JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מוצג כאן פרוטוקול כדי להעריך את המאפיינים ההתכווצות של שרירים מחוסנים myofibrils עם רזולוציית ננו ניוטון. הפרוטוקול משתמש בהתקנה עם גשוש כוח אופטי מבוסס אינטרפרומטריה. הגדרה זו יוצרת נתונים עם יחס אות לרעש גבוה ומאפשרת הערכה של קינטיקה מתכוובת של myofibrils.

Abstract

תאי שריר מחוסנים הם הכרחיים לפעילות של בני אדם ובעלי חיים. סיבי שריר יחיד מורכבים myofibrils, אשר מורכבים סרקומרים מקושרים באופן סדרתי, יחידות כיווץ הקטן ביותר בשריר. תפקוד סרקומרי תורם חולשת שרירים בחולים עם מוטציות בקידוד גנים עבור חלבונים סרקומריים. המחקר של מכניקה myofibril מאפשר הערכה של אינטראקציות actin-מיוסין ללא השפעות מבלבלות פוטנציאליות של מיו-בריאן פגום, סמוך בעת מדידת ההתכווצות של סיבי שריר יחיד. נזק אולטרה-סטרו-סטרו-סטריאלי ואי-יישור של מיו-בריאן עשויים לתרום להתכווצות לקויה. אם קיים נזק מבני ב myofibrils, הם צפויים לשבור במהלך הליך הבידוד או במהלך הניסוי. יתר על כן, מחקרים ב myofibrils לספק את ההערכה של אינטראקציות actin-מיוסין בנוכחות האילוצים הגיאומטריים של הסרקומרים. לדוגמה, מדידות ב myofibrils יכול להאיר אם תפקוד myofibrillar היא ההשפעה העיקרית של מוטציה בחלבון סרקומרי. בנוסף, עירוי עם פתרונות סידן או תרכובות הוא כמעט מיידי בשל הקוטר הקטן של myofibril. זה עושה myofibrils מתאים במידה רבה כדי למדוד את שיעורי ההפעלה והרפיה במהלך ייצור כוח. הפרוטוקול המתואר במאמר זה משתמש בבדיקה של כוח אופטי המבוססת על העיקרון של אינטרפרומטר Fabry-Pérot המסוגל למדוד כוחות בטווח ננו-ניוטון, בשילוב מנוע אורך piezo ומערכת התזת צעד מהירה. הגדרה זו מאפשרת את המחקר של מכניקה myofibril עם מדידות כוח ברזולוציה גבוהה.

Introduction

תאי שריר מחוסנים הם הכרחיים עבור פעילויות חיי היומיום. תנועת גפיים, תפקוד נשימתי, ותנועת שאיבה של הלב להסתמך על הכוח שנוצר על ידי תאי שריר. שריר השלד מורכב fascicles שריר המכיל חבילות של סיבי שריר יחיד(איור 1A). סיבי שריר אלה מורכבים myofibrils, אשר נוצרים על ידי סרקומרים מקושרים באופן סדרתי (איור 1B,D). הסרקומרים מכילים נבטים דקים ועבים. אלה מורכבים בעיקר משרשראות של מולקולות אקין ומיוסין, בהתאמה(איור 1B). אינטראקציות Actin-מיויסין אחראים על יכולת ייצור כוח של שריר. חולים עם מוטציות בגנים קידוד חלבונים סרקומריים, כגון ערפילין, א-אקטין, וטרופונין T, סובלים חולשת שרירים עקב תפקודלקוי 1.

את איכות התכווצויות השרירים ניתן ללמוד ברמות שונות של הארגון, החל בשרירים שלמים vivo כדי אינטראקציות actin-myosin במבחנה motility אומר. במהלך העשורים האחרונים פיתחו מספר קבוצות מחקר הגדרות כדי לקבוע את ההתכווצות של myofibrilsבודדים 2, 3,4,,55,6,7,8,9,10. הגדרות אלה מבוססות על זיהוי של שינויים בהטיית לייזר מ cantilever (כלומר, סטיית קרן אופטית) הנגרמת על ידי התכווצות myofibril (לפרטים, ראה Labuda ואח'11). למרות קביעת הפונקציה ההתכווצות של myofibrils יש כמה מגבלות (למשל, הדינמיקה של תהליכי צימוד התכווצות-התכווצות הדרה כי הם במעלה הזרם של myofibrils חסרים), ישנם יתרונות מרובים לגישה זו. אלה כוללים: 1) את היכולת להעריך אינטראקציות actin-myosin בנוכחות האילוצים הגיאומטריים של הסרקומרים; 2) היכולת להעריך אינטראקציות actin-myosin ללא השפעות מבלבלות פוטנציאליות של מיופילים פגומים, סמוכים (בעת מדידת ההתכווצות של סיבי שריר יחיד נזק אולטרסטרוקטואלי ויישור של myofibrils עשוי לתרום להתכווצות לקויה) (איור 1D); 3) הקוטר הקטן של myofibrils (~ 1 μm, איור 2A)וחוסר קרום לאפשר דיפוזיה סידן כמעט מיידית לתוך הסרקומרים. יתר על כן, אם נזק מבני קיים ב myofibrils, הם צפויים לשבור במהלך הבידוד שלהם או במהלך הניסוי. לפיכך, הערכת התכווצות myofibril היא שיטה אלגנטית ללמוד את המנגנונים הבסיסיים של התכווצות שרירים ולהבין אם אינטראקציות א-אקטין-מיויסין מופרעות הן הגורם העיקרי למחלת שרירים הנגרמת על ידי מוטציות בחלבונים סרקומריים.

פרוטוקול זה מציג התקנה חדשה שפותחה כדי לקבוע את ההתכווצות של myofibrils המשלבת בדיקה כוח cantilever עם רזולוציית ננו-ניוטון (כלומר, Optiforce). גשוש כוח זה מבוסס על עקרון האינטרפרומטריה. אינטרפרומטריה מאפשרת שימוש בטילברים נוקשים יחסית. זה מאפשר למדוד כוח עם הסטה קטנה של cantilever, מתקרב התכווצויות איזומטריות של myofibril. הגשושית מאפשרת הערכה של כוחות פסיביים ופעילים נמוכים המיוצרים על ידי מיופיל אחד מבודד מבריופסיות שרירים שונות, כולל אלה של בני אדם, עם יחס אות לרעש גבוה. הגשושית האופטית של כוח cantilever המשולבת בהתקנה זו מבוססת על אינטרפרומטר Fabry-Pérot12. האינטרפרומטר מזהה תזוזות קטנות בין סיב אופטי לבין קטילבר מצופה זהב המותקן על פרול(איור 3). הפער בין הסיב האופטי לבין ה-cantilever נקרא חלל פברי-פרוט. Myofibrils מותקנים בין הגשוש מנוע piezo באמצעות שני סיבי זכוכית מצופה דבק הרכבה. הכוח המיוצר על ידי myofibril יכול להיות נגזר מתמטית מנתוני interferometer. אינטרפרומטריה מבוססת על מיקום העל או הפרעה של שני גלים או יותר (בהתקנה זו שלושה גלי אור). אור לייזר עם אורך גל בין 1,528.77-1,563.85 ננומטר נפלט מהאינטרפרומטר ונשלח דרך הסיב האופטי. בגשוש, האור משתקף 1) בממשק בין הסיב האופטי למדיום(איור 3A); 2) בממשק של המדיום ואת cantilever (איור 3B); ו 3) בממשק בין ציפוי מתכת וזהב של cantilever (איור 3C). ההשתקפות בממשק A ו- B תלויה במדד שבירה (n) של המדיום שבו הגשוש שקוע. האור, המורכב משלוש ההשתקפויות על-ידי, חוזר לפוטודיודה באינטרפרומטר. הפוטודיודה מודדת את עוצמת האור, שהיא תוצאה של דפוס ההפרעה של שלוש ההשתקפויות המודחות. כאשר כוח מתכווץ נוצר על ידי הפעלה או מתיחה myofibril, myofibril מושך על cantilever. תנועה זו משנה את גודל החלל(ד) וכתוצאה מכך, את מספר אורכי הגל המתאימים לחלל. האור הממוקם ב-cantilever יהיה שלב אחר, וכתוצאה מכך דפוס הפרעה שונה. הפוטודיודה מתעדת את השינוי הזה בעוצמת תבנית ההפרעה כשינוי בוולטס. לאחר מכן, דור כוח myofibril מחושב משינוי זה, תוך מתן בחשבון את נוקשות cantilever. גשושית הכוח מכוילת על ידי היצרן על ידי דחיפת קצה מחט ההרכבה, מחובר לקצה ההצמדה החופשי של cantilever, נגד סולם שקילה תוך שמירה על כיפוף של cantilever שווה כפול של אורך הגל של לייזר קריאה13. לכן, אינטרפרומטריה היא שיטה רגישה מאוד לזיהוי שינויים קטנים במרחק, המאפשר מדידה של כוחות עם רזולוציית ננו-ניוטון. החלטה זו מאפשרת הערכה של ייצור כוח myofibrillar עם יחס אות לרעש גבוה. בעוד אינטרפרומטריה מסורתית מגבילה את טווח המידות לחלק הליניארי של עקומת ההפרעה, באמצעות מגברים נעילה ואפנן של אורך גל הלייזר מתגבר עלמגבלה זו 14. הדבר מוסבר ביתר פירוט בסעיף הדיון.

כדי למדוד את המתח הפעיל myofibril, מערכת התזת צעד מהיר שולבה כדי לחשוף את myofibril לפתרונותסידן (איור 4A). מערכת ההתמהמה המהירה מאפשרת שינויי פתרון להתרחש בתוך 10 ms. בגלל הקוטר הקטן שלהם, דיפוזיה סידן לתוך myofibrils הוא כמעט מיידי. לפיכך, מערכת זו מתאימה במיוחד למדידת שיעורי כריכת actin-myosin במהלך ההפעלה ושחרור במהלך הרפיה. ניתן לקבוע את קצב ההפעלה (kACT)ואת ההרפיה (kREL)מהקימורים להרפיה של ההפעלה. כמו כן, על ידי חשיפת myofibrils לפתרונות סידן של הגדלת הריכוז, יחסי כוח סידן ורגישות סידן ניתן לקבוע.

יתר על כן, מנוע אורך piezo מאפשר מתיחות וקיצור מהיר של myofibril. זה מציע את האפשרות ללמוד את המאפיינים ויסולסטי (כלומר, מתח פסיבי) של myofibril, כמו גם ביצוע קיצור מהיר של מיופיל כדי לקבוע את קצב פיתוח מחדש מתח (kTR). הפרמטרים שאוחזרו מניסווני מתח אקטיביים ופסיביים יכולים להשתנות על ידי מוטציות גנטיות בחלבון סרקומרי.

התקנה זו שנבנתה בהתאמה אישית שימשה כדי למדוד את המאפיינים האקטיביים והפסיביים של myofibrils מבודדים משריר בריא של אדם, מטופל ושרד עכבר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הפרוטוקול לקבלת ביופסיות אנושיות אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית במרכז הרפואי של אוניברסיטת VU (#2014/396) והתקבלה הסכמה מדעת בכתב מהנבדקים. הפרוטוקול לקבלת ביופסיות שריר בעלי חיים אושר על ידי הוועדה המקומית לאתיקה של בעלי חיים באוניברסיטת VU (AVD114002016501)

1. הכנה ובידוד מיו-פיבריל

הערה: השתמש בשיטות שתוארו קודם לכן כדי גליצרין ביופסיות, להכין אתפתרונות ריכוזסידן שונים (pCa) 7,16,17, ולבודד myofibrils2,18.

  1. להפשיר את מרגיע (pCa 9.0, Rx) והפעלה (pCa 4.5, Act) פתרונות, כמו גם את המעכבים (1 M E64, 1 M DTT, 1 M leupeptin, 1 M PMSF), אשר מאוחסנים ב -80 °C.
  2. קח חתיכה גליצרית של ביופסיית שרירים משוריע של כ 1מ"מ 3 ולמקם אותו בצלחת פטרי קטנה עם 1:1 Rx / גליצרול (v / v) פתרון ולמקם את צלחת פטרי על צלחת קרה ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. לנתח את פיסת השריר באמצעות מיקרוסקופ פעולה ומלקות, הפרדת סיבי שריר יחיד מבלי לבודד אותם מחתיכת שריר.
    הערה: להסיר כמה שיותר רקמת שומן וחיבור ככל האפשר כדי למנוע את הזיהום של השעיית myofibril.
  4. להעביר את פיסת הרקמה החתוכה לצינור 5 מ"ל עם 1.5 מ"ל של פתרון מרגיע עם מעכבים (1 μL/mL E-64, 1 μL/mL leupeptin, 1 μL/mL DTT, ו 125 μL/mL PMSF). מאפשרים לרקמות להתמתן בכ-4°C למשך שעה אחת.
  5. במהלך הדגירה, אתחל את שני המחשבים, הפעל את ההתקנים ופתח את התוכנה המשויכת (ראה טבלת חומרים).
  6. לשקוע גשושית הכוח במים אולטרה פורים בצלחת פטרי ולכייל את הגשוש.
    1. לחץ על 'אשף ההפעלה' באינטרפרומטר ובצע את ההוראות שעל המסך. לאחר לחיצה על כיול, הקש על שלב המיקרוסקופ.
      הערה: הקשה על שלב המיקרוסקופ תגרום לחיידק להסיט ולעבור דרך השוליים. הדבר מאפשר כיול הגשוש.
    2. השאירו את הגשוש שקוע במים האפורים במיוחד בצלחת פטרי לאחר הכיול.
  7. לאתחל את המיקום מנוע piezo. כך, בצע את אחד השלבים המפורטים להלן.
    1. כאשר מנוע piezo ישמש עבור מתח kTR, להגדיר את האורך 0 μm.
      ניתן למצוא הגדרות מחולל אותות בטבלה 1, איור 5A.
    2. כאשר מנוע piezo ישמש למתח פסיבי, להגדיר את האורך 50 μm.
      ניתן למצוא הגדרות מחולל אותות בטבלה 1.
      הערה: ההבדל בין השלבים הוא המיקום הראשוני של מנוע אורך piezo. כדי למתוח את myofibril, מנוע piezo צריך למשוך כדי להגדיל את המרחק בין מחטים הרכבה כדי להאריך את myofibril. כדי לרפף את myofibril, מנוע piezo צריך לדחוף כדי להקטין את המרחק בין מחטי הרכבה ולקצר את myofibril.
  8. הכן מגלשת מיקרוסקופ. פיפטה 150 μL של polyhydroxyethylhacrylate (פולי-HEMA) פתרון (5% פולי-HEMA ב 95% אתנול, w / v) על שקופית מיקרוסקופ ולהפיץ אותו על פני השקופית כך הכל מכוסה.
    הערה: אם מתלה myofibril הוא pipetted על שקופית מיקרוסקופ לא מצופים, myofibrils לשקוע לתחתית ייצמד לשקופית מיקרוסקופ ולא ניתן יהיה להדביק אותם.
  9. מלא מזרקים בפתרונות pCa (ראה איור 4A)וראש מערכת ההתבות.
    הערה: בשלבים אלה כל הצינורות ממולאים מראש עם הפתרון המתאים כדי לוודא שכל בועות האוויר מוסרות מהצינורות.
    1. מלא את צינורות הזרימה של זרימת הרקע של תא הזרימה (איור 3, 4A) עם Rx.
    2. בעת שימוש, לשטוף את הסעפת עם מים אולטרה פורים כדי להסיר את האוויר. כך, חבר את המזרק עם מים אולטרה-תכליתיים לשקע ושטוף אותו בכיוון ההפוך. חסום את היציאות שאינן נמצאות בהן סעפת.
    3. אפשר לכל מזרק pCa למלא את הצינורות שלהם בהתאמה עם פתרון pCa. לאחר מכן, חבר אותם לסעפת Ɵ הזאת.
    4. שסתומים פתוחים 1 ו-6 עם תוכנת לוח רכישת הנתונים (ראה טבלת חומרים)על-ידי בדיקת הלחצן '1+6' (איור 6A) כדי למלא את Ɵ-זכוכית עם מרגיע (pCa 9.0) והפעלה (4.5) פתרונות וסתומים סגורים כאשר Ɵ זכוכית מלאה(איור 6B).

2. הרכבת מיו-פיבריל

  1. ציפוי שקופית מיקרוסקופ עם פולי-HEMA כדי למנוע myofibrils להיצמד לזכוכית.
  2. הכינו את ההומוגניזר (ראה טבלת חומרים)להומוגניזציה של רקמות. נקה את מוט הרוטור הפנימי עם נייר טישו נקי, להרכיב את homogenizer, ולסובב 1x עבור 15 s באלכוהול ו שלוש פעמים עבור 15 s כל במים אולטרה טהורים. לשטוף מראש את homogenizer בתמיסה מרגיעה 1 x עבור 15 s על קרח.
  3. מניחים את מוט homogenizer בצינור המכיל את רקמת השריר כמתואר בשלב 1.4, תוך שמירה על הצינור על קרח, לסובב את הרוטור עבור 15 s על מהירות 5 לקרוע את רקמת השריר ולקבל מתלה myofibril.
  4. פיפט ~ 50 μL של מתלה myofibril ו ~ 250 μL של הפתרון המרגיע על שקופית מיקרוסקופ מצופה פולי-HEMA באמבט רקמות. זה יגבש טיפה נוזלית. מכסים את האמבטיה במכסה כדי להגן מפני אבק והמתינו 5-10 דקות כדי לאפשר למיו-פיברילים לשקוע לתחתית.
    הערה: היחס בין המתלים לפתרון המרגיע תלוי באיכות הבידוד, ולכן, מותאם בהתאם. לדוגמה, אם התשואה myofibril הוא נמוך וכמה myofibrils מתאים נוכחים השעיה, להוסיף יותר השעיה myofibril ולדלל עם פתרון פחות מרגיע (למשל, 75 μL של השעיה myofibril ו 225 μL של פתרון מרגיע). קל לזהות רקמת שריר הלב והשלד בשל דפוס ההתפתלות שלו. באמצעות מטרה 10x או 40x, דפוס זה גלוי גם מיו-פיבריל יחיד. במקרה רקמה אחרת נמצאת בהשעיה, myofibrils ניתן לבחור חזותית. אחד יכול לדלג על 5 - 10 דקות לחכות. עם זאת, זה מגביר את הקושי של ההבקת מיו-בריאן.
  5. מעיל הרכבה מחטים עם דבק (shellac + אתנול; 120 shellac מ"ג ב 2 מ"ל של 70% אתנול). כך, מחממים את הדבק ב-65°C ל-30-60 שניות ופיפטה ~ 6 μL על מגלשת זכוכית חדשה שאינה מצופים. טובלים את קצה כל מחט הרכבה בדבק וחוזרים על הפעולה עד ששכבת דבק נראית לעין. להזיז את הגשוש ואת piezo למעלה אנכית עם micromanipulators כדי לפנות מקום למקם את אמבט הרקמות על שלב המיקרוסקופ. הסר את מגלשת הזכוכית המכילה את הדבק.
  6. הרכבת המיו-פיברילים
    1. מניחים את אמבט הרקמות עם מגלשת המיקרוסקופ מצופה פולי-HEMA המכיל את מתלי myofibril על שלב המיקרוסקופ. השתמש בבמה כדי למצוא מיו-פיבריל מתאים עם המטרה 40x. במידת הצורך, להזיז ולסובב את אמבט הרקמות כדי להעביר את myofibril לעמדה הניתנת להרכבה.
      הערה: חפש myofibrils עם תבנית ההתלה הנראה כי הם כ 30 μm ארוך. כפי שמתואר בפירוט בשלבים 3.1 ו 3.2.1 ניתן לבדוק אורך ואורך sarcomere לפני ההתגלות myofibril. אין להדביק myofibrils קרוע, כי אלה צפויים לשבור במהלך התכווצות.
    2. החלק את תא הזרימה למקומו ישירות מעל הטיפה הנוזלית המכילה את המיו-פיבריל באמבט הרקמה (מקטר על המגלשה בשלב 2.4) והנמך אותה. עצור לפני שהוא פוגע בטיפה הנוזלית.
    3. מנמיך את מחט ההרכבה piezo ולחץ אותו בקצה התחתון של myofibril. הרם אותו מעט כדי לבדוק אם myofibril מחובר למחט.
    4. הנמך את תא הזרימה מספיק רחוק כדי שהמחט ההרכבה של הגשוש תגיע לתחתית מבלי שהגשוש ייגע בתא הזרימה.
    5. לחץ על מחט ההרכבה של הגשוש בקצה העליון של המיו-פיבריל. הרם אותו מעט כדי לבדוק אם myofibril מחובר למחט.
    6. הרם את המיו-פיבריל מתחתית האמבטיה ככל האפשר מבלי לאבד את היכולת להתמקד מבלי שהמטרה נוגעת בתחתית הזכוכית.

3. אתחול ניסוי

  1. השתמש micromanipulators, מצלמה, ותוכנה בקר מערכת (איור 7A, ראה טבלת חומרים) כדי למדוד את אורך sarcomere. להזיז את הפאיזו ו /או לכפות בדיקה כדי להגדיר את אורך sarcomere הראשוני של myofibril ל 2.5 μm.
    הערה: אורך סרקומר של 2.5 μm מבטיח חפיפה אופטימלית בין ראשי מיו-רין ו- actin.
  2. באמצעות פונקציית כלי השיט של תוכנת בקר המערכת למדוד את האורך והרוחב myofibril(איור 7B,C).
    הערה: בעת סיבוב המצלמה, היא עשויה להטות אופקית ו/או אנכית. כדי לבדוק את יישור המצלמה, ניתן להשתמש ברמת רוח כדי לוודא שהמצלמה מסתובבת ולא מוטה.
    1. מקם את המיו-פיבריל במרכז תמונת הווידאו באמצעות שלב המיקרוסקופ.
    2. צייר ריבוע מצד אחד של המיופיבריל לצד השני. לאורך, הקפד לכלול את הקצה הכהה שלטיפות הדבק (איור 2A)בריבוע מכיוון שעיבוד התמונה מבוסס על ניגודיות.
    3. התחל להקליט את הנתונים בתוכנה של בקר המערכת (ראה טבלת חומרים)על-ידי הקשה על 'התחל' ולאחר 5 שניות השהה את הקלטת נתוני התוכנה של בקר המערכת על-ידי לחיצה עללחצן' השהה'. האורך נרשם כעת בנתונים.
    4. עבור הרוחב סובב תחילה את המצלמה ב- 90° (ראה טבלת חומרים)ולאחר מכן השתמש בחדות הקצה של המיו-פיבריל עצמו.
    5. התחל להקליט את הנתונים בתוכנה של בקר המערכת (ראה טבלת חומרים)על-ידי הקשה על 'התחל' ולאחר 5 שניות השהה את הקלטת נתוני התוכנה של בקר המערכת על-ידי לחיצה עללחצן 'השהה'. הרוחב נרשם כעת בנתונים.
  3. אם יש לקבוע מתח פעיל של המיו-פיבריל, יש להשתמש בהגדרת ההתזות. אם כן, המשך לשלב 3.4. אם רק ייקבע מתח פסיבי, דלג על שלבים 3.4-4.1.3.7 והמשך בשלב 4.2.
  4. מקם ואותחל את כיוונון ההתזה.
    הערה: הדבר נחוץ רק לדור של כוח פעיל. המשך לשלב 4.2 בעת ביצוע ניסויי מתח פסיבי.
    1. הגדר את מיקום המנוע המהיר ב- 4 V(איור 5B).
    2. החלק את מעמד התוכונת על הטבלה כדי ליישר את הפינה השמאלית התחתונה של מעמד עם הקלטת על השולחן.
      הערה: היזהר לא להכות את הגשוש כוח או מנוע piezo.
    3. השתמש במניפולטור כדי למקם Ɵ בעין.
    4. הסתכלו דרך העינית והזיזו בזהירות את Ɵ התריס לכיוון המיו-פיבריל באמצעות המניפולטור.
    5. ישר את הערוץ העליון של Ɵ-זכוכית עם myofibril באמצעות מניפולטור ולבדוק את המיקום על ידי ביצוע שלב מהיר (הגדרות מחולל אותות ניתן למצוא בטבלה 1)עם תוכנת בקר המערכת (איור 2B–C, ראה טבלת חומרים).
      הערה: ודא כי הערוץ התחתון יהיה מיושר עם myofibril במהלך שלב ההפעלה של השלב המהיר (איור 2B–C).
  5. הפעל את זרימת הרקע של Rx (איור 4A) כדי ליצור זרימת רקע למינאר בתא הזרימה.
    הערה: זרימת הרקע נחוצה כדי למנוע זרימה סוערת כתוצאה מזרם פתרון pCa Ɵ ה-13.
    1. הפעל זרימה של תא זרימה עם ידית שסתום Luer.
      1. שלח את הפרמטרים הבאים למשאבת הזרימה כדי להתחיל לרוקן את תא הזרימה ולמנוע הצפה של תאהזרימה (איור 9):שסתום = שסתום אמבטיה (2); מצב מיקרו-צעד = מיקרו; יעד בוכנה = 48,000; מהירות בוכנה = 38-40 (שרירותי).
        הערה: ודא כי רמת הנוזלים יציבה בכל עת. המיו-פיבריל לא צריך להתייבש וגם לא ה-cantilever. עדיף שיהיה קצת יותר מדי הצפה מאשר זרימה קטנה מדי.
  6. כדי להגדיר את הטמפרטורה לערך הרצוי עם בקר טמפרטורה תרמואלקטרי(איור 8, ראה טבלת חומרים), הזן את הטמפרטורה הרצויה ולחץ 'התחל'. המתן עד שהטמפרטורה הרצויה תותוזמן על-ידי בדיקת הגרף בתוכנה של בקר טמפרטורה תרמואלקטרית והמשך.
    הערה: בעת ביצוע ניסויים בטמפרטורת החדר, אין להשתמש בבקר הטמפרטורה התרמואלקטרית.

4. פרוטוקולים ניסיוניים

  1. החלט אילו פרוטוקולי כוח פעילים יש לבצע.
    הערה: בהתאם לנתונים הדרושים למחקר, ניתן לבצע סוגים מרובים של ניסויי כוח פעיל: שלב 4.1.1, מדידה של הכוח המרבי ברוויה [Ca2+ +2]; שלב 4.1.2, קבלת עקומת Force-pCa כדי לקבוע את רגישות הסידן בנוסף לשלב 4.1.1; שלב 4.1.3, קביעת קצב ההתפתחות מחדש של המתח על-ידי ביצוע פרוטוקול קיצור-restretch בנוסף לשלב 4.1.1 או 4.1.2.
    1. למדוד כוח פעיל מקסימלי.
      1. התחל להקליט את הנתונים בתוכנה של בקר המערכת (ראה טבלת חומרים) על-ידיהקשה על 'התחל'.
      2. שסתומים פתוחים 1 ו- 6 עם לוח רכישת נתונים (ראה טבלת חומרים)תוכנה על ידי בדיקת הכפתור '1+6' כדי להתחיל זרימת Ɵ זכוכית של הפתרון מרגיע והפעלת פתרון באמצעות Ɵ -glass (איור 6A).
      3. אפס את טווח האינטרפרומטר כך שכוח הבסיס יהיה 0 V על-ידי בחירה והקשה על 'טווחאיפוס ' באינטרפרומטר (ראה טבלת חומרים).
      4. כאשר מעקב הכוח יציב, בצע את השלב המהיר Ɵ זכוכית (גודל שלב = 100 μm).
        ניתן למצוא הגדרות מחולל אותות בטבלה 1 (איור 5C). מעקב הרפיה-הפעלה הדומה איור 4D יירשם וגלוי בתוכנה בקר המערכת.
      5. השהה את הקלטת נתוני התוכנה של בקר המערכת על-ידי לחיצה עללחצן' השהה'.
      6. אם לא יבוצעו הפעלות נוספות, סגור את השסתומים 1 ו- 6 כדי לעצור את זרימת הזכוכית Ɵ על-ידי ביטול הסימון של הלחצן '1+6' (איור 6B), הפסקאת משאבת המזרק ( איור 9 , ראהטבלת חומרים )על-ידי לחיצה על 'סיום', ולעצור את זרימת הרקע על-ידי סגירת שסתום Luer.
    2. עקומת כוח-pCa
      הערה: הדבר דומה לשלב 4.1.1 כדי להשיג את הכוח הפעיל המקסימלי, אך עם הפעלות מרובות באמצעות פתרונות pCa שונים.
      1. התחל להקליט את הנתונים בתוכנה של בקר המערכת על-ידי הקשה על'התחל'.
      2. שסתומים פתוחים 1 ו-2 עם תוכנת לוח רכישת הנתונים כדי להתחיל את הזרימה של פתרון מרגיע וpCa 6.2 דרך Ɵ זכוכית.
      3. אפס את טווח האינטרפרומטר כך שהכוח הבסיסי יהיה 0 V על-ידי בחירה והקשה על 'טווח איפוס' באינטרפרומטר.
      4. כאשר מעקב הכוח יציב, בצע את השלב המהיר Ɵ זכוכית (גודל שלב = 100 μm).
        ניתן למצוא הגדרות מחולל אותות בטבלה 1.
      5. השהה את תוכנת בקר המערכת על-ידי לחיצה עללחצן' השהה'.
      6. חזור על שלבים 4.1.2.1-4.1.2.4 עבור שסתומים 1 ו- 3 (pCa 5.8), שסתומים 1 ו- 4 (pCa 5.6), שסתומים 1 ו- 5 (pCa 5.4) ושסתומים 1 ו- 6 (pCa 4.5).
      7. אם לא יבוצעו הפעלות נוספות, סגור את השסתומים 1 ו- 6 כדי לעצור את זרימת Ɵ-glass על-ידי ביטול הסימון של הלחצן '1+6'(איור 6A), עצוראת משאבת המזרק (איור 9) על-ידי לחיצה על 'סיום', ועצור את זרימת הרקע על-ידי סגירת שסתום Luer.
    3. למדוד את קצב הפיתוח מחדש של מתח (kTR).
      הערה: הדבר דומה לשלב 4.1.1 עבור כוח פעיל ממקסם אך עם כמה שינויים וצעדים נוספים.
      1. לחשב את תנועת piezo הדרוש כדי רפוי myofibril 15% ולהזין ערך זה במחולל אותות(איור 5D, טבלה 1).
      2. התחל להקליט את הנתונים בתוכנה של בקר המערכת על-ידי הקשה על 'התחל'.
      3. שסתומים פתוחים 1 ו-6 עם לוח רכישת נתונים (איור 6A) תוכנה כדי להתחיל זרימה של הפתרון המרגיע pCa 4.5 דרך Ɵ זכוכית.
      4. אפס את טווח האינטרפרומטר כך שהכוח הבסיסי יהיה 0 V על-ידי בחירה והקשה על 'טווח איפוס' באינטרפרומטר.
      5. כאשר מעקב הכוח יציב, בצע את השלב המהיר Ɵ זכוכית (גודל שלב = 100 μm).
        ניתן למצוא הגדרות מחולל אותות בטבלה 1.
      6. כאשר רמת הכוח מגיעה, בצע את הקיצור-restretch עם piezo.
        ניתן למצוא הגדרות מחולל אותות ב (איור 5D, טבלה 1). מעקב הרפיה של הפעלה הדומה לא איור 4E יירשם ויהיה גלוי בתוכנה של בקר המערכת.
        הערה: ניתן להשתמש בפרוטוקול מותאם אישית כדי להפוך את השלבים לעיל לאוטומטיים.
      7. השהה את תוכנת בקר המערכת על-ידי לחיצה עללחצן' השהה'.
      8. אם לא יבוצעו הפעלות נוספות, סגור את השסתומים 1 ו- 6 כדי לעצור את זרימת Ɵ-glass על-ידי ביטול הסימון של הלחצן '1+6' (איור 6B), להפסיק את משאבת המזרק (איור 9) על-ידי לחיצה על 'סיום', ולעצור את זרימת הרקע על-ידי סגירת שסתום Luer.
  2. בצע מדידות כוח פסיביות.
    1. לבצע מתיחה רציפה.
      1. לחשב את תנועת piezo הדרוש כדי למתוח את myofibril ולהזין ערך זה במחולל האות(טבלה 1).
        הערה: אלה הגדרות לדוגמה. חשב את כמות המתיחה והזמן של מתיחה ביחס לאורך sarcomere. הגדרות אלה נחוצות כדי להבטיח כי מהירות המתיחה לכל sarcomere נשאר שווה על פני myofibrils.
      2. התחל להקליט את הנתונים בתוכנה של בקר המערכת על-ידי הקשה על 'התחל'.
      3. אפס את טווח האינטרפרומטר כך שהכוח הבסיסי יהיה 0 V על-ידי בחירה והקשה על 'טווח איפוס' באינטרפרומטר.
      4. לבצע מתיחה רציפה עם מחולל האות בתוכנה בקר המערכת כדי להפעיל את piezo. ניתן למצוא הגדרות מחולל אותות לדוגמה בטבלה 1.
      5. לקצר את myofibril כדי רפוי אורך עם piezo לאחר המתיחה הסתיימה(טבלה 1).
    2. לבצע מתיחה צעד צעד.
      1. התחל להקליט את הנתונים בתוכנה של בקר המערכת על-ידי הקשה על 'התחל'.
      2. אפס את טווח האינטרפרומטר כך שהכוח הבסיסי יהיה 0 V על-ידי בחירה והקשה על 'טווח איפוס' באינטרפרומטר.
      3. לבצע מתיחה צעד צעד עם מחולל האותות בתוכנה בקר המערכת כדי להפעיל את piezo. ניתן למצוא הגדרות מחולל אותות לדוגמה בטבלה 1 (איור 5E).
    3. לקצר את myofibril כדי רפוי אורך עם piezo לאחר המתיחה הסתיימה. ניתן למצוא הגדרות מחולל אותות לדוגמה בטבלה 1.
  3. השהה את תוכנת בקר המערכת על-ידי לחיצה עללחצן' השהה'.
  4. הפסק את הקלטת הנתונים על-ידי לחיצהעללחצן ' עצור' בתוכנה של בקר המערכת.
  5. שמור את הנתונים על-ידיהקשה על' קובץ ' ו -שמורנתונים ' בתוכנה של בקר המערכת.

5. ניקוי

  1. הסר את המיו-פיבריל המדוד והתכונן ל myofibril הבא.
    1. כדי לעשות זאת, בזהירות לקרוע את myofibril תוך הסתכלות דרך ה עינית עם המטרה 40x.
    2. תקדם את הגשוש והפאיזו. הזיזו Ɵ ה-10 00:00:00,000-&10:00,000-&10:00,000-&0 ואז לזוז למעלה ולהחליק משם את תא הזרימה. הסר את אמבטיית הרקמות.
    3. כדי לנקות את מחט ההרכבה, להביא אותו לפוקוס באמצעות 10x ואת ה עינית. טובלים את המברשת באתנול ומברישים בזהירות ומסירים את הדבק מהמחט.
      הערה: זכור כי ייתכן שאקח זמן עד שהדבק יורד.
    4. יש לשטוף את תא הזרימה ואת אמבט הרקמות במים אולטרה-תכליתיים.
    5. מניחים את הגשוש בצלחת פטרי קטנה מלאה במים אולטרה-תוחמים. ודא שהגשוש שקוע לחלוטין.
  2. לאחר סיום הניסויים, נקה את ההתקנה כאמור לעיל ובצע את השלבים הנוספים הבאים.
    1. רוקן את הצינורות מאמבטיית הזרימה. שלח את הפרמטרים למשאבת מזרק הזרימה (ראה טבלת חומרים , איור 9). שסתום = שסתום אמבטיה (2); מצב מיקרו-צעד = רגיל; יעד בוכנה = 0; מהירות בוכנה = 30.
      הערה: סיים את הפקודה כאשר הצינורות ריקים.
    2. לאתחל את המשאבה מספר פעמים (איור 9B).
    3. תרוקן את המזרקים. כדי לעשות זאת, לסגור את כל שסתומי Luer, לפתוח את כל השסתומים, להסיר את הצינורות מהמחט של המזרק, להחזיק את הצינור של pCa ספציפי מתחת למחט, ולפתוח את שסתום Luer. השתמש בתקעי הלחץ כדי להאיץ את התהליך.
    4. לחבר מחדש את הצינורות למחט של המזרק. מלא מזרקים עם ~ 5 מ"ל של מים אולטרה-תכליתיים. מניחים מתחת Ɵ הזאת. פתח את כל השסתומים ופתח את שסתום הלחץ כדי לשטוף את המערכת.
    5. כבה את המערכת. כבה את המחשב, האינטרפרומטר ובקר Piezo בלוק חשמל.

6. ניתוח נתונים

  1. יצא עקבות נתונים מהתוכנה של בקר המערכת (ראה טבלת חומרים)לתוכנית או ללוח של גיליון אלקטרוני על-ידי פתיחת קובץ הנתונים ובחירה במקטע הרצוי. העקבות המוצגות ייוצאים (לדוגמה, כוח גולמי, אורך סרקומר ומיקום פיזו).
  2. בצע ניתוח עם התוכנה של בחירה (למשל, MATLAB).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מעקבי נתונים נרשמו ונפתחו באמצעות תוכנת בקר המערכת (ראה טבלת חומרים). מעקבים מלאים או מקטעים נבחרים יוצאו ללוח או לקובץ הטקסט לצורך ניתוח נוסף עם תוכנה רצויה. שסתומים לשליטה בזרימה של הפתרונות השונים הוחלפו עם תוכנה מותאמת אישית או באופן ידני. סקריפט MATLAB מותאם אישית שימש לניתוח ש?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מתואר הוא פרוטוקול כדי להעריך את הפונקציה ההתכווצות של myofibrils מבודד מרקמות שריר השלד אדם או בעלי חיים. פתרון הכוח של התקנה זו תואר בעבר על ידי Chavan ואח '12. בקיצור, הוא נקבע על ידי תנודות אקראיות של אורך חלל Fabry-Pérot שנוצר בין סיבי הזיהוי cantilever, אשר מייצרים את החלק הדומיננטי של הרעש ב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

מיכאל הלמס הוא בעל מניות ובעלים משותף של IONOptix Inc.

Acknowledgements

פרויקט זה מומן על ידי AFM-Telethon וקרן בניין כוח עבור מיופתיה Nemaline. המחברים רוצים להכיר את היוצר של המוצרים המוזכרים במאמר זה, IONOptix Inc.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bio Spec Products, Inc.985370-XLTo isolate myofibrils
Custom codedMatlab
Custom fabricatedIncludes Labview program to control over serial connection; To control valves
Custom fabricatedTo cool the Peltier module
Custom fabricated
Custom fabricatedAluminum tissue chamber
Custom fabricatedTo control the valves; Includes PC software to control over USB
IonOptixSystem controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step
IonOptixMCS100To record sarcomere length
IonOptixIncludes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher
IonOptixForce probe
KoolanceADT-EX004S
KoolanceEX2-755To cool the Peltier module
MicrosoftData registration
OlympusIX71
OlympusTH4-200
Sigma-Aldrich529265Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue
Sigma-Aldrich78471Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue
TE Technology, Inc.TE-63-1.0-1.3To cool the tissue flow chamber
TE Technology, Inc.TC-720Includes PC software to control over USB
Tecan Trading AG20736652
Tecan Trading AG20739263Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber
Thermo scientific2441081
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)DiscontinuedAlternative: SF-77CST/VCS-77CSP
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)TG150-4To perfuse the tissue
1 PC for IonWizard and 1 PC for other software

References

  1. Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
  2. Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, Pt 2 535-548 (1997).
  3. Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
  4. Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, Suppl 1 127-135 (2002).
  5. Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
  6. Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
  7. Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
  8. de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
  9. Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
  10. Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
  11. Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701(2011).
  12. Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110(2012).
  13. Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
  14. van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
  15. Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
  16. Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
  17. Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
  18. Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
  19. Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
  20. Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
  21. Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159cantilever

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved