Isoler les myofibrils des biopsies des muscles squelettiques et déterminer la fonction contractile avec un transducteur de force de résolution nano-newton

Résumé

Présenté ici est un protocole pour évaluer les propriétés contractiles des myofibrils musculaires striés avec la résolution nano-Newton. Le protocole utilise une configuration avec une sonde de force optique basée sur l’interférométrie. Cette configuration génère des données avec un rapport signal/bruit élevé et permet d’évaluer la cinétique contractile des myofibrils.

Résumé

Les cellules musculaires striées sont indispensables à l’activité des humains et des animaux. Les fibres musculaires simples sont composées de myofibrils, qui se composent de sarcomeres liés en série, les plus petites unités contractiles dans le muscle. Le dysfonctionnement sarcomérique contribue à la faiblesse musculaire chez les patients présentant des mutations dans les gènes encodage pour les protéines sarcomériques. L’étude de la mécanique du myofibril permet l’évaluation des interactions actin-myosine sans effets confusionnels potentiels des myofibrils endommagés et adjacents lors de la mesure de la contractilité des fibres musculaires simples. Les dommages ultrastructuraux et le désalignement des myofibrils pourraient contribuer à une contractilité altérée. Si des dommages structurels sont présents dans les myofibrils, ils se brisent probablement pendant la procédure d’isolement ou pendant l’expérience. En outre, les études sur les myofibrils fournissent l’évaluation des interactions actin-myosine en présence des contraintes géométriques des sarcomeres. Par exemple, les mesures dans les myofibrils peuvent élucider si le dysfonctionnement myofibrillaire est l’effet primaire d’une mutation dans une protéine sarcomérique. En outre, la perfusion avec des solutions de calcium ou des composés est presque instantanée en raison du petit diamètre du myofibril. Cela rend les myofibrils éminemment appropriés pour mesurer les taux d’activation et de relaxation pendant la production de force. Le protocole décrit dans cet article utilise une sonde de force optique basée sur le principe d’un interféromètre Fabry-Pérot capable de mesurer les forces de la gamme nano-Newton, couplée à un moteur de longueur piézo et à un système de perfusion à pas rapide. Cette configuration permet l’étude de la mécanique myofibril avec des mesures de force à haute résolution.

Introduction

Les cellules musculaires striées sont indispensables pour les activités de la vie quotidienne. Le mouvement des membres, la fonction respiratoire et le mouvement de pompage du cœur reposent sur la force générée par les cellules musculaires. Le muscle squelettique se compose de fascicles musculaires contenant des faisceaux de fibres musculaires simples (Figure 1A). Ces fibres musculaires sont composées de myofibrils, qui sont formés par des sarcomeres liés en série (Figure 1B,D). Les sarcomeres contiennent des filaments minces et épais. Celles-ci se composent principalement de chaînes de molécules d’actine et de myosine, respectivement (figure 1B). Les interactions Actin-myosine sont responsables de la capacité de génération de force du muscle. Les patients présentant des mutations dans les gènes encodage pour les protéines sarcomériques, telles que la nébuline, l’actine, et la troponine T, souffrent d’une faiblesse musculaire due au dysfonctionnement contractile¹.

La qualité de la contractilité musculaire peut être étudiée à différents niveaux d’organisation, allant des muscles entiers in vivo aux interactions actin-myosine dans les tests de motilité in vitro. Au cours des dernières décennies, plusieurs groupes de recherche ont développé des configurations pour déterminer la contractilité des myofibrils individuels^{2,3,4,5,6,7,8,9,10}. Ces configurations sont basées sur la détection des changements dans la déviation laser d’un porte-à-faux (c.-à-d. la déviation optique du faisceau) causés par la contraction du myofibril (pour plus de détails, voir Labuda et al.¹¹). Bien que la détermination de la fonction contractile des myofibrils ait certaines limites (p. ex., la dynamique des processus de couplage excitation-contraction qui sont en amont des myofibrils font défaut), cette approche présente de multiples avantages. Il s’agit notamment de : 1) la capacité d’évaluer les interactions actin-myosine en présence des contraintes géométriques des sarcomeres; 2) la capacité d’évaluer les interactions actin-myosine sans effets confusionnels potentiels des myofibrils endommagés et adjacents (lors de la mesure de la contractilité des fibres musculaires simples dommages ultrastructuraux et le désalignement des myofibrils pourrait contribuer à une contractilité altérée) (Figure 1D); 3) le petit diamètre des myofibrils (~1 μm, figure 2A)et l’absence de membranes permettent une diffusion presque instantanée du calcium dans les sarcomeres. En outre, si des dommages structurels sont présents dans les myofibrils, ils se brisent probablement pendant leur isolement ou pendant l’expérience. Par conséquent, l’évaluation de la contractilité myofibril est une méthode élégante pour étudier les mécanismes de base de la contraction musculaire et de comprendre si les interactions perturbées actin-myosine sont la principale cause de la maladie musculaire causée par des mutations dans les protéines sarcomériques.

Ce protocole présente une configuration nouvellement développée pour déterminer la contractilité des myofibrils incorporant une sonde de force en porte-à-faux avec la résolution nano-Newton (c.-à-d. Optiforce). Cette sonde de force est basée sur le principe de l’interférométrie. L’interférométrie permet l’utilisation de cantilevers relativement rigides. Cela permet de mesurer la force avec peu de déviation du porte-à-faux, en approchant les contractions isométriques du myofibril. La sonde permet l’évaluation des forces passives et actives faibles qui sont produites par un seul myofibril isolé de différentes biopsies musculaires, y compris celles des sujets humains, avec un rapport signal/bruit élevé. La sonde de force de cantilever optique incorporée dans cette configuration est basée sur un interféromètre Fabry-Pérot¹². L’interféromètre détecte de petits déplacements entre une fibre optique et un porte-à-faux recouvert d’or monté sur une ferrule (figure 3). L’écart entre la fibre optique et le porte-à-faux est appelé la cavité Fabry-Pérot. Myofibrils sont montés entre la sonde et le moteur piezo à l’aide de deux fibres de montage en verre enduit de colle. La force produite par le myofibril peut être mathématiquement dérivée des données de l’interféromètre. L’interférométrie est basée sur la superposition ou l’interférence de deux ondes ou plus (dans cette configuration trois ondes lumineuses). La lumière laser d’une longueur d’onde comprise entre 1 528,77–1 563,85 nm est émise par l’interféromètre et est envoyée par la fibre optique. Dans la sonde, la lumière est réfléchie 1) à l’interface entre la fibre optique et le milieu (Figure 3A); 2) à l’interface du milieu et du porte-à-faux (figure 3B); et 3) à l’interface entre le revêtement métallique et or du porte-à-faux (figure 3C). La réflexion à l’interface A et B dépend del’indicede réfraction ( n ) du milieu dans lequel la sonde est submergée. La lumière, composée des trois reflets superposés, revient à une photodiode dans l’interféromètre. La photodiode mesure l’intensité de la lumière, qui est le résultat du modèle d’interférence des trois réflexions superposées. Lorsque la force contractile est générée par l’activation ou l’étirement d’un myofibril, le myofibril tire sur le porte-à-faux. Ce mouvement modifie la taille de la cavité (d) et, par conséquent, le nombre de longueurs d’onde qui s’adaptent dans la cavité. La lumière réfléchie au porte-à-faux aura une phase différente, ce qui se traduira par un modèle d’interférence différent. La photodiode enregistre ce changement d’intensité du modèle d’interférence comme un changement dans volts. Par la suite, la génération de force de myofibril est calculée à partir de ce changement, en tenant compte de la rigidité du porte-à-faux. La sonde de force est calibrée par le fabricant en poussant la pointe de l’aiguille de montage, attachée à l’extrémité libre du porte-à-faux, contre une balance tout en gardant la flexion du porte-à-faux égale à un multiple de la longueur d’onde du laser de lecture¹³. Ainsi, l’interférométrie est une méthode très sensible pour détecter de petits changements de distance, permettant la mesure des forces avec la résolution nano-Newton. Cette résolution permet l’évaluation de la production de force myofibrillaire avec un rapport signal/bruit élevé. Alors que l’interférométrie traditionnelle limite la gamme de mesures à la partie linéaire de la courbe d’interférence, l’utilisation d’un amplificateur de verrouillage et la modulation de la longueur d’onde laser surmonte cette limitation¹⁴. Ceci est expliqué plus en détail dans la section de discussion.

Pour mesurer la tension active de myofibril, un système de perfusion à étapes rapides a été incorporé pour exposer le myofibril aux solutions de calcium (Figure 4A). Le système de perfusion à étapes rapides permet aux modifications de solution de se produire dans les 10 ms. En raison de leur petit diamètre, la diffusion du calcium dans les myofibrils est presque instantanée. Par conséquent, ce système est particulièrement approprié pour mesurer les taux de liaison actin-myosine pendant l’activation et la libération pendant la relaxation. Le taux d’activation (k_ACT)et de relaxation (k_REL)peut être déterminé à partir des courbes d’activation-relaxation. En outre, en exposant les myofibrils aux solutions de calcium de concentration croissante, la relation force-calcium et la sensibilité de calcium peuvent être déterminées.

En outre, un moteur de longueur piezo permet l’étirement rapide et le raccourcissement du myofibril. Cela offre la possibilité d’étudier les propriétés viscoélastiques (c’est-à-dire la tension passive) du myofibril, ainsi que d’effectuer un raccourcissement rapide et le restretch du myofibril pour déterminer le taux de réaménagement de la tension (k_TR). Les paramètres récupérés à la fois des expériences de tension active et passive peuvent être modifiés par des mutations génétiques dans une protéine sarcomérique.

Cette configuration sur mesure a été utilisée pour mesurer les caractéristiques contractiles actives et passives des myofibrils isolés du muscle squelettique humain, patient et de souris en bonne santé.

Protocole

Le protocole pour l’obtention de biopsies humaines a été approuvé par la commission d’examen institutionnel du Vu University Medical Center (#2014/396) et le consentement écrit en connaissance de cause a été obtenu à partir des sujets. Le protocole d’obtention de biopsies musculaires animales a été approuvé par le comité local d’éthique animale de l’Université VU (AVD114002016501)

1. Préparation et isolement myofibril

REMARQUE : Utilisez des méthodes précédemment décrites pour les biopsies de glycérinate, préparez les différentes solutions de concentration de calcium (pCa)^7,16,17, et isolez les myofibrils^2,18.

1. Décongeler les solutions de détente (pCa 9.0, Rx) et d’activation (pCa 4.5, Act) ainsi que les inhibiteurs (1 M E64, 1 M DTT, 1 M de leupeptin, 1 M PMSF), qui sont stockés à -80 °C.
2. Prenez un morceau glycériné de biopsie musculaire striée d’environ 1 mm³ et placez-le dans une petite boîte de Pétri avec 1:1 Rx/glycérol (v/v) solution et placez la boîte de Petri sur une plaque froide à 4 °C.
3. Disséquer le morceau de muscle à l’aide du microscope de dissection et des forceps, séparant les fibres musculaires simples sans les isoler du morceau de muscle.
   REMARQUE : Retirez autant de tissu gras et conjonctif que possible pour prévenir la contamination de la suspension myofibril.
4. Transférer le morceau de tissu disséqué dans un tube de 5 ml avec 1,5 ml de solution relaxante avec des inhibiteurs (1 μL/mL E-64, 1 μL/mL leupeptin, 1 μL/mL DTT et 125 μL/mL PMSF). Laisser le tissu se tempérer à environ 4 °C pendant 1 h.
5. Pendant l’incubation, démarrez les deux PC, allumez les appareils et ouvrez le logiciel associé (voir Tableau des matériaux).
6. Submerger la sonde de force dans de l’eau ultrapure dans une boîte de Pétri et calibrer la sonde.
   1. Appuyez surl’Assistant Démarrersur l’interféromètre et suivez les instructions à l’écran. Après avoir appuyé sur Calibrer,appuyez sur l’étape du microscope.
      REMARQUE : Taper sur le microscope provoquera le porte-à-faux à dévier et à passer à travers les franges. Cela permet l’étalonnage de la sonde.
   2. Laissez la sonde immergée dans l’eau ultrapure dans la boîte de Pétri après étalonnage.
7. Initialiser la position du moteur piezo. Pour ce faire, suivez l’une des étapes détaillées ci-dessous.
   1. Lorsque le moteur piézo sera utilisé pour la tension k_TR, réglez la longueur à 0 μm.
      Les paramètres du générateur de signaux se trouvent dans le tableau 1, figure 5A.
   2. Lorsque le moteur piézo est utilisé pour la tension passive, réglez la longueur à 50 μm.
      Les paramètres du générateur de signaux se trouvent dans le tableau 1.
      REMARQUE : La différence entre les étapes est la position initiale du moteur de longueur de piezo. Pour étirer le myofibril, le moteur piezo doit tirer pour augmenter la distance entre les deux aiguilles de montage et d’allonger le myofibril. Pour relâcher le myofibril, le moteur piezo doit pousser pour diminuer la distance entre les deux aiguilles de montage et pour raccourcir le myofibril.
8. Préparer une diapositive au microscope. Pipette 150 μL de solution polyhydroxyéthylméthacrylate (poly-HEMA) (5% poly-HEMA dans 95% d’éthanol, w/v) sur une lame de microscope et l’étaler sur la lame afin qu’elle soit recouverte.
   REMARQUE : Si une suspension de myofibril est pipette sur une lame de microscope non enduite, les myofibrils qui coulent au fond colleront à la lame de microscope et il ne sera pas possible de les coller.
9. Remplissez les seringues de solutions pCa (voir la figure 4A)et primez le système de perfusion.
   REMARQUE : Dans ces étapes, tous les tubes sont préremplies avec la solution appropriée pour s’assurer que toutes les bulles d’air sont retirées du tube.
   1. Remplissez le tube d’entrée du débit de fond de chambre d’écoulement (Figure 3, 4A) entrée avec Rx.
   2. Lorsqu’il est utilisé, rincer le collecteur avec de l’eau ultrapure pour enlever l’air. Pour ce faire, connecter la seringue avec de l’eau ultrapure à la sortie et rincer dans la direction inverse. Bloquez les ports inutilisés du collecteur.
   3. Activez chaque seringue pCa pour remplir leurs tubes respectifs avec une solution pca. Ensuite, connectez-les au collecteur et au verre.
   4. Ouvrez les vannes 1 et 6 avec le logiciel de panneau d’acquisition dedonnées (voir tableau des matériaux) en vérifiant le bouton '1+6' (Figure 6A) pour remplir le verre avec les solutions relaxantes (pCa 9.0) et activantes (4.5) et fermer les vannes lorsque le verre est rempli (Figure 6B).

2. Montage d’un myofibril

1. Enrober une lame de microscope de poly-HEMA pour empêcher les myofibrils de coller au verre.
2. Préparer l’homogénéiseur (voir tableau des matériaux)pour l’homogénéisation des tissus. Nettoyez la tige de rotor interne avec du papier de soie propre, assemblez l’homogénéisant, et tournez 1x pour 15 s dans l’alcool et trois fois pour 15 s chacun dans l’eau ultrapure. Prériser l’homogénéisant dans une solution relaxante 1 x pour 15 s sur glace.
3. Placez la tige d’homogénéisation dans le tube contenant le tissu musculaire tel que décrit à l’étape 1.4 et, tout en gardant le tube sur la glace, faire tourner le rotor pendant 15 s à la vitesse 5 pour déchirer le tissu musculaire et obtenir une suspension myofibril.
4. Pipette ~50 μL de la suspension myofibril et ~250 μL de la solution de détente sur la lame de microscope recouverte de poly-HEMA dans le bain de tissu. Cela formera une goutte liquide. Couvrir le bain d’un couvercle pour se protéger de la poussière et attendre 5 à 10 min pour permettre aux myofibrils de couler au fond.
   NOTE: Le rapport entre la suspension et la solution de détente dépend de la qualité de l’isolement, par conséquent, ajuster en conséquence. Par exemple, si le rendement du myofibril est faible et que peu de myofibrils appropriés sont présents dans la suspension, ajoutez plus de suspension myofibril et diluez avec une solution moins relaxante (p. ex., 75 μL de suspension myofibril et 225 μL de solution relaxante). Le tissu musculaire cardiaque et squelettique est facile à reconnaître en raison de son modèle de striation. En utilisant un objectif 10x ou 40x, ce modèle est également visible dans un seul myofibril. Dans le cas où d’autres tissus sont présents dans la suspension, les myofibrils peuvent être sélectionnés visuellement. On peut sauter l’attente de 5 à 10 minutes. Cependant, cela augmente la difficulté de coller un myofibril.
5. Enrober les aiguilles de montage de colle (shellac + éthanol; 120 mg shellac dans 2 mL d’éthanol à 70 %). Pour ce faire, chauffer la colle à 65 °C pour 30–60 s et la pipette ~6 μL sur une nouvelle lame de verre non enduite. Tremper la pointe de chaque aiguille de montage dans la colle et répéter jusqu’à ce qu’une couche de colle soit visible. Déplacez la sonde et le piezo verticalement avec les micromanipulateurs pour faire de la place pour placer le bain de tissu sur le stade du microscope. Retirez la lame en verre contenant la colle.
6. Montage des myofibrils
   1. Placez le bain de tissu avec la lame de microscope enduite de poly-HEMA contenant la suspension de myofibril sur le stade de microscope. Utilisez la scène pour trouver un myofibril approprié avec l’objectif 40x. Si nécessaire, déplacez et faites pivoter le bain de tissu pour déplacer le myofibril à une position supportable.
      REMARQUE : Recherchez les myofibrils avec un motif de strilation visible d’environ 30 μm de long. Comme décrit en détail dans les étapes 3.1 et 3.2.1, il est possible de vérifier la longueur et la longueur du sarcomère avant de coller le myofibril. Ne collez pas les myofibrils déchirés, car ceux-ci sont susceptibles de se briser pendant la contraction.
   2. Faites glisser la chambre d’écoulement en place directement au-dessus de la goutte liquide contenant les myofibrils dans le bain de tissu (pipetted sur la diapositive à l’étape 2.4) et l’abaisser. Arrêtez-vous avant qu’il n’atteigne la goutte de liquide.
   3. Baisser l’aiguille de montage piezo et appuyez-le sur l’extrémité inférieure du myofibril. Soulevez-le légèrement pour vérifier si le myofibril est fixé à l’aiguille.
   4. Abaissez la chambre d’écoulement assez loin pour que l’aiguille de montage de la sonde atteigne le fond sans que la sonde ne touche la chambre d’écoulement.
   5. Appuyez sur l’aiguille de montage de la sonde sur l’extrémité supérieure du myofibril. Soulevez-le légèrement pour vérifier si le myofibril est fixé à l’aiguille.
   6. Soulevez le myofibril du fond du bain autant que possible sans perdre la capacité de se concentrer sans que l’objectif touche le fond du verre.

3. Initialisation de l’expérience

1. Utilisez les micromanipulateurs, la caméra et le logiciel de contrôleur système (Figure 7A, voir Tableau des matériaux) pour mesurer la longueur du sarcomere. Déplacez la sonde piézo et/ou la sonde de force pour définir la longueur initiale du sarcomère du myofibril à 2,5 μm.
   REMARQUE : Une longueur de sarcomère de 2,5 μm assure un chevauchement optimal entre les têtes de myosine et l’actine.
2. À l’aide de la fonction de navire du logiciel de contrôleur système, mesurer la longueur et la largeur du myofibril (figure 7B,C).
   REMARQUE : Lors de la rotation de la caméra, elle peut s’incliner horizontalement et/ou verticalement. Pour vérifier l’alignement de la caméra, un niveau d’esprit peut être utilisé pour vérifier que la caméra est tournée et non inclinée.
   1. Placez le myofibril au centre de l’image vidéo à l’aide de l’étape du microscope.
   2. Dessinez un carré d’un côté du myofibril à l’autre. Pour la longueur, assurez-vous d’inclure le bord sombre des gouttelettes de colle (Figure 2A) dans le carré parce que le traitement de l’image est basé sur le contraste.
   3. Commencez à enregistrer les données dans le logiciel du contrôleur système (voir Tableau des matériaux)en appuyant sur 'Démarrer' et après 5 s pause de l’enregistrement des données logicielles du contrôleur système en appuyant sur le bouton 'Pause'. La longueur est maintenant enregistrée dans les données.
   4. Pour la largeur d’abord tourner la caméra 90° (voir Tableau des matériaux) et ensuite utiliser le contraste du bord du myofibril lui-même.
   5. Commencez à enregistrer les données dans le logiciel du contrôleur système (voir Tableau des matériaux)en appuyant sur 'Démarrer' et après 5 s pause de l’enregistrement des données logicielles du contrôleur système en appuyant sur le bouton «Pause ». La largeur est maintenant enregistrée dans les données.
3. Si la tension active du myofibril doit être déterminée, la configuration de perfusion doit être utilisée. Si c’est le cas, continuez à l’étape 3.4. Si seule la tension passive est déterminée, sautez les étapes 3.4–4.1.3.7 et continuez à l’étape 4.2.
4. Positionnez et initialisez la configuration de la perfusion.
   REMARQUE : Ceci n’est nécessaire que pour la génération de la force active. Continuez à l’étape 4.2 lorsque vous effectuez des expériences de tension passive.
   1. Réglez la position du moteur à pas rapide à 4 V (figure 5B).
   2. Faites glisser le support de perfusion sur la table pour aligner le coin inférieur gauche du support avec la bande sur la table.
      REMARQUE : Veillez à ne pas heurter la sonde de force ou le moteur piezo.
   3. Utilisez le manipulateur pour positionner grossièrement le verre à l’œil.
   4. Regardez à travers l’oculaire et déplacez soigneusement le verre vers le myofibril à l’aide du manipulateur.
   5. Alignez le canal supérieur du verre avec le myofibril à l’aide du manipulateur et vérifiez la position en effectuant une étape rapide (les paramètres du générateur de signal peuvent être trouvésdans le tableau 1) avec le logiciel de contrôleur système (Figure 2B–C, voir Tableau des matériaux ).
      REMARQUE : Assurez-vous que le canal inférieur sera aligné avec le myofibril pendant la phase d’activation de l’étape rapide (Figure 2B–C).
5. Activez le flux d’arrière-plan de Rx (Figure 4A) pour créer un flux d’arrière-plan laminaire dans la chambre d’écoulement.
   REMARQUE : Le flux d’arrière-plan est nécessaire pour empêcher le flux turbulent en raison du flux de solution de pCa du verre de 10.
   1. Allumez l’entrée de la chambre d’écoulement avec un levier de valve Luer.
      1. Envoyer les paramètres suivants à la pompe de sortie pour commencer à vider la chambre d’écoulement et éviter le débordement de la chambred’écoulement( Figure 9 ) : Valve = Vanne de bain (2); Microstep mode = Micro; Cible piston = 48 000; Vitesse du piston = 38–40 (arbitraire).
         REMARQUE : Assurez-vous que le niveau de liquide est stable en tout temps. Le myofibril ne doit pas s’épuiser et le porte-à-faux non plus. Il est préférable d’avoir un peu de débordement que trop peu de débit.
6. Pour régler la température à une valeur souhaitée avec le contrôleur de température thermoélectrique (Figure 8, voir Tableau des matériaux),entrez la température souhaitée et appuyez sur 'Démarrer'. Attendez que la température désirée soit atteinte en vérifiant le graphique dans le logiciel de contrôleur de température thermoélectrique et continuez.
   REMARQUE : Lors de l’exécution d’expériences à température ambiante, le contrôleur de température thermoélectrique n’a pas besoin d’être utilisé.

4. Protocole(s) expérimental(s)

1. Décidez quels protocoles de force active doivent être exécutés.
   REMARQUE : Selon les données nécessaires à l’étude, plusieurs types d’expériences de force active peuvent être effectués : étape 4.1.1, mesure de la force maximale à la saturation [Ca²⁺]; étape 4.1.2, obtenir une courbe Force-pCa pour déterminer la sensibilité au calcium en plus de l’étape 4.1.1; étape 4.1.3, déterminer le taux de réaménagement de la tension en effectuant un protocole de raccourcissement-restretch en plus de l’étape 4.1.1 ou 4.1.2.
   1. Mesurer la force active maximale.
      1. Commencez à enregistrer les données dans le logiciel du contrôleur système (voir Tableau des matériaux)en appuyant sur 'Démarrer'.
      2. Ouvrez les vannes 1 et 6 avec le panneau d’acquisition dedonnées (voir Tableau des matériaux) en vérifiant le bouton '1+6' pour démarrer le flux de verre de la solution de détente et la solution d’activation à travers le verre de l'1/6A .Figure 6A
      3. Réinitialisez la portée de l’interféromètre de sorte que la force de base est de 0 V en sélectionnant et en appuyant sur laplage de réinitialisationsur l’interféromètre (voir tableau des matériaux).
      4. Lorsque la trace de force est stable, effectuez l’étape rapide du verre (taille de l’étape = 100 μm).
         Les paramètres du générateur de signaux se trouvent dans le tableau 1 (figure 5C). Une trace d’activation-relaxation similaire à la figure 4D sera enregistrée et visible dans le logiciel du contrôleur système.
      5. Pause de l’enregistrement des données logicielles du contrôleur système en appuyant sur le boutonPause.
      6. Si aucune activation ne doit être effectuée, fermez les vannes 1 et 6 pour arrêter le flux de verre en décochant le bouton '1+6' (Figure 6B),arrêtez la pompe à seringues (Figure 9, voir Tableau des matériaux) en appuyant sur 'Terminate', et arrêtez le flux d’arrière-plan en fermant la valve Luer.
   2. Courbe Force-pCa
      REMARQUE : Ceci est similaire à l’étape 4.1.1 pour obtenir la force active maximale, mais avec plusieurs activations utilisant différentes solutions de pca.
      1. Commencez à enregistrer les données dans le logiciel du contrôleur système en appuyant sur 'Démarrer'.
      2. Ouvrez les vannes 1 et 2 avec le logiciel de panneau d’acquisition de données pour démarrer le flux de solution de détente et pCa 6.2 à travers le verre.
      3. Réinitialiser la plage de l’interféromètre de sorte que la force de base est de 0 V en sélectionnant et en appuyant sur 'Reset Range' sur l’interféromètre.
      4. Lorsque la trace de force est stable, effectuez l’étape rapide du verre (taille de l’étape = 100 μm).
         Les paramètres du générateur de signaux se trouvent dans le tableau 1.
      5. Pause le logiciel du contrôleur système en appuyant sur le boutonPause.
      6. Répétez les étapes 4.1.2.1–4.1.2.4 pour les vannes 1 et 3 (pCa 5.8), les vannes 1 et 4 (pCa 5.6), les vannes 1 et 5 (pCa 5.4) et les vannes 1 et 6 (pCa 4.5).
      7. Si aucune activation ne doit être effectuée, fermez les vannes 1 et 6 pour arrêter le flux de verre en décochant le bouton '1+6' (Figure 6A),arrêtez la pompe à seringues (Figure 9) en appuyant sur 'Termin', et arrêtez le flux de fond en fermant la valve Luer.
   3. Mesure du taux de réaménagementité (k_TR).
      REMARQUE : Ceci est similaire à l’étape 4.1.1 pour la force active maximale, mais avec quelques modifications et étapes supplémentaires.
      1. Calculer le mouvement piézo nécessaire pour relâcher le myofibril 15% et entrez cette valeur dans le générateur de signal (Figure 5D, Tableau 1).
      2. Commencez à enregistrer les données dans le logiciel du contrôleur système en appuyant sur 'Start'.
      3. Ouvrez les vannes 1 et 6 avec le panneau d’acquisition de données (Figure 6A) logiciel pour démarrer le flux de la solution de détente et pCa 4.5 à travers le verre.
      4. Réinitialiser la plage de l’interféromètre de sorte que la force de base est de 0 V en sélectionnant et en appuyant sur 'Reset Range' sur l’interféromètre.
      5. Lorsque la trace de force est stable, effectuez l’étape rapide du verre (taille de l’étape = 100 μm).
         Les paramètres du générateur de signaux se trouvent dans le tableau 1.
      6. Lorsque le plateau de force est atteint, effectuer le shortening-restretch avec le piezo.
         Les paramètres du générateur de signaux se trouvent dans (Figure 5D, Tableau 1). Une trace d’activation-relaxation similaire à la figure 4E sera enregistrée et visible dans le logiciel du contrôleur système.
         REMARQUE : Un protocole personnalisé peut être conçu pour automatiser les étapes ci-dessus.
      7. Pause le logiciel du contrôleur système en appuyant sur le boutonPause.
      8. Si il n’y a plus d’activations, fermez les vannes 1 et 6 pour arrêter le flux de verre en décochant le bouton '1+6' (Figure 6B),arrêtez la pompe à seringues (Figure 9) en appuyant sur 'Terminate', et arrêtez le flux de fond en fermant la vanne Luer.
2. Effectuez des mesures de force passive.
   1. Effectuez un étirement continu.
      1. Calculer le mouvement piézo nécessaire pour étirer le myofibril et entrer cette valeur dans le générateur de signal (Tableau 1).
         REMARQUE : Il s’agit de paramètres par exemple. Calculer la quantité d’étirement et le temps d’étirement par rapport à la longueur du sarcomère. Ces réglages sont nécessaires pour s’assurer que la vitesse d’étirement par sarcomere reste égale à travers les myofibrils.
      2. Commencez à enregistrer les données dans le logiciel du contrôleur système en appuyant sur 'Start'.
      3. Réinitialiser la plage de l’interféromètre de sorte que la force de base est de 0 V en sélectionnant et en appuyant sur 'Reset Range' sur l’interféromètre.
      4. Effectuez un étirement continu avec le générateur de signal dans le logiciel du contrôleur système pour faire fonctionner le piézo. Exemple de paramètres du générateur de signaux dans le tableau 1.
      5. Raccourcissez le myofibril pour laisser tomber le pied avec le piezo une fois l’étirement terminé (tableau 1).
   2. Effectuez un étirement dans le sens des étapes.
      1. Commencez à enregistrer les données dans le logiciel du contrôleur système en appuyant sur 'Start'.
      2. Réinitialiser la plage de l’interféromètre de sorte que la force de base est de 0 V en sélectionnant et en appuyant sur 'Reset Range' sur l’interféromètre.
      3. Effectuez un étirement dans le sens des étapes avec le générateur de signal dans le logiciel de contrôleur système pour faire fonctionner le piezo. Exemple de paramètres du générateur de signaux dans le tableau 1 (figure 5E).
   3. Raccourcir le myofibril pour mour la longueur avec le piézo après l’étirement est terminé. Exemple de paramètres du générateur de signaux dans le tableau 1.
3. Pause le logiciel du contrôleur système en appuyant sur le boutonPause.
4. Arrêtez l’enregistrement des données en appuyant sur le bouton «Stop» dans le logiciel du contrôleur système.
5. Enregistrez les données en appuyant sur 'File' et 'Save Data' dans le logiciel du contrôleur système.

5. Nettoyage

1. Retirez le myofibril mesuré et préparez-vous pour le prochain myofibril.
   1. Pour ce faire, arrachez soigneusement le myofibril tout en regardant à travers l’oculaire avec l’objectif 40x.
   2. Déplacez la sonde de force et le piezo. Remontez le verre jusqu’à la droite et vers l’arrière. Puis déplacez-vous vers le haut et glissez loin de la chambre d’écoulement. Retirer le bain de tissu.
   3. Pour nettoyer l’aiguille de montage, mettant en évidence l’utilisation du 10x et de l’oculaire. Tremper la brosse dans l’éthanol et badigeonner soigneusement et retirer la colle de l’aiguille.
      REMARQUE : Gardez à l’esprit qu’il faudra peut-être un certain temps avant que la colle ne se détache.
   4. Rincer la chambre d’écoulement et le bain de tissu avec de l’eau ultrapure.
   5. Placer la sonde dans une petite boîte de Pétri remplie d’eau ultrapure. Assurez-vous que la sonde est complètement submersée.
2. Lorsque les expériences sont terminées, nettoyez la configuration comme ci-dessus et effectuez les étapes supplémentaires suivantes.
   1. Vider le tube du bain d’écoulement. Envoyer les paramètres à la pompe à seringue de sortie (voir tableau des matériaux, figure 9). Valve = Valve de bain (2); Microstep mode = Normal; Cible piston = 0; Vitesse du piston = 30.
      REMARQUE : Terminez la commande lorsque le tube est vide.
   2. Initialiser la pompe plusieurs fois (Figure 9B).
   3. Égoutter les seringues. Pour ce faire, fermez toutes les valves Luer, ouvrez toutes les valves, retirez le tube de l’aiguille de la seringue, maintenez le tube de pCa spécifique sous l’aiguille et ouvrez la valve Luer. Utilisez les prises de pression pour accélérer le processus.
   4. Rattacher le tube à l’aiguille de la seringue. Remplissez les seringues d’environ 5 mL d’eau ultrapure. Placez une tasse sous le verre. Ouvrez toutes les vannes et ouvrez la vanne de pression pour rincer le système.
   5. Arrêtez le système. Éteignez le bloc d’alimentation du pc, de l’interféromètre et du contrôleur piezo.

6. Analyse des données

1. Exporter des traces de données du logiciel de contrôleur système (voir Tableau des matériaux)vers un logiciel de feuille de calcul ou un presse-papiers en ouvrant le fichier de données et en sélectionnant le segment souhaité. Les traces indiquées seront exportées (p. ex., force brute, longueur sarcomère et position de piezo).
2. Effectuer l’analyse avec le logiciel de choix (p. ex., MATLAB).

Résultats

Les traces de données ont été enregistrées et ouvertes avec le logiciel de contrôleur système (voir tableau des matériaux). Des traces complètes ou des segments sélectionnés ont été exportés vers le presse-papiers ou le fichier texte pour une analyse plus approfondie avec un logiciel souhaité. Les valves pour contrôler le flux des différentes solutions ont été commutées avec un logiciel personnalisé ou manuellement. Un script MATLAB personnalisé a été utilisé pour analyser les tau...

Discussion

Décrit est un protocole pour évaluer la fonction contractile des myofibrils isolés des tissus humains ou animaux de muscle squelettique. La résolution de force de cette configuration a déjà été décrite par Chavan et al.¹². En bref, il est déterminé par les fluctuations aléatoires de la longueur de la cavité Fabry-Pérot formée entre la fibre de détection et le porte-à-faux, qui produisent la partie dominante du bruit à la sortie de la lecture (exprimée en V) qui, multipliée par ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio Spec Products, Inc.	985370-XL	To isolate myofibrils
Custom coded		Matlab
Custom fabricated		Includes Labview program to control over serial connection; To control valves
Custom fabricated		To cool the Peltier module
Custom fabricated
Custom fabricated		Aluminum tissue chamber
Custom fabricated		To control the valves; Includes PC software to control over USB
IonOptix		System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step
IonOptix	MCS100	To record sarcomere length
IonOptix		Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher
IonOptix		Force probe
Koolance	ADT-EX004S
Koolance	EX2-755	To cool the Peltier module
Microsoft		Data registration
Olympus	IX71
Olympus	TH4-200
Sigma-Aldrich	529265	Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue
Sigma-Aldrich	78471	Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue
TE Technology, Inc.	TE-63-1.0-1.3	To cool the tissue flow chamber
TE Technology, Inc.	TC-720	Includes PC software to control over USB
Tecan Trading AG	20736652
Tecan Trading AG	20739263	Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber
Thermo scientific	2441081
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)	Discontinued	Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)	TG150-4	To perfuse the tissue
		1 PC for IonWizard and 1 PC for other software