Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol farelerden canlı hassas kesilmiş karaciğer dilimleri üretimi için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar. Ex vivo doku örnekleri laboratuvar doku kültürü koşullarında birden fazla gün boyunca muhafaza edilebilir, karaciğer patobiyolojisi incelemek için esnek bir model sağlayan.

Özet

Kronik karaciğer hastalıklarının (viral hepatit, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı, metabolik karaciğer hastalığı ve karaciğer kanseri) altında yatan karaciğer hasarı, hepatik fibrozis ve siroz mekanizmalarının anlaşılması, hayvan modelleri ve in vitro hücre kültürleri. Her iki teknik de in vivo manipülasyon için hayvanların çok sayıda gereksinimi gibi sınırlamalar vardır. Ancak in vitro hücre kültürleri çok hücreli hepatik ortamın yapısını ve işlevini yeniden üretmez. Hassas kesilmiş karaciğer dilimlerinin kullanımı, deneysel manipülasyon için laboratuvar doku kültüründe tek tip fare karaciğeri dilimlerinin muhafaza edildiği bir tekniktir. Bu teknik, hayvan çalışmaları ve in vitro hücre kültürü yöntemleri arasında var olan deneysel bir niş kaplar. Sunulan protokol, farelerden hassas kesilmiş karaciğer dilimlerini izole etmek ve kültürü yapmak için basit ve güvenilir bir yöntemi tanımlar. Bu tekniğin bir uygulaması olarak, ex vivo karaciğer dilimleri kolestatik karaciğer hasarı simüle etmek ve sonuçta hepatik fibrogenez mekanizmaları değerlendirmek için safra asitleri ile tedavi edilir.

Giriş

En kronik karaciğer hastalıklarının patogenezi (yani, viral hepatit, nonalkolik steatohepatit, kolestatik karaciğer hasarı ve karaciğer kanseri) inflamasyon sürücü birden fazla farklı karaciğer hücre tipleri arasında karmaşık etkileşimler içerir, fibrogenezis, ve kanser gelişimi1,2. Bu kronik karaciğer bazlı hastalıkların altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için, birden fazla karaciğer hücre tipi arasındaki etkileşimler araştırılmalıdır. Birden fazla hepatik hücre hatları (ve daha yakın zamanda, organoidler) in vitro kültürlü olabilir iken, bu modeller doğru karmaşık yapısı, fonksiyonu taklit etmez, ve hepatik mikroçevre hücresel çeşitlilik3. Ayrıca, kültürlü karaciğer hücreleri (özellikle, dönüştürülmüş hücre hatları) orijinal kaynak biyolojisi sapma olabilir. Hayvan modelleri deneysel olarak birden fazla karaciğer hücre tipi arasındaki etkileşimleri araştırmak için kullanılır. Ancak, ekstrahepatik organlardaki (örn. potansiyel terapötikleri test ederken) önemli ölçüde hedef dışı etkiler nedeniyle deneysel manipülasyon kapsamı önemli ölçüde azalabilir.

Doku kültüründe hassas kesim karaciğer dilimlerinin (PCLS) kullanımı ilk olarak ilaç metabolizması ve toksisite çalışmalarında kullanılan deneysel bir tekniktir ve uygulanabilir, ultra ince (yaklaşık 100−250 μm kalınlığında) karaciğer dilimlerinin kesilmesini içerir. Bu karaciğer dokusu ex vivo4doğrudan deneysel manipülasyon sağlar. Bu teknik, in vivo hayvan çalışmaları ile in vitro hücre kültürü yöntemleri arasında deneysel bir uçurum arasında köprü kurarak, her iki yöntemin de birçok dezavantajının üstesinden gelerek (örneğin, tüm hayvanlarda yapIlebilen deneylerin çeşitliliğinin pratik sınırları nın yanı sıra in vitro hücre kültürü yöntemleri ile yapı/fonksiyon ve hücresel çeşitlilik kaybı) arasında deneysel bir boşluk vardır.

Ayrıca, PCLS tüm hayvan çalışmaları ile karşılaştırıldığında büyük ölçüde deneysel kapasitesini artırır. Bir fare 48'den fazla karaciğer dilimleri üretebilir gibi, bu da aynı karaciğer hem kontrol ve tedavi gruplarının kullanımını kolaylaştırır. Buna ek olarak, teknik fiziksel olarak diğer organ sistemlerinden karaciğer dokusu ayırır; bu nedenle, eksojen uyaranların etkilerini test ederken tüm hayvanlarda oluşabilecek potansiyel hedef dışı etkileri ortadan kaldırır.

Bu protokolde, PCLS yanal titreşen bıçak ile bir vibratom kullanılarak oluşturulur. Diğer çalışmalar başarıyla olinga ve Schuppan5açıklandığı gibi, bir Krumdieck doku dilimleyici kullandık. Vibratomda, bıçağın yanal titreşimi, bıçak dokuya itilirken, kesme stresinin neden olduğu ultra ince dokunun yırtılmalarını önler. Hem vibratom hem de Krumdieck doku dilimleyicisi, dilimleme işlemini kolaylaştıran karaciğer dokusunun yapısal olarak gömülmeden etkin bir şekilde çalışır. Bu teknik aynı zamanda fibrozis / siroz6 ve hepatik steatoz7fare modelleri de dahil olmak üzere, hastalıklı karaciğerlerden PCLS oluşturmak için kullanılabilir.

Bu rapor, PCLS'nin hazırlanması ve doku kültürü için gerekli teknikleri göstermenin yanı sıra, adenozin trifosfat (ATP) düzeylerini ölçerek ve nekroz ve fibrozisi değerlendirmek için doku histolojisini inceleyerek bu ek sinol dokuların canlılığını da incelememektedir. Temsili bir deneysel prosedür olarak, PCLS kolestatik karaciğer hasarı simüle etmek için üç farklı safra asitleri (glikokolik, taurokolik ve kolik asitler) patofizyolojik konsantrasyonları ile tedavi edilir. Kolestatik karaciğer hasarı bağlamında, özellikle taurokolik asit kistik fibrozis ilişkili karaciğer hastalığı olan çocukların hem serum hem de safra önemli ölçüde artmış olduğu gösterilmiştir8.

Karaciğer progenitor hücreleri de hastalarda gözlenen yüksek taurokolik asit düzeylerini simüle etmek için taurokolik asit ile in vitro tedavi edilmiştir, ve bu tedavi bir biliyer doğru karaciğer progenitor hücrelerinin artan çoğalma ve farklılaşmasına neden oldu (kolanjiyosit) fenotip9. Daha sonra, PCLS taurokolik asit yüksek düzeyde ex vivo tedavi edildi, ve artmış kolanjiyosit belirteçleri gözlendi. Bu, taurokolik asit in vitro gözlem pediatrik kistik fibrozis ilişkili karaciğer hastalığı bağlamında safra proliferasyonu ve / veya farklılaşma sürücüler destekler9.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, enstitü hayvan etik komitesinin onayı ile QIMR Berghofer Tıbbi Araştırma Enstitüsü'nde hayvanların bilimsel amaçlarla bakımı ve kullanımı için Avustralya koduna uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Erkek C57BL/6 fareler (15−20 haftalık) Hayvan Kaynakları Merkezi, WA, Avustralya'dan elde edildi.

NOT: Numunelere temas eden tüm çözümler, ortamlar, aletler, donanım ve tüpler %70 etanol çözeltisi ile sterilize edilmeli veya iyice dezenfekte edilmeli ve kültür kontaminasyonu riskini en aza indirmek için steril teknikler kullanılarak işlenmelidir.

1. Vibratomun kurulumu

  1. Steril Krebs-Henseleit tampon çözeltisi 2 g/L glikoz(Malzeme Tablosu)ile hazırlayın. Arabellek pH 7.4 olup olmadığını kontrol edin. PH daha yüksekse, tamponu karbogen (%95 O2 + %5 CO2)ile doygunlayın veya bikarbonat tamponlama sistemini düzeltmek için %5 CO2 doku kültürü kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. Mühürlü steril tampon çözeltisini 4 °C'de soğutun.
  2. Vibratome bıçağını kesme koluna takın. Titreşimler bıçağın gevşemesine neden olabileceğinden, bıçağın kesme koluna sıkıca sabitlenmiş olduğundan emin olun.
  3. Bıçağı ve kesme kolunu %70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edin.
    DİkKAT: Bıçakla temastan kaçının.
  4. Tampon tepsiyi %70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edin ve steril bir doku ile silin.
  5. Tampon tepsiyi vibratome takın ve montaj mekanizmasını sıkın.
  6. Kesme kolunu mevcut maksimum yüksekliğe ayarlayın.
  7. Bıçak açısını yatayın 10° altına doğru ayarlayın ve numuneye doğru eğimli bir şekilde ayarlayın. Bıçak açısının sıkıca sabitolduğundan emin olun.
    NOT: Optimal bıçak açısı vibratom modeline ve doku özelliklerine bağlı olarak farklılık gösterebilir.
  8. Numune tutucuyu %70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edin.
  9. Tampon tepsinin altında bulunan Peltier termoelektrik soğutucuiçin soğutma suyunu bağlayın.
    NOT: Bazı vibratom modelleri yerine soğutma için bir buz banyosu kullanın.
  10. Su boruyu bir drenaj için sabitleyin ve su açın. Soğutucuyu 4 °C'ye ayarlayın. Soğutma suyunu >400 mL/dk hızında çalıştırın.
  11. Tampon tepsiyi neredeyse üst üste steril buz gibi Krebs-Henseleit tampon (2 g/L glikoz ile) ile doldurun. Buz üzerinde ek Krebs-Henseleit tampon çözeltisi bırakın.

2. Karaciğer kaldırma ve hazırlama

  1. Kavisli forceps, düz kare uçlu forceps, cımbız, cerrahi kelepçeler ve makas otoklavlama kullanarak dahil olmak üzere tüm cerrahi aletleri sterilize veya dezenfekte.
  2. Karaciğer çıkarmadan önce, 100 mg/kg ketamin ve 12.5 mg/kg ksilazin intraperitoneal enjeksiyon uğrama ile fareleri derinlemesine anestezi edin.
    NOT: Diğer anestezikler kullanılabilir veya karaciğer hipoksikaynaklı hasarı önlemek için hızlı bir şekilde çıkarılırsa co2 asfiksi/servikal çıkığı ile fareler ötenazi olabilir.
  3. %70 etanol çözeltisi ile ıslatarak farelerdeki cilt yüzeylerini dezenfekte edin. Tüm ekstremiteler bir diseksiyon tahtasına sabitlenmiş olan sırtlarında güvenli fareler.
  4. Karın boşluğunun tabanından diyaframın hemen üstüne kadar deriye dikey bir orta hat kesisi yapın.
    NOT: Ekstremitelere doğru kesiler cildin geri çekilmesini kolaylaştırmak için yapılır.
  5. Cilt ve karın boşluğu arasındaki herhangi bir bağ dokusunu keserken deriyi geri çekin. Saçın mümkün olduğunca karın boşluğuna transfer edilmesini önleyin. Cildi karın boşluğundan sabitle veya kenetle.
  6. Temiz forceps ve makas kullanarak, karın boşluğu ve alt torasik kavite açın.
  7. Loblar zarar vermeden hızlı bir şekilde karaciğer çıkarma
    1. Künt aletler (örn. düz kare uçlu forceps) kullanarak, üst karaciğer loblarını aşağıya doğru karına doğru yönlendirin. Makas kullanarak üst karaciğer lobları çevreleyen bağ dokusunu kesin.
    2. Karaciğer loblarını diyaframa doğru yukarı doğru yönlendirin. Forceps ile karaciğerin merkezi vasküler demet tutun.
      NOT: Merkezi vasküler paket zarar görmüşse işlemi etkilemez.
    3. Fare uzak merkezi vasküler demet çekin ve karaciğer kaldırmak için kalan bağ dokusu, kan damarları, vb kesin. 1) karaciğer lobları zarar ve 2) gastrointestinal sistem içine kesilmiş dikkat edin, Bu mikroorganizmalar ile karaciğer kontamine olabilir gibi.
  8. Çıkarılan karaciğeri buz gibi Krebs-Henseleit tampon çözeltisi ile yarı dolu steril 10 cm doku kültürü yemeğine yerleştirin. Loblar rehberlik etmek için kör bir alet kullanarak, ayrı loblar içine bölmek için karaciğer merkezi kesti.
  9. Bir karaciğer lobu seçin (ilk büyük kullanın), ve yeni bir steril 10 cm çanak üzerine düz tarafı aşağı yerleştirin. Sonraki kullanım için buz üzerinde depolanan Krebs-Henseleit tampon çözeltisi çanak tüm diğer karaciğer lobları tutun.
  10. Düz yatarken karaciğer lobunun en yüksek kenarından malzemenin yaklaşık% 10 kırpma.
    NOT: Bu doku kenarı kesme bıçağıilk temas edecek gibi kırpma önemlidir; bu nedenle, kesme bıçağına nispeten dik olan bir doku kenarı, kesilmemiş karaciğer loblarında sığ açılar nedeniyle oluşabilecek doku sıkıştırmasını önleyecektir.
  11. Diğer üç doku kenarını kırpın.
    NOT: Bu, lifli Glisson kapsülünün bir kısmını kaldırır ve doku dilimlerinin ayrılmasını kolaylaştırır.
  12. Numune tutucuya karaciğer lobu montajı
    1. Ön doğru örnek tutucu üzerine siyanoakrilat tutkal ince bir tabaka (superglue veya tıbbi / veteriner sınıf siyanoakrilat tutkal) yerleştirin, kesilmiş karaciğer lob biraz daha büyük.
      NOT: Siyanoakrilat tutkalının siyanoakrilat olmayan katkı maddeleri içermediğini kontrol edin.
    2. Yavaşça kesme kenarından bir köşe kullanarak steril forseps ile karaciğer lob almak, sonra steril emici malzeme kullanarak karaciğer lob düz tarafında herhangi bir artık tampon kuru pat.
    3. En büyük kenarı ön bakan siyanoakrilat tutkal yama üzerinde karaciğer lob büyük düz tarafı yerleştirin. 1−2 dk boyunca havada iyileşsin.
      NOT: Siyanoakrilat yapıştırıcılar, artık nem ve doku proteinlerine yanıt olarak hızlı bir şekilde (~2 dk) kürlenir ve bu da dokuyu numune tutucuya sıkıca bağlar.

3. Karaciğer dilimlerinin imalatı

  1. Vibratom tampon tepsisine bağlı karaciğer lobu ile numune tutucu yerleştirin. Karaciğer lobu tamamen tampon ile kaplı olduğundan emin olun.
    NOT: Gerekirse, buz gibi Krebs-Henseleit tampon çözeltisi seviyesini yükseltin. Arabellek düzeyi kesme işlemini gizlerse, düzeyi artırın veya azaltın.
  2. Kesme hızını ayarlayın.
    NOT: Bu vibratome modeli ve bıçak özelliklerine bağlı olarak ampirik olarak belirlenmelidir. Başlangıç kılavuzu olarak, 57 Hz/3,420 rpm hız kullanın. Vibratom hızı akıllı telefondaki ses spektrum analizörü uygulaması kullanılarak ölçülebilir.
  3. Yükseklik kadranını kullanarak kesme bıçağını karaciğer lobunun hemen üzerinde bulunana kadar indirin. Titreşen kesme kolunu numunenin üzerine çalıştırın.
  4. Krank tutamacını kullanarak bıçağı geri geri döndürün. Bıçağı döndürerken titreşimleri etkinleştirin. Bıçak geri döndükten ve numunenin üzerinde değilken, bıçak yüksekliğini 250 μm düşürün.
  5. Doku üst çıkarılınceye kadar kesme işlemini tekrarlayın. Bu Glisson kapsül içerecek ve bu nedenle diğer dilimler ile karşılaştırıldığında çok işlevsel karaciğer dokusu içermez gibi, ilk bir veya iki dilim atın.
  6. Karaciğer dilimlerini kesmek için, titreşen bıçağı sapı çevirerek yavaşça dokuya doğru ilerletin. Kesme işlemi sırasında dokuyu hafifçe yönlendirmek için küçük bir fırça (%70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edilir) kullanın.
  7. Kesilmiş doku dilimleri kaldırmak ve buz gibi Krebs-Henseleit tampon steril bir tüp içine doku dilimi yerleştirmek için paintbrush kullanın. Kullanılmadığında, bu tüpü dilimler arasında buz üzerinde tutun.
    NOT: Bazen, doku kesme işlemi sırasında gözyaşı yok, ama çoğu amaç için doku hala kullanılabilir.
  8. Karaciğer lobu tabanına ulaşılına kadar kesme işlemini tekrarlayın. Görünür tedavi tutkal olan herhangi bir karaciğer dilimleri atın.
    NOT: Kürlenmiş tutkal doku dilimleri üzerinde beyaz alanlar olarak görülebilir. Tipik bir karaciğer lobu sadece yaklaşık 2 mm kullanılabilir bir kalınlığa sahip olacaktır. Bu nedenle her lobdan sadece sekiz adet 250 m karaciğer dilimi üretilmektedir.
  9. Sikoakrilat tutkal yakın kadar doku dilimleri kesin. Tutkal içine kesmeyin.
  10. Gerekli sayıda doku dilimi elde edilene kadar tüm işlemi diğer karaciğer lobları ile tekrarlayın.
  11. Tedavi edilmiş siyanoakrilat tutkalını ve dokuyu numune tutucudan temizlemek için, ya kürlenmiş tutkal/doku karışımını kazımak için bir bıçak kullanın ya da karışımı aseton veya dimetil sülfoksitle yumuşatın ve temizleyin.

4. Doku kültürü

NOT: Tüm doku kültürü çalışmaları steril laminar akış başlığı nda yapılmalıdır.

  1. Bir doku kültürü laminar akış kaputunda, pipet 1 mL William's E orta içeren 2.0 g /L glukoz, 10% fetal sığır serum (FBS), 2 mM L-glutamin takviyesi, 100 U / mL penisilin, ve 100 μg/ mL streptomisin 12 iyi doku kültür plakaları içine.
    NOT: Diğer antibiyotikler ve antifungal ajanlar da eklenebilir. Bazı çalışmalarda doku kuluçka ortamı (yani, deksametazon ve insülin10)katkı maddeleri kullanmış, ancak bunlar hücre sinyalini engelleyebilir.
  2. Buzdan karaciğer dilimleri içeren tüpü doku kültürüne yerleştirin. Doku dilimlerini çıkarmak için, yavaşça karışımı girdap ve yavaşça girdap sırasında steril bir 10 cm çanak içine ucu.
  3. Steril keskin nokta lı forseps ve neşter kullanarak doku dilimlerini kabaca düzgün boyutlarda (örn. 15 mm2)kesin.
    NOT: Bu adım tutarlı bir yüzey alanı sağlamak için gerçekleştirilir. Fare karaciğer lobları boyutu önemli ölçüde farklı ve bazı doku dilimleri gözyaşı çünkü, bu değişen yüzey alanları ile PCLS bir dizi üretecektir. PCLS'nin son yüzey alanı boyutları, sonraki analiz uygulamalarında ne kadar malzemeye ihtiyaç duyulduğuna ve kaç çoğaltma gerektiğine bağlıdır. Büyük PCLS'nin aynı boyutta daha küçük birden fazla parçaya dönüştürülmesi doğuştan artan sayıda deneysel kopyaya olanak sağlayacaktır.
  4. Steril çalgılar veya küçük bir fırça kullanarak, kesilmiş doku dilimlerini 1 mL orta içeren 12 kuyuluk plakanın kuyularına aktarın.
    NOT: Doku dilimlerinin kalınlığının ve şeklinin kıvamını doğrulamaya özen gösterir. Ortalamadan daha koyu olan kesitler doku kalınlığının daha büyük olduğunu ve atılması gerektiğini düşündürmektedir. Daha hafif dilimler kürlenmiş siyanoakrilat tutkal varlığını öneririz ve atılması gerekir.
  5. Karaciğer dilimlerini 37 °C ve %52 CO 2%95 nem altında kuluçkaya yatırın.
    NOT: Diğer gruplar PCLS oksijen iletimini artırmak için yöntemler kullandık, hangi doku sağkalım süresini uzatmak için görünür6,10,11,12,13 (tartışma bölümüne bakın).
  6. Ertesi gün, emme hataları ile doku kaybını önlemek için manuel pipet (emme yerine) kullanarak kültür ortamını değiştirin. Daha sonra, PCLS'deki ortamı günlük olarak değiştirin. PCLS artık deneysel kullanıma hazırdır.

5. PCLS örnek uygulaması

  1. 16 saat post-jenerasyon, üç farklı safra asitleri ile PCLS tedavi: glikokolik asit (GCA), taurokolik asit (TCA) ve kolik asit (CA) (sodyum tuzları olarak, tüm 150 μM konsantrasyonda) 2 gün boyunca.
  2. 2 günlük safra asidi tedavisinden sonra, buz gibi RNA lizis tamponuna doku dilimleri yerleştirerek mRNA ayıklayın ve boncuk homogenizer(Malzeme Tablosu)ile boncuklar kullanarak hızlı bir şekilde homojenleştirin.
  3. RNA izolasyon kiti(Malzeme Tablosu)kullanarak RNA'yı arındırın ve saflaştırılmış RNA'dan cDNA oluşturun.
  4. Gen ekspresyonunu incelemek için cDNA üzerinde spesifik astarlar(Tablo 1)kullanarak nicel polimeraz zincir reaksiyonu(Malzeme Tablosu)gerçekleştirin.

Sonuçlar

ZAMAN IÇINDE PCLS hücre canlılığını belirlemek için, doku ATP düzeyleri ölçüldü. ATP düzeyleri genellikle canlılık ile orantılıdır. PCLS (yaklaşık 15 mm2 alan) normal William's E orta% 10 FBS ile kültürlü, daha sonra belirli zaman noktalarında, karaciğer dilimleri doku kültüründen çıkarıldı ve hem ATP ve protein ile homojenize (Normalizasyon için) konsantrasyonları(Tablo Malzemeler)

Tartışmalar

Protokol, murine PCLS izolasyon ve doku kültürünün uygulanmasını göstermektedir ve prosedürler hem canlılık hem de yarar değerlendirmek ve biyokimyasal tahliller, histoloji ve qPCR kullanarak karaciğer patobiyolojisi eksojen mediatörlerin etkilerini incelemek için tasarlanmıştır. Kemirgenlerde ve insanlarda PCLS doku kültürünün deneysel faydası, mikroRNA15/RNA9/protein ekspresyonu16, metabolizma17, viral ...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) (Grant No) araştırma hibe tarafından desteklenmiştir. APP1048740 ve APP1142394 g.a.r. için; APP1160323 için J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm Avustralya NHMRC kıdemli araştırma bursu tarafından desteklenir (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo, Madrid, İspanya'nın TALENTO programı (T1-BIO-1854) tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm Petri DishGREINER664160Sterile Dish
12 Well Tissue Culture Plate Flat BottomGreiner Bio-one665180
70% Ethanol Solution (made with AR Grade)Chem-Supply Pty LtdEA043-20L-PDisinfection solution
AcetoneChem-Supply Pty LtdAA008-2.5L
Cholic acidSigma-AldrichC1129-100G
Cyanoacrylate Super GlueParfix, DuluxGroup (Australia)Other brands should work
Disposable Single Edge Safety Razor BladesMixed
Dissection BoardMade in-houseSterile material over polystyrene
Fetal Bovine SerumGE Healthcare Australia Pty LtdSH30084.02
Forceps sharp point 130 mm longThermoFisher ScientificMET2115-130
Forma Steri-Cycle CO2 IncubatorThermoFisher Scientific371
GlutamineLife Technologies Australia Pty Ltd25030081
Glycocholic acid hydrateSigma-AldrichG2878-100G
ISOLATE II RNA Mini KitBioline (Aust) Pty LtdBIO-52073
Ketamine 50 mlProvetKETAI1
Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/LSigma-AldrichK3753Can also be made in house
Laminar Flow HoodHepa air filtration
NanoDrop 2000/2000c SpectrophotometersThermoFisher Scientific
Penicillin-Streptomycin, Liq 100 mlLife Technologies Australia Pty Ltd15140-122
Picro Sirius RedABCAM Australia Pty Ltdab246832
Pipette Tips Abt 1000 µl Filter InterpathInterpath24800
Pipette Tips Abt 10 µl Filter InterpathInterpath24300
Pipette Tips Abt 200 µl Filter InterpathInterpath24700
Pipette Tips Abt 20 µl Filter InterpathInterpath24500
Precellys HomogeniserBertin InstrumentsP000669-PR240-A
ProtractorGenericTo measure blade angle
Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 BlockApplied Biosystems/ ThermoFisher Scientific
Scalpel BladeMixed
Scalpel Blade HolderMixed
SensiFAST cDNA Synthesis KitBioline (Aust) PTY LTD
Small Paintbrush with Plastic HandleMixedPlastic handle resists ethanol
Square-Head ForecepsMixed
Sterile 50 ml Plastic TubesCorning Falcon352098
Surgical ClampsMixed
Surgical ForcepsMixed
Surgical PinsMixed
Surgical ScissorsMixed
Taurochoic acidSigma-AldrichT-4009-5G
Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized VibrosliceWorld Precision InstrumentsSYS-NVSLM1With thermoelectric cooling
Williams Medium ELife Technologies Australia Pty Ltd125510322.0 g/l glucose
Xylazine 100 mg/mL 50 mLProvetXYLAZ4

Referanslar

  1. Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
  2. Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
  3. Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
  4. Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
  5. Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
  6. Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
  7. Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
  8. Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
  9. Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
  10. Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
  11. Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
  12. Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
  13. Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
  14. Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
  15. Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
  16. van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
  17. Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
  18. Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
  19. Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
  20. Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
  21. Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
  22. van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
  23. Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
  24. Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta - Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
  25. Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
  26. Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
  27. Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
  28. Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
  29. Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
  30. Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 157karaci erdilimlervibratomex vivohepatositlerdokuk lt ry ld z h creleri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Araştırma

Eğitim

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır