Isolando Myofibrils de Biópsias musculares esqueléticas e determinando função contractile com um transdutor de força de resolução nano-Newton

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para avaliar as propriedades contratuais de myofibrils musculares estriados com resolução nano-Newton. O protocolo emprega uma configuração com uma sonda de força óptica baseada em interferometria. Esta configuração gera dados com uma alta relação sinal-ruído e permite a avaliação da cinética contracttil dos myofibrils.

Resumo

Células musculares estriadas são indispensáveis para a atividade de humanos e animais. As fibras musculares únicas são compostas por miofibrils, que consistem em sarcomeres serialmente ligados, as menores unidades contratuais em músculos. A disfunção sarérica contribui para a fraqueza muscular em pacientes com mutações em genes codificando proteínas sarcomericas. O estudo da mecânica miofibril permite a avaliação das interações actin-myosin sem potenciais efeitos de confusão de miofibrils danificados e adjacentes ao medir a contratilidade de fibras musculares únicas. Danos ultraestruturais e desalinhamento de miofibrils podem contribuir para a falta de comprometimento. Se houver danos estruturais nos miofibrils, eles provavelmente quebram durante o procedimento de isolamento ou durante o experimento. Além disso, estudos em miofibrils fornecem a avaliação das interações actin-myosin na presença das restrições geométricas dos sarcomeres. Por exemplo, medições em miofibrils podem elucidar se a disfunção miofibrilar é o efeito primário de uma mutação em uma proteína sarcomeric. Além disso, a perfusão com soluções ou compostos de cálcio é quase instantânea devido ao pequeno diâmetro do miofibril. Isso torna os myofibrils eminentemente adequados para medir as taxas de ativação e relaxamento durante a produção de força. O protocolo descrito neste artigo emprega uma sonda de força óptica baseada no princípio de um interferômetro Fabry-Pérot capaz de medir forças na faixa nano-Newton, acoplado a um motor de comprimento piezo e um sistema de perfusão de passo rápido. Esta configuração permite o estudo da mecânica miofibril com medições de força de alta resolução.

Introdução

As células musculares estriadas são indispensáveis para as atividades cotidianas. O movimento dos membros, a função respiratória e o movimento de bombeamento do coração dependem da força gerada pelas células musculares. O músculo esquelético consiste em fascicles musculares contendo feixes de fibras musculares únicas(Figura 1A). Estas fibras musculares são compostas por miofibrils, que são formados por sarcomeres serialmente ligados(Figura 1B,D). Os sarcomeres contêm filamentos finos e grossos. Estes consistem principalmente em cadeias de moléculas de actina e miosina, respectivamente(Figura 1B). As interações actina-miosina são responsáveis pela capacidade de geração de força dos músculos. Pacientes com mutações em genes codificados por proteínas sarcomericas, como nebulina, actina e troponina T, sofrem de fraqueza muscular devido à disfunção contratil¹.

A qualidade da contratilidade muscular pode ser estudada em vários níveis de organização, desde músculos inteiros in vivo até interações actin-myosin em ensaios de motilidade in vitro. Durante as últimas décadas, vários grupos de pesquisa desenvolveram configurações para determinar a contralidade dos myofibrils individuais^{2,3,4,5,6,7,8,,9,10}. Essas configurações baseiam-se na detecção de alterações na deflexão a laser de um cantilever (ou seja, deflexão óptica do feixe) causada pela contração do myofibril (para detalhes, consulte Labuda et al.¹¹). Embora a determinação da função contratual dos myofibrils tenha algumas limitações (por exemplo, a dinâmica dos processos de acoplamento excitação-contração que estão a montante dos miofibrils são escassas), há múltiplas vantagens nessa abordagem. Estes incluem: 1) a capacidade de avaliar interações actina-miosina na presença das restrições geométricas dos sarcomeres; 2) a capacidade de avaliar as interações actina-miosina sem potenciais efeitos confusos de miofibrils danificados e adjacentes (ao medir a contratilidade de fibras musculares únicas danos ultraestruturais e desalinhamento de miofibrils podem contribuir para a contratilidade prejudicada) (Figura 1D); 3) o pequeno diâmetro dos miofibrils (~1 μm, Figura 2A) e a falta de membranas permitem uma difusão de cálcio quase instantânea nos sarcomeres. Além disso, se os danos estruturais estiverem presentes nos miofibrils, eles provavelmente quebram durante seu isolamento ou durante o experimento. Assim, avaliar a contratude do miofibril é um método elegante para estudar os mecanismos básicos de contração muscular e entender se as interações actina-miosina perturbada são a principal causa de doença muscular causada por mutações em proteínas sarcomericas.

Este protocolo apresenta uma configuração recém-desenvolvida para determinar a contratilidade dos myofibrils incorporando uma sonda de força cantilever com resolução nano-Newton (ou seja, Optiforce). Esta sonda de força é baseada no princípio da interferometria. A interferometria permite o uso de cantilevers relativamente rígidos. Isso torna possível medir a força com pouca deflexão do cantilever, aproximando-se de contrações isométricas do miofibril. A sonda permite a avaliação de forças passivas e ativas baixas que são produzidas por um único myofibril isolado de diferentes biópsias musculares, incluindo as de indivíduos humanos, com uma alta relação sinal-ruído. A sonda óptica cantilever force incorporada nesta configuração é baseada em um interferômetro Fabry-Pérot¹². O interferômetro detecta pequenos deslocamentos entre uma fibra óptica e um cantilever revestido de ouro montado em uma ferrule(Figura 3). A distância entre a fibra óptica e o cantilever é chamada de cavidade Fabry-Pérot. Os myofibrils são montados entre a sonda e o motor piezo usando duas fibras de montagem de vidro revestidas de cola. A força produzida pelo myofibril pode ser matematicamente derivada dos dados do interferômetro. A interferometria é baseada na superposição ou interferência de duas ou mais ondas (nesta configuração três ondas de luz). A luz laser com comprimento de onda entre 1.528,77-1.563,85 nm é emitida a partir do interferômetro e é enviada através da fibra óptica. Na sonda, a luz é refletida 1) na interface entre a fibra óptica e o meio(Figura 3A); 2) na interface do meio e do cantilever(Figura 3B); e 3) na interface entre o revestimento metálico e dourado do cantilever(Figura 3C). A reflexão na interface A e B depende do índice de refração (n)do meio em que a sonda está submersa. A luz, composta pelas três reflexões sobrepostas, retorna a um fotodiodo no interferômetro. O fotodiodo mede a intensidade da luz, que é o resultado do padrão de interferência das três reflexões sobrepostas. Quando a força contratil é gerada ativando ou esticando um myofibril, o myofibril puxa o cantilever. Esse movimento altera o tamanho da cavidade (d) e, consequentemente, o número de comprimentos de onda que se encaixam na cavidade. A luz refletida no cantilever terá uma fase diferente, resultando em um padrão de interferência diferente. O fotodiodo registra essa mudança de intensidade de padrão de interferência como uma mudança em Volts. Posteriormente, a geração de força myofibril é calculada a partir desta mudança, levando em conta a rigidez cantilever. A sonda de força é calibrada pelo fabricante empurrando a ponta da agulha de montagem, presa à extremidade de entrega livre do cantilever, contra uma balança de pesagem, mantendo a dobra do cantilever igual a um múltiplo do comprimento de onda do laser de leitura¹³. Assim, a interferometria é um método altamente sensível para detectar pequenas alterações à distância, permitindo a medição de forças com resolução nano-Newton. Esta resolução permite a avaliação da produção de força miofibrilar com uma alta relação sinal-ruído. Enquanto a interferometria tradicional limita a faixa de medidas à parte linear da curva de interferência, o uso de um amplificador de travamento e modulação do comprimento de onda laser supera essa limitação¹⁴. Isso é explicado com mais detalhes na seção de discussão.

Para medir a tensão ativa do miofibril, um sistema de perfusão de passo rápido foi incorporado para expor o miofibril às soluções de cálcio(Figura 4A). O sistema de perfusão de passo rápido permite que mudanças de solução ocorram dentro de 10 ms. Devido ao seu pequeno diâmetro, a difusão de cálcio nos miofibrils é quase instantânea. Assim, este sistema é particularmente adequado para medir as taxas de ligação actin-myosin durante a ativação e liberação durante o relaxamento. A taxa de ativação (k_ACT) e relaxamento (k_REL) podem ser determinadas a partir das curvas de ativação-relaxamento. Além disso, expondo os miofibrils a soluções de cálcio de concentração crescente, a relação força-cálcio e a sensibilidade ao cálcio podem ser determinadas.

Além disso, um motor de comprimento piezo permite alongamento rápido e encurtamento do myofibril. Isso oferece a possibilidade de estudar as propriedades viscoelásticas (ou seja, tensão passiva) do myofibril, bem como realizar um rápido encurtamento e ressuado do miofibril para determinar a taxa de reurbanização da tensão (k_TR). Os parâmetros recuperados de experimentos de tensão ativa e passiva podem ser alterados por mutações genéticas em uma proteína sarcomeric.

Esta configuração personalizada foi usada para medir as características contratuais ativas e passivas de myofibrils isolados de músculos esqueléticos humanos, pacientes e camundongos saudáveis.

Protocolo

O protocolo de obtenção de biópsias humanas foi aprovado pelo conselho de revisão institucional do Vu University Medical Center (#2014/396) e o consentimento por escrito informado foi obtido dos sujeitos. O protocolo de obtenção de biópsias musculares animais foi aprovado pelo comitê local de ética animal da UNIVERSIDADE VU (AVD114002016501)

1. Preparação e isolamento miofibril

NOTA: Use métodos descritos anteriormente para glicerinar biópsias, preparar as diferentes soluções de concentração de cálcio (pCa)^7,16,17e isolar miofibrils^2,,18.

1. Descongele as soluções relaxantes (pCa 9.0, Rx) e ativação (pCa 4.5, Act), bem como os inibidores (1 M E64, 1 M DTT, 1 M de leupeptina, 1 M PMSF), que são armazenados a -80 °C.
2. Pegue uma peça glicerada de biópsia muscular estriada de aproximadamente 1 mm³ e coloque-a em uma pequena placa de Petri com solução de 1:1 Rx/glicerol (v/v) e coloque a placa de Petri em uma placa fria a 4 °C.
3. Dissecar o pedaço do músculo usando microscópio de dissecção e fórceps, separando fibras musculares únicas sem isolá-las do pedaço do músculo.
   NOTA: Remova o máximo possível de tecido gorduroso e conjuntivo para evitar a contaminação da suspensão do miofibril.
4. Transfira o pedaço de tecido dissecado para um tubo de 5 mL com 1,5 mL de solução relaxante com inibidores (1 μL/mL E-64, 1 μL/mL leupepína, 1 μL/mL DTT e 125 μL/mL PMSF). Deixe o tecido amenizar aproximadamente 4 °C por 1h.
5. Durante a incubação, inicializa os dois PCs, liga os dispositivos e abre o software associado (ver Tabela de Materiais).
6. Submergir a sonda de força em água ultrauso em uma placa de Petri e calibrar a sonda.
   1. Pressione o'Assistente de partida' no interferômetro e siga as instruções na tela. Depois de pressionar Calibrar,toque no estágio do microscópio.
      NOTA: Tocar no estágio do microscópio fará com que o cantilever desvie e passe por franjas. Isso permite a calibração da sonda.
   2. Deixe a sonda submersa na água ultrauso na placa de Petri após a calibração.
7. Inicialize a posição do motor piezo. Para isso, siga um dos passos detalhados abaixo.
   1. Quando o motor piezo for usado para a tensão k_TR, defina o comprimento para 0 μm.
      As configurações do gerador de sinal podem ser encontradas na Tabela 1, Figura 5A.
   2. Quando o motor piezo for usado para tensão passiva, defina o comprimento para 50 μm.
      As configurações do gerador de sinal podem ser encontradas na Tabela 1.
      NOTA: A diferença entre as etapas é a posição inicial do motor de comprimento piezo. Para esticar o miofibril, o motor piezo precisa puxar para aumentar a distância entre as agulhas de montagem e para alongar o miofibril. Para afrouxar o miofibril, o motor piezo precisa empurrar para diminuir a distância entre as agulhas de montagem e encurtar o miofibril.
8. Prepare um slide de microscópio. Pipeta 150 μL de polihidroxietilmetato (poli-HEMA) solução (5% poly-HEMA em 95% etanol, w/v) em um slide de microscópio e espalhá-lo através do slide para que esteja tudo coberto.
   NOTA: Se uma suspensão myofibril for esbofícula em um slide de microscópio não revestido, os myofibrils que afundam na parte inferior grudarão no slide do microscópio e não será possível colá-los.
9. Encha as seringas com soluções pCa (ver Figura 4A) e preencha o sistema de perfusão.
   NOTA: Nestas etapas todos os tubos são pré-preenchidos com a solução apropriada para garantir que todas as bolhas de ar sejam removidas da tubulação.
   1. Encha a tubulação de entrada do fluxo de fundo da câmara de fluxo(Figura 3, 4A) entrada com Rx.
   2. Quando usado, lave o coletor com água ultrauso para remover o ar. Para isso, conecte a seringa com água ultrauso à tomada e lave-a na direção inversa. Bloqueie as portas não usos do coletor.
   3. Habilite cada seringa pCa para encher seus respectivos tubos com solução pCa. Em seguida, conecte-os ao coletor e ao Ɵ-vidro.
   4. Abra as válvulas 1 e 6 com o software do painel de aquisição de dados (ver Tabela de Materiais) verificando o botão '1+6'(Figura 6A) para encher o Ɵ-vidro com as soluções relaxantes (pCa 9.0) e ativação (4,5) e válvulas próximas quando o vidro Ɵ é preenchido(Figura 6B).

2. Montagem de um myofibril

1. Cubra um slide de microscópio com poly-HEMA para evitar que os miofibrils grudem no vidro.
2. Prepare o homogeneizador (ver Tabela de Materiais) para homogeneização tecidual. Limpe a haste do rotor interno com papel de tecido limpo, monte o homogeneizador e gire 1x para 15 s em álcool e três vezes por 15 s cada em água ultrauso. Prerinse o homogeneizador na solução relaxante 1 x para 15 s no gelo.
3. Coloque a haste homogeneizadora no tubo contendo o tecido muscular conforme descrito na etapa 1.4 e, mantendo o tubo no gelo, gire o rotor por 15 s na velocidade 5 para rasgar o tecido muscular e obter uma suspensão de myofibril.
4. Pipeta ~50 μL da suspensão myofibril e ~250 μL da solução relaxante no slide do microscópio revestido com poly-HEMA no banho de tecido. Isso formará uma queda líquida. Cubra o banho com uma tampa para proteger do pó e espere de 5 a 10 minutos para permitir que os myofibrils afundem até o fundo.
   NOTA: A relação entre a suspensão e a solução relaxante depende da qualidade do isolamento, portanto, ajustar-se em conformidade. Por exemplo, se o rendimento do myofibril for baixo e poucos myofibrils adequados estiverem presentes na suspensão, adicione mais suspensão de myofibril e dilua com solução menos relaxante (por exemplo, 75 μL de suspensão myofibril e 225 μL de solução relaxante). O tecido muscular cardíaco e esquelético é fácil de reconhecer devido ao seu padrão de estriação. Usando um objetivo de 10x ou 40x, este padrão também é visível em um único myofibril. Caso outro tecido esteja presente na suspensão, os myofibrils podem ser selecionados visualmente. Pode-se pular a espera de 5 a 10 minutos. No entanto, isso aumenta a dificuldade de colar um miofibril.
5. Reveste agulhas de montagem com cola (shellac + etanol; 120 mg shellac em 2 mL de 70% de etanol). Para isso, aqueça a cola a 65 °C para 30-60 s e pipeta ~6 μL em um novo slide de vidro não revestido. Mergulhe a ponta de cada agulha de montagem na cola e repita até que uma camada de cola seja visível. Mova a sonda e o piezo verticalmente com os micromanipuladores para abrir espaço para colocar o banho de tecido no estágio do microscópio. Remova a lâmina de vidro que contém a cola.
6. Montando os myofibrils
   1. Coloque o banho de tecido com o slide do microscópio revestido com poli-HEMA contendo a suspensão do myofibril no estágio do microscópio. Use o palco para encontrar um myofibril adequado com o objetivo de 40x. Se necessário, mova-se e gire o banho de tecido para mover o myofibril para uma posição montável.
      NOTA: Procure myofibrils com um padrão de estriação visível com aproximadamente 30 μm de comprimento. Como descrito em detalhes nas etapas 3.1 e 3.2.1 é possível verificar o comprimento e o comprimento do sarcomere antes de colar o myofibril. Não cole miofibrils rasgados, porque estes são susceptíveis de quebrar durante a contração.
   2. Deslize a câmara de fluxo para o lugar diretamente acima da gota líquida contendo os miofibrils no banho de tecido (tubos sobre o slide na etapa 2.4) e abaixe-a. Pare antes que atinja a queda de líquido.
   3. Abaixe a agulha de montagem piezo e pressione-a na ponta inferior do myofibril. Levante-o ligeiramente para verificar se o myofibril está preso à agulha.
   4. Abaixe a câmara de fluxo o suficiente para que a agulha de montagem da sonda chegue ao fundo sem que a sonda toque na câmara de fluxo.
   5. Pressione a agulha de montagem da sonda na ponta superior do myofibril. Levante-o ligeiramente para verificar se o myofibril está preso à agulha.
   6. Levante o myofibril do fundo do banho o mais longe possível sem perder a capacidade de se concentrar sem que o objetivo toque na parte inferior do vidro.

3. Experimento inicializante

1. Use os softwares micromanipuladores, câmera e controlador de sistema(Figura 7A, ver Tabela de Materiais) para medir o comprimento do sarcomere. Mova a sonda piezo e/ou force para definir o comprimento inicial de sarcomere do myofibril para 2,5 μm.
   NOTA: Um comprimento de sarcomere de 2,5 μm garante uma sobreposição ideal entre cabeças de miosina e actina.
2. Utilizando a função do vaso do software do controlador do sistema, meça o comprimento e largura do myofibril(Figura 7B,C).
   NOTA: Ao girar a câmera, ela pode inclinar horizontal e/ou verticalmente. Para verificar o alinhamento da câmera, um nível de espírito pode ser usado para verificar se a câmera está girada e não inclinada.
   1. Posicione o myofibril no centro da imagem de vídeo usando o estágio do microscópio.
   2. Desenhe um quadrado de um lado do myofibril para o outro. Para o comprimento, certifique-se de incluir a borda escura das gotículas de cola(Figura 2A) no quadrado porque o processamento da imagem é baseado no contraste.
   3. Comece a gravar os dados no software do controlador do sistema (ver Tabela de Materiais) pressionando 'Iniciar' e após 5 s pausar a gravação de dados do software do controlador do sistema pressionando o botão 'Pausa'. O comprimento agora está registrado nos dados.
   4. Para a largura gire primeiro a câmera 90° (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, use o contraste da borda do próprio myofibril.
   5. Comece a gravar os dados no software do controlador do sistema (ver Tabela de Materiais) pressionando 'Iniciar' e após 5 s pausar a gravação de dados do software do controlador do sistema pressionando o botão'Pausa'. A largura está agora registrada nos dados.
3. Se a tensão ativa do myofibril precisa ser determinada, a configuração de perfusão precisa ser usada. Se assim for, continue a passo 3.4. Se apenas a tensão passiva for determinada, pule as etapas 3.4-4.1.3.7 e continue na etapa 4.2.
4. Posicione e inicialmente a configuração da perfusão.
   NOTA: Isso só é necessário para a geração de força ativa. Continue a etapa 4.2 ao realizar experimentos de tensão passiva.
   1. Ajuste a posição do motor em passo rápido em 4 V (Figura 5B).
   2. Deslize o suporte de perfusão sobre a mesa para alinhar o canto inferior esquerdo do suporte com a fita sobre a mesa.
      NOTA: Tenha cuidado para não acertar a sonda de força ou o motor piezo.
   3. Use o manipulador para posicionar aproximadamente o Ɵ-vidro por olho.
   4. Olhe através da ocular e mova cuidadosamente o Ɵ-vidro em direção ao myofibril usando o manipulador.
   5. Alinhe o canal superior do Ɵ-vidro com o myofibril usando o manipulador e verifique a posição realizando um passo rápido (as configurações do gerador de sinal podem ser encontradas na Tabela 1) com o software do controlador do sistema(Figura 2B–C, ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Certifique-se de que o canal inferior estará alinhado com o myofibril durante a fase de ativação da etapa rápida (Figura 2B–C).
5. Ligue o fluxo de fundo de Rx (Figura 4A) para criar um fluxo de fundo laminar na câmara de fluxo.
   NOTA: O fluxo de fundo é necessário para evitar o fluxo turbulento como resultado do fluxo de solução pCa do Ɵ-vidro.
   1. Ligue a entrada da câmara de fluxo com uma alavanca de válvula Luer.
      1. Envie os seguintes parâmetros para a bomba de saída para começar a drenar a câmara de fluxo e evitar o transbordamento da câmara de fluxo (Figura 9): Válvula = Válvula de banho (2); Modo microstep = Micro; Meta de êmbolo = 48.000; Velocidade do êmbolo = 38-40 (arbitrário).
         NOTA: Certifique-se de que o nível do fluido está estável o tempo todo. O myofibril não deve secar e nem o cantilever. É melhor ter um pouco de transbordamento do que muito pouco fluxo.
6. Para definir a temperatura a um valor desejado com o controlador de temperatura termoelétrica(Figura 8, ver Tabela de Materiais),digite a temperatura desejada epressione' Iniciar '. Aguarde até que a temperatura desejada seja atingida verificando o gráfico no software do controlador de temperatura termoelétrica e continue.
   NOTA: Ao realizar experimentos à temperatura ambiente, o controlador de temperatura termoelétrica não precisa ser utilizado.

4. Protocolo experimental(s)

1. Decida quais protocolos de força ativa precisam ser realizados.
   NOTA: Dependendo dos dados necessários para o estudo, vários tipos de experimentos de força ativa podem ser realizados: etapa 4.1.1, medição da força máxima na saturação [Ca²⁺]; passo 4.1.2, obtendo uma curva Force-pCa para determinar a sensibilidade ao cálcio, além da etapa 4.1.1; passo 4.1.3, determinando a taxa de reurbanização da tensão fazendo um protocolo de encurtamento-ressundo, além da etapa 4.1.1 ou 4.1.2.
   1. Medir a força ativa máxima.
      1. Comece a gravar os dados no software do controlador do sistema (ver Tabela de Materiais) pressionando 'Iniciar'.
      2. Abra as válvulas 1 e 6 com o painel de aquisição de dados (ver Tabela de Materiais) verificando o botão '1+6' para iniciar o fluxo de Ɵ-vidro da solução relaxante e ativando a solução através do Ɵ-vidro(Figura 6A).
      3. Reinicie o intervalo do interferômetro de modo que a força da linha de base seja 0 V selecionando e pressionando 'Reset Range' no interferômetro (ver Tabela de Materiais).
      4. Quando o traço de força estiver estável, realize o passo rápido de Ɵ-vidro (tamanho da etapa = 100 μm).
         As configurações do gerador de sinal podem ser encontradas na Tabela 1 (Figura 5C). Um traço de relaxamento de ativação semelhante à Figura 4D será gravado e visível no software do controlador do sistema.
      5. Pause a gravação de dados do software do controlador do sistema pressionando o botão'Pausa'.
      6. Se não houver mais ativações, feche as válvulas 1 e 6 para parar Ɵ fluxo de vidro, descontrolando o botão '1+6'(Figura 6B),pare a bomba de seringa(Figura 9, veja Tabela de Materiais) pressionando 'Termine' e pare o fluxo de fundo fechando a válvula Luer.
   2. Curva Force-pCa
      NOTA: Isso é semelhante ao passo 4.1.1 para obter a força ativa máxima, mas com múltiplas ativações usando diferentes soluções pCa.
      1. Comece a gravar os dados no software do controlador do sistema pressionando'Iniciar'.
      2. Abra as válvulas 1 e 2 com o software do painel de aquisição de dados para iniciar o fluxo de solução relaxante e pCa 6.2 através do Ɵ-vidro.
      3. Redefinir a faixa do interferômetro de modo que a força da linha de base seja 0 V selecionando e pressionando 'Reset Range' no interferômetro.
      4. Quando o traço de força estiver estável, realize o passo rápido de Ɵ-vidro (tamanho da etapa = 100 μm).
         As configurações do gerador de sinal podem ser encontradas na Tabela 1.
      5. Pause o software do controlador do sistema pressionando o botão'Pausa'.
      6. Repetição de passos 4.1.2.1-4.1.2.4 para as válvulas 1 e 3 (pCa 5.8), válvulas 1 e 4 (pCa 5.6), válvulas 1 e 5 (pCa 5.4), e válvulas 1 e 6 (pCa 4.5).
      7. Se não houver mais ativações, feche as válvulas 1 e 6 para parar Ɵ fluxo de vidro, descontrolando o botão '1+6'(Figura 6A),pare a bomba de seringa(Figura 9) pressionando 'Termine' e pare o fluxo de fundo fechando a válvula Luer.
   3. Medida taxa de reurbanização de tensão (k_TR).
      NOTA: Isso é semelhante ao passo 4.1.1 para a força ativa máxima, mas com algumas alterações e etapas adicionadas.
      1. Calcule o movimento piezo necessário para afrouxar o myofibril 15% e digite esse valor no gerador de sinal (Figura 5D, Tabela 1).
      2. Comece a gravar os dados no software do controlador do sistema pressionando 'Iniciar'.
      3. Abra as válvulas 1 e 6 com o painel de aquisição de dados(Figura 6A)software para iniciar o fluxo da solução relaxante e pCa 4.5 através do Ɵ-vidro.
      4. Redefinir a faixa do interferômetro de modo que a força da linha de base seja 0 V selecionando e pressionando 'Reset Range' no interferômetro.
      5. Quando o traço de força estiver estável, realize o passo rápido de Ɵ-vidro (tamanho da etapa = 100 μm).
         As configurações do gerador de sinal podem ser encontradas na Tabela 1.
      6. Quando o planalto de força for atingido, realize o encurtamento-ressuante com o piezo.
         As configurações do gerador de sinal podem ser encontradas em(Figura 5D, Tabela 1). Um traço de relaxamento de ativação semelhante à Figura 4E será gravado e visível no software do controlador do sistema.
         NOTA: Um protocolo personalizado pode ser feito para automatizar os passos acima.
      7. Pause o software do controlador do sistema pressionando o botão'Pausa'.
      8. Se não houver mais ativações, feche as válvulas 1 e 6 para parar Ɵ fluxo de vidro, descontrolando o botão '1+6'(Figura 6B),pare a bomba de seringa(Figura 9) pressionando 'Termine' e pare o fluxo de fundo fechando a válvula Luer.
2. Realizar medições de força passiva.
   1. Realize um estiramento contínuo.
      1. Calcule o movimento piezo necessário para esticar o miofibril e digite esse valor no gerador de sinal(Tabela 1).
         NOTA: São configurações de exemplo. Calcule a quantidade de estiramento e o tempo de estiramento em relação ao comprimento do sarcomere. Estas configurações são necessárias para garantir que a velocidade de estiramento por sarcomere permaneça igual em meus miofibrils.
      2. Comece a gravar os dados no software do controlador do sistema pressionando 'Iniciar'.
      3. Redefinir a faixa do interferômetro de modo que a força da linha de base seja 0 V selecionando e pressionando 'Reset Range' no interferômetro.
      4. Realize o alongamento contínuo com o gerador de sinal no software do controlador do sistema para operar o piezo. As configurações do gerador de sinal de exemplo podem ser encontradas na Tabela 1.
      5. Encurte o myofibril para afrouxar o comprimento com o piezo após o trecho terminar(Tabela 1).
   2. Faça um alongamento stepwise.
      1. Comece a gravar os dados no software do controlador do sistema pressionando 'Iniciar'.
      2. Redefinir a faixa do interferômetro de modo que a força da linha de base seja 0 V selecionando e pressionando 'Reset Range' no interferômetro.
      3. Realize um trecho stepwise com o gerador de sinal no software do controlador do sistema para operar o piezo. As configurações do gerador de sinal de exemplo podem ser encontradas na Tabela 1 (Figura 5E).
   3. Encurte o myofibril para afrouxar o comprimento com o piezo depois que o trecho estiver terminado. As configurações do gerador de sinal de exemplo podem ser encontradas na Tabela 1.
3. Pause o software do controlador do sistema pressionando o botão'Pausa'.
4. Pare a gravação de dados pressionando o botão'Stop' no software do controlador do sistema.
5. Salve os dados pressionando 'Arquivo' e 'Salvar dados' no software do controlador do sistema.

5. Limpeza

1. Remova o miofibril medido e prepare-se para o próximo myofibril.
   1. Para isso, rasgue cuidadosamente o myofibril enquanto olha através do ocular com o objetivo de 40x.
   2. Mova-se para cima da sonda de força e piezo. Suba o Ɵ-vidro todo o caminho para cima, para a direita e para trás. Em seguida, mova-se para cima e deslize para longe da câmara de fluxo. Remova o banho de tecido.
   3. Para limpar a agulha de montagem, leve-a para o foco usando o 10x e o ocular. Mergulhe a escova no etanol e escove cuidadosamente e retire a cola da agulha.
      NOTA: Tenha em mente que pode levar algum tempo até que a cola saia.
   4. Enxágüe a câmara de fluxo e o banho de tecido com água ultrapura.
   5. Coloque a sonda em uma pequena placa de Petri cheia de água ultrapura. Certifique-se de que a sonda está completamente submersa.
2. Quando os experimentos estiverem concluídos, limpe a configuração conforme acima e execute as seguintes etapas adicionais.
   1. Esvazie a tubulação do banho de fluxo. Envie os parâmetros para a bomba de seringa de saída (ver Tabela de Materiais, Figura 9). Válvula = Válvula de banho (2); Modo microstep = Normal; Alvo do êmbolo = 0; Velocidade do êmbolo = 30.
      NOTA: Encerre o comando quando a tubulação estiver vazia.
   2. Inicialize a bomba várias vezes(Figura 9B).
   3. Escorra as seringas. Para isso, feche todas as válvulas Luer, abra todas as válvulas, remova o tubo da agulha da seringa, segure o tubo de pCa específico sob a agulha e abra a válvula Luer. Use os plugues de pressão para acelerar o processo.
   4. Recoloque a tubulação na agulha da seringa. Encha as seringas com ~5 mL de água ultrapura. Coloque um copo debaixo do Ɵ de vidro. Abra todas as válvulas e abra a válvula de pressão para lavar o sistema.
   5. Desligue o sistema. Desligue o pc, o interferômetro e o bloco de alimentação do controlador Piezo.

6. Análise de dados

1. Exportar traços de dados do software do controlador do sistema (ver Tabela de Materiais) para um programa de software de planilha ou área de transferência, abrindo o arquivo de dados e selecionando o segmento desejado. Os traços mostrados serão exportados (por exemplo, força bruta, comprimento de sarcomere e posição piezo).
2. Realizar análise com o software de escolha (por exemplo, MATLAB).

Resultados

Os vestígios de dados foram registrados e abertos com o software do controlador do sistema (ver Tabela de Materiais). Traços completos ou segmentos selecionados foram exportados para a área de transferência ou arquivo de texto para análise posterior com um software desejado. As válvulas para controlar o fluxo das diferentes soluções foram trocadas com software personalizado ou manualmente. Um script MATLAB personalizado foi usado para analisar as taxas de ativação, redesenvolvimento de tensão ...

Discussão

Descrito é um protocolo para avaliar a função conctítil de miofibrils isolados dos tecidos musculares esqueléticos humanos ou animais. A resolução de força desta configuração foi descrita anteriormente por Chavan et al.¹². Em suma, é determinado pelas flutuações aleatórias do comprimento da cavidade Fabry-Pérot formada entre a fibra de detecção e o cantilever, que produzem a parte dominante do ruído na saída da leitura (expressa em V) que, multiplicada pela sensibilidade de defl...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio Spec Products, Inc.	985370-XL	To isolate myofibrils
Custom coded		Matlab
Custom fabricated		Includes Labview program to control over serial connection; To control valves
Custom fabricated		To cool the Peltier module
Custom fabricated
Custom fabricated		Aluminum tissue chamber
Custom fabricated		To control the valves; Includes PC software to control over USB
IonOptix		System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step
IonOptix	MCS100	To record sarcomere length
IonOptix		Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher
IonOptix		Force probe
Koolance	ADT-EX004S
Koolance	EX2-755	To cool the Peltier module
Microsoft		Data registration
Olympus	IX71
Olympus	TH4-200
Sigma-Aldrich	529265	Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue
Sigma-Aldrich	78471	Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue
TE Technology, Inc.	TE-63-1.0-1.3	To cool the tissue flow chamber
TE Technology, Inc.	TC-720	Includes PC software to control over USB
Tecan Trading AG	20736652
Tecan Trading AG	20739263	Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber
Thermo scientific	2441081
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)	Discontinued	Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)	TG150-4	To perfuse the tissue
		1 PC for IonWizard and 1 PC for other software