (plutôt que d’aspiration) pour prévenir la perte de tissu par des erreurs d’aspiration. Par la suite, changez le support sur le PCLS tous les jours. Les PCLS sont maintenant prêts pour une utilisation expérimentale.

5. Exemple d’application de PCLS

1. À 16 h après la génération, traiter les PCLS avec trois acides biliaires différents : l’acide glycocholique (GCA), l’acide taurocholic (TCA) et l’acide cholique (CA) (comme sels de sodium, le tout à une concentration de 150 m) pendant 2 jours.
2. Après 2 jours de traitement à l’acide biliaire, extraire l’ARNm en plaçant des tranches de tissu dans un tampon de lyse à ARN glacé et homogénéiser rapidement à l’aide de perles avec un homogénéisateur de perles
3. Purifier l’ARN à l’aide d’un kit d’isolation( Tableau des matériaux ) et créer l’ADNC à partir de l’ARN purifié.
4. Effectuez une réaction quantitative en chaîne de polymérased’amorces spécifiques(tableau 1) sur l’ADNC pour examiner l’expression des gènes.

Résultats

Pour déterminer la viabilité cellulaire des PCLS au fil du temps, les niveaux d’ATP tissu ont été mesurés. Les niveaux d’ATP sont généralement proportionnels à la viabilité. PCLS (environ 15 mm² dans la région) ont été cultivés dans le milieu normal de William E avec 10% FBS, puis à des points de temps spécifiques, les tranches de foie ont été enlevées de la culture tissulaire et homogénéisées avec des concentrations d’ATP et de protéines (pour la normalisation)

Discussion

Le protocole démontre l’application de l’isolement murine de PCLS et de la culture de tissu, et les procédures sont conçues pour évaluer la viabilité et l’utilité aussi bien que pour examiner des impacts des médiateurs exogènes de pathobiologie de foie utilisant des essais biochimiques, l’histologie, et qPCR. L’utilité expérimentale de la culture tissulaire PCLS chez les rongeurs et les humains a été démontrée dans un large éventail d’applications, y compris des investigations expérimentales d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri Dish	GREINER	664160	Sterile Dish
12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom	Greiner Bio-one	665180
70% Ethanol Solution (made with AR Grade)	Chem-Supply Pty Ltd	EA043-20L-P	Disinfection solution
Acetone	Chem-Supply Pty Ltd	AA008-2.5L
Cholic acid	Sigma-Aldrich	C1129-100G
Cyanoacrylate Super Glue	Parfix, DuluxGroup (Australia)		Other brands should work
Disposable Single Edge Safety Razor Blades	Mixed
Dissection Board	Made in-house		Sterile material over polystyrene
Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.02
Forceps sharp point 130 mm long	ThermoFisher Scientific	MET2115-130
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator	ThermoFisher Scientific	371
Glutamine	Life Technologies Australia Pty Ltd	25030081
Glycocholic acid hydrate	Sigma-Aldrich	G2878-100G
ISOLATE II RNA Mini Kit	Bioline (Aust) Pty Ltd	BIO-52073
Ketamine 50 ml	Provet	KETAI1
Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L	Sigma-Aldrich	K3753	Can also be made in house
Laminar Flow Hood			Hepa air filtration
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	ThermoFisher Scientific
Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml	Life Technologies Australia Pty Ltd	15140-122
Picro Sirius Red	ABCAM Australia Pty Ltd	ab246832
Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath	Interpath	24800
Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath	Interpath	24300
Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath	Interpath	24700
Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath	Interpath	24500
Precellys Homogeniser	Bertin Instruments	P000669-PR240-A
Protractor	Generic		To measure blade angle
Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block	Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific
Scalpel Blade	Mixed
Scalpel Blade Holder	Mixed
SensiFAST cDNA Synthesis Kit	Bioline (Aust) PTY LTD
Small Paintbrush with Plastic Handle	Mixed		Plastic handle resists ethanol
Square-Head Foreceps	Mixed
Sterile 50 ml Plastic Tubes	Corning Falcon	352098
Surgical Clamps	Mixed
Surgical Forceps	Mixed
Surgical Pins	Mixed
Surgical Scissors	Mixed
Taurochoic acid	Sigma-Aldrich	T-4009-5G
Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice	World Precision Instruments	SYS-NVSLM1	With thermoelectric cooling
Williams Medium E	Life Technologies Australia Pty Ltd	12551032	2.0 g/l glucose
Xylazine 100 mg/mL 50 mL	Provet	XYLAZ4