JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada nano-Newton çözünürlüğü ile striated kas miyofibrils kontraktil özelliklerini değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Protokolde interferometri tabanlı optik kuvvet sondası içeren bir kurulum uyguluyor. Bu kurulum yüksek sinyal-gürültü oranı ile veri üretir ve miyofibrils kontraktil kinetiği değerlendirilmesini sağlar.

Özet

Burlu kas hücreleri insan ve hayvanların aktivitesi için vazgeçilmezdir. Tek kas lifleri miyofibrils oluşur, hangi seri bağlı sarcomeres oluşur, kas en küçük kontraktil birimleri. Sarkoerik disfonksiyon sarkoerik proteinler için kodlama genmutasyonları olan hastalarda kas güçsüzlüğüne katkıda bulunur. Miyofibril mekaniğinin çalışması, tek kas liflerinin kontraktilitesini ölçerken hasarlı, bitişik miyofibrillerin potansiyel kafa karıştırıcı etkileri olmadan aktin-miyozin etkileşimlerinin değerlendirilmesine olanak sağlar. Aşırı yapısal hasar ve miyofibrillerin yanlış hizalanması kasıldaş bozukluğuna neden olabilir. Miyofibrillerde yapısal hasar varsa, muhtemelen izolasyon işlemi sırasında veya deney sırasında kırılırlar. Ayrıca, miyofibrils çalışmaları sarcomeres geometrik kısıtlamalar varlığında aktin-miyozin etkileşimleri değerlendirilmesi sağlar. Örneğin, miyofibrils ölçümleri miyofibrillar disfonksiyon sarkoerik protein bir mutasyonun birincil etkisi olup olmadığını açıklayabilir. Buna ek olarak, kalsiyum çözeltileri veya bileşikleri ile perfüzyon miyofibril küçük çapı nedeniyle neredeyse anında. Bu da miyofibrilleri kuvvet üretimi sırasında aktivasyon ve gevşeme oranlarını ölçmek için son derece uygun hale getirir. Bu yazıda açıklanan protokol, bir piezo uzunluk motoru ve hızlı adım perfüzyon sistemi ile birleştiğinde, nano-Newton aralığındaki kuvvetleri ölçebilen bir Fabry-Pérot interferometre prensibine dayalı bir optik kuvvet sondası kullanır. Bu kurulum, yüksek çözünürlüklü kuvvet ölçümleri ile miyofibril mekaniğinin incelenmesini sağlar.

Giriş

Burlu kas hücreleri günlük yaşam aktiviteleri için vazgeçilmezdir. Ekstremite hareketi, solunum fonksiyonu ve kalbin pompalama hareketi kas hücreleri tarafından üretilen kuvvet güveniyor. İskelet kası, tek kas liflerinin demetleri içeren kas fasiküllerinden oluşur (Şekil 1A). Bu kas lifleri seri bağlı sarcomeres tarafından oluşturulan miyofibrils oluşur (Şekil 1B,D). Sarcomeres ince ve kalın filamentler içerir. Bunlar öncelikle sırasıyla aktin ve miyozin molekülzincirlerinden oluşur (Şekil 1B). Aktin-miyozin etkileşimleri kas kuvvet üreten kapasitesi sorumludur. Nebulin, aktin ve troponin T gibi sarkoerik proteinleri kodlayan genlerde mutasyonlar olan hastalar, kontraktil disfonksiyon nedeniyle kas güçsüzlüğü muzdarip1.

Kas kontraktilite kalitesi in vivo bütün kaslar in vitro motilite tahlilleri actin-miyozin etkileşimleri arasında değişen, organizasyonun çeşitli düzeylerde çalışılabilir. Son yıllarda, çeşitli araştırma grupları,bireysel myofibrils2,3,4,5,6,7,8,9,10sözleşme belirlemek için kurulumları geliştirdik . Bu kurulumlar, miyofibrilin kasılmasından kaynaklanan bir kantileverden (yani optik ışın sapması) lazer sapmasındaki değişikliklerin algılanmasına dayanır (ayrıntılar için bkz. Labuda ve ark.11). Myofibrils kontraktil fonksiyonu belirlenmesi bazı sınırlamalar (örneğin, miyofibrils upstream olan uyarma-daralma kaplin süreçlerinin dinamikleri eksik olmasına rağmen), bu yaklaşımın birden fazla avantajı vardır. Bunlar şunlardır: 1) sarcomeres geometrik kısıtlamaları varlığında aktin-miyozin etkileşimleri değerlendirmek için yeteneği; 2) hasarlı, bitişik miyofibrillerin potansiyel kafa karıştırıcı etkileri olmadan aktin-miyozin etkileşimlerini değerlendirme yeteneği (tek kas liflerinin kontraktilitesini ölçerken ultrayapısal hasar ve miyofibrillerin yanlış hizalanması kasılvesiyetin bozulmasına neden olabilir)(Şekil 1D); 3) miyofibrillerin küçük çapı (~1 μm, Şekil 2A)ve zar eksikliği sarcomeres içine neredeyse anında kalsiyum difüzyon için izin verir. Ayrıca, miyofibrillerde yapısal hasar varsa, muhtemelen izolasyonları sırasında veya deney sırasında kırılırlar. Bu nedenle, miyofibril kontraksiyonu değerlendirmek kas kasılmasının temel mekanizmalarını incelemek ve rahatsız edici aktin-miyozin etkileşimlerinin sarkoerik proteinlerdeki mutasyonların neden olduğu kas hastalığının birincil nedeni olup olmadığını anlamak için kullanılan zarif bir yöntemdir.

Bu protokol, nano-Newton çözünürlüğüne sahip bir kantil kuvvet sondası (yani Optiforce) içeren miyofibrillerin kontraktilliğini belirlemek için yeni geliştirilmiş bir kurulum sunar. Bu kuvvet sondası interferometri prensibine dayanır. İnterferometri nispeten sert kantilevers kullanımını sağlar. Bu, miyofibrilin izometrik kasılmaları yaklaşırken, kantilever çok az sapma ile kuvvet ölçmek mümkün kılar. Prob, insan denekler de dahil olmak üzere farklı kas biyopsilerinden izole edilmiş tek bir miyofibril tarafından üretilen düşük pasif ve aktif kuvvetlerin yüksek sinyal-gürültü oranı ile değerlendirilmesini sağlar. Bu kurulumda yer alan optik kantilkuvvet prob fabry-Pérot interferometre12dayanmaktadır. İnterfermetre, optik fiber ile bir ferrule üzerine monte edilmiş altın kaplı bir kantil arasındaki küçük yer değiştirmeleri algılar (Şekil 3). Optik fiber ve kantilever arasındaki boşluk Fabry-Pérot boşluğu denir. Miyofibrils prob ve piezo motor arasında iki tutkal kaplı cam montaj lifleri kullanılarak monte edilir. Miyofibril tarafından üretilen kuvvet matematiksel olarak interferometre verilerinden elde edilebilir. İnterferometri iki veya daha fazla dalganın (bu kurulumda üç ışık dalgası) süperpozisyonuna veya girişimine dayanır. 1,528.77-1.563.85 nm arasında dalga boyuna sahip lazer ışığı interferometreden yayılır ve optik fiber üzerinden gönderilir. Sondada, ışık yansıtılır 1) optik fiber ve ortam arasındaki arabirimde(Şekil 3A); 2) orta ve cantilever arayüzünde (Şekil 3B); ve 3) kantilever metal ve altın kaplama arasındaki arabirimde (Şekil 3C). A ve B arabirimindeki yansıma, sondanın batırıldığı ortamın kırılma indisi(n)bağlıdır. Üç üst üste yerleştirilmiş yansımadan oluşan ışık, interferometredeki bir fotodiyota geri döner. Fotodiyot, üç üst üste yerleştirilmiş yansımanın girişim deseninin sonucu olan ışığın yoğunluğunu ölçer. Bir miyofibril etkinleştirilerek veya gerilerek kontraktil kuvvet oluşturulduğunda, miyofibril kantilever çeker. Bu hareket kavite boyutunu(d) ve dolayısıyla, kavite sığan dalga boylarının sayısını değiştirir. Kantilever yansıyan ışık farklı bir faz alacaktır, farklı bir girişim deseni ile sonuçlanan. Fotodiyot, bu parazit desen yoğunluğu değişimini Volt'taki bir değişiklik olarak kaydeder. Daha sonra, miyofibril kuvvet üretimi bu değişiklikten hesaplanır, cantilever sertliği dikkate alınarak. Kuvvet probu, montaj iğnesinin ucunu iterek, kantilin serbest teslim ucuna, bir tartım ölçeğine karşı tartılarak, kantilin bükülmesini okumalazer13'ündalga boyunun bir katına eşit tutarak kalibre edilir. Bu nedenle, interferometri nano-Newton çözünürlüğü ile kuvvetlerin ölçümü için izin, mesafe küçük değişiklikleri tespit etmek için son derece hassas bir yöntemdir. Bu çözünürlük, yüksek sinyal-gürültü oranı ile miyofibrillar kuvvet üretiminin değerlendirilmesini sağlar. Geleneksel interferometri, ölçüm aralığını girişim eğrisinin doğrusal kısmına sınırlarken, kilitleyici amplifikatör ve lazer dalga boyu modülasyonu kullanılarak bu sınırlamanın üstesindengelin14. Bu tartışma bölümünde daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Miyofibril aktif gerilimi ölçmek için miyofibril'i kalsiyum çözeltilerine maruz bırakmak için hızlı adımlı bir perfüzyon sistemi kurulmuştur(Şekil 4A). Hızlı basamak perfüzyon sistemi, 10 ms içinde çözüm değişikliklerinin gerçekleşmesini sağlar. Küçük çapları nedeniyle miyofibrillere kalsiyum difüzyonu neredeyse anlıktır. Bu nedenle, bu sistem özellikle aktivasyon sırasında aktivasyon ve gevşeme sırasında serbest aktin-miyozin bağlanma oranlarını ölçmek için uygundur. Aktivasyon oranı (kACT)ve gevşeme (kREL)aktivasyon-gevşeme eğrilerinden belirlenebilir. Ayrıca, artan konsantrasyonun kalsiyum çözeltilerine miyofibriller maruz bırakılarak, kuvvet-kalsiyum ilişkisi ve kalsiyum duyarlılığı belirlenebilir.

Ayrıca, bir piezo uzunluğu motor hızlı germe ve miyofibril kısalma sağlar. Bu, miyofibrilin viskoelastik özelliklerini (yani pasif gerilim) inceleme ve gerilim inancını belirlemek için miyofibril'in hızlı bir kısalması ve yeniden gerilmesi (kTR)olanağı sunar. Hem aktif hem de pasif gerilim deneylerinden elde edilen parametreler sarkoerik proteindeki gen mutasyonları ile değiştirilebilir.

Bu özel yapım kurulum sağlıklı insan, hasta ve fare iskelet kas izole miyofibrils aktif ve pasif kontraktil özelliklerini ölçmek için kullanılmıştır.

Protokol

İnsan biyopsisi alınmasına yönelik protokol VU Üniversitesi Tıp Merkezi kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır (#2014/396) ve deneklerden yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Hayvan kas biyopsisi alma protokolü VU Üniversitesi yerel hayvan etik komitesi tarafından onaylandı (AVD114002016501)

1. Hazırlık ve miyofibril izolasyon

NOT: Biyopsigliserini gliserinlemek için daha önce açıklanan yöntemleri kullanın, farklı kalsiyum konsantrasyonu (pCa) çözeltilerini7,16,17olarak hazırlayın ve miyofibrilleri2,18.

  1. -80 °C'de saklanan rahatlatıcı (pCa 9.0, Rx) ve aktive (pCa 4.5, Act) çözeltilerinin yanı sıra inhibitörleri (1 M E64, 1 M DTT, 1 M leupeptin, 1 M PMSF) eritin.
  2. Yaklaşık 1 mm3'lük gliserinli kas biyopsisi alın ve 1:1 Rx/glycerol (v/v) çözeltisi ile küçük bir Petri kabına yerleştirin ve Petri kabını 4 °C'de soğuk bir tabağa yerleştirin.
  3. Diseksiyon mikroskobu ve forceps kullanarak kas parçası incelemek, kas parçası onları izole etmeden tek kas lifleri ayıran.
    NOT: Miyofibril süspansiyonun kontaminasyonunu önlemek için mümkün olduğunca yağlı ve bağ dokusunu çıkarın.
  4. İncelenen doku parçasını inhibitörlerle 1,5 mL rahatlatıcı çözelti (1 μL/mL E-64, 1 μL/mL lupeptin, 1 μL/mL DTT ve 125 μL/mL PMSF) ile 5 mL'lik bir tüpe aktarın. 1 saat boyunca yaklaşık 4 °C'de dokunun temperlemesine izin verin.
  5. Kuluçka sırasında, her iki bilgisayarın da önyüklemesini başlatın, aygıtları açın ve ilişkili yazılımı açın (bkz. Malzemeler Tablosu).
  6. Kuvvet sondasını bir Petri kabına ultra saf suya batırın ve sondayı kalibre edin.
    1. İnterbenmetredeki 'Başlat Sihirbazı'tuşuna basın ve ekrandaki yönergeleri izleyin. Kalibrasyon tuşunabastıktan sonra mikroskop aşamasına dokunun.
      NOT: Mikroskop aşamasına dokunmak, kantilin insaptamalardan sapmasını ve saçaklardan geçmesine neden olur. Bu, probun kalibrasyonedilmesini sağlar.
    2. Kalibrasyondan sonra sondayı Petri kabındaki ultra saf suya batırın.
  7. Piezo motor pozisyonunu başlangıç olarak tanıyın. Bunu yapmak için, aşağıda ayrıntılı adımlardan birini izleyin.
    1. Piezo motoru kTR gerilimi için kullanıldığında uzunluğu 0 μm olarak ayarlayın.
      Sinyal jeneratörü ayarlarını Tablo 1, Şekil 5A'dabulabilirsiniz.
    2. Piezo motoru pasif gerilim için kullanıldığında uzunluğu 50 μm'ye ayarlayın.
      Sinyal jeneratörü ayarları Tablo 1'debulunabilir.
      NOT: Adımlar arasındaki fark piezo uzunluk motorunun başlangıç konumudur. Myofibril germek için, piezo motor hem montaj iğneleri arasındaki mesafeyi artırmak ve miyofibril uzatmak için çekmek gerekir. Myofibril gevşetmek için, piezo motor hem montaj iğneleri arasındaki mesafeyi azaltmak ve miyofibril kısaltmak için itmek gerekir.
  8. Bir mikroskop slaytı hazırlayın. Pipet 150 μL polihidroksilmetakrilat (poli-HEMA) çözeltisi (%5 poli-HEMA in 95% etanol, w/v) mikroskop slaytı üzerinde ve tüm kaplı böylece slayt boyunca yayıldı.
    NOT: Kaplamasız bir mikroskop kaydırağıma miyofibril süspansiyon boruyla sürülürse, dibe batan miyofibriller mikroskop kaydırağına yapışır ve yapıştırmak mümkün olmayacaktır.
  9. Şırıngaları pCa çözeltileriyle doldurun (bkz. Şekil 4A)ve perfüzyon sistemini asal.
    NOT: Bu adımlarda tüm tüpler tüm hava kabarcıkları tüp kaldırılır emin olmak için uygun bir çözüm ile önceden doldurulur.
    1. Akış odası arka plan akışının(Şekil 3, 4A)girişini Rx ile doldurun.
    2. Kullanıldığında, hava kaldırmak için ultra saf su ile manifoldu yıkayın. Bunu yapmak için şırıngayı ultra saf suyla prizye bağlayın ve ters yönde temizleyin. Manifoldun kullanılmayan bağlantı noktalarını engelleyin.
    3. Her pCa şırıngap çözeltisi ile ilgili tüpleri doldurmak için etkinleştirin. Daha sonra, manifoldu ve cam ayarı bağlayın.
    4. Veri toplama paneli yazılımı ile 1 ve 6 no'lu vanaları açın (Bkz. Malzeme Tablosu)'1+6' (Şekil 6A) butonuna basarak Cam'ı rahatlatıcı (pCa 9.0) ve devreye alma (4.5) çözeltileri ve kapak çıkışları ile doldurun (Şekil 6B).

2. Bir miyofibril montaj

  1. Miyofibrillerin cama yapışmasını önlemek için poli-HEMA ile bir mikroskop kaydırağı katlayın.
  2. Doku homojenizasyonu için homogenizer'i (Bkz. Malzeme Tablosu)hazırlayın. İç rotor çubuğunu temiz mendil kağıdıyla temizleyin, homogenizer'i birleştirin ve 15 s alkol de 1x ve ultra saf suda 15'er s için üç kez döndürün. Rahatlatıcı çözeltide homogenizer'i 15 s buz için 1 kat önceden hazırlayın.
  3. Homogenizer çubuğunu, adım 1.4'te açıklandığı gibi kas dokusunu içeren tüpe yerleştirin ve tüpü buzda tutarken, kas dokusunu yırtmak ve miyofibril süspansiyon elde etmek için rotoru 5 hıza 15 s'lik bir şekilde döndürün.
  4. Pipet ~50 μL miyofibril süspansiyon ve doku banyosunda poli-HEMA ile kaplanmış mikroskop slayt üzerinde rahatlatıcı çözelti ~ 250 μL. Bu sıvı bir damla oluşturacaktır. Tozdan korunmak için banyoyu bir kapakla kapatın ve miyofibrillerin dibe batmasını sağlamak için 5-10 dakika bekleyin.
    NOT: Süspansiyon ve rahatlatıcı çözelti arasındaki oran izolasyon kalitesine bağlıdır, bu nedenle, buna göre ayarlayın. Örneğin, miyofibril verim düşükse ve süspansiyonda birkaç uygun miyofibril varsa, daha az rahatlatıcı çözeltiile daha fazla miyofibril süspansiyon ekleyin ve seyreltin (örneğin, 75 μL miyofibril süspansiyon ve 225 μL rahatlatıcı çözelti). Kalp ve iskelet kas dokusu nun striation desen nedeniyle tanımak kolaydır. 10x veya 40x nesnel kullanarak, bu desen de tek bir miyofibril görünür. Süspansiyonda başka bir doku varsa miyofibriller görsel olarak seçilebilir. Bir 5-10 dakika bekleyin atlayabilirsiniz. Ancak, bu bir miyofibril yapıştırma zorluğunu artırır.
  5. Tutkallı palto montaj iğneleri (shellac + etanol; 120 mg shellac 2 mL %70 etanol). Bunu yapmak için tutkalı 65 °C'de 30-60 s ve pipet ~6 μL'lik yeni bir kaplamasız cam kaydırakta ısıtın. Her montaj iğnesinin ucunu tutkala batırın ve bir tutkal tabakası görünene kadar tekrarlayın. Sonda ve piezo dikey mikromanipülörler ile mikroskop aşamasında doku banyosu yerleştirmek için yer açmak için yukarı taşıyın. Tutkal içeren cam slaytı çıkarın.
  6. Miyofibrils montaj
    1. Mikroskop aşamasında miyofibril süspansiyon içeren poli-HEMA ile kaplanmış mikroskop slayt ile doku banyosu yerleştirin. 40x hedefi ile uygun bir miyofibril bulmak için sahne kullanın. Gerekirse, hareket ve monte edilebilir bir konuma myofibril taşımak için doku banyosu döndürün.
      NOT: Yaklaşık 30 μm uzunluğunda görünür bir striation desen ile miyofibrils arayın. 3.1 ve 3.2.1 adımlarında ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, miyofibril yapıştırma önce uzunluk ve sarcomere uzunluğu kontrol etmek mümkündür. Bu kasılma sırasında kırmak olasıdır, çünkü yapıştırılmış myofibrils yapmayın.
    2. Akış odasını doku banyosundaki miyofibrilleri içeren sıvı damlasının hemen üzerine yerleştirin (adım 2.4'te kaydırak üzerine borulu) ve düşürün. Sıvı damlasına çarpmadan dur.
    3. Piezo montaj iğnesini indirin ve miyofibril'in alt ucuna bastırın. Miyofibril iğneye bağlı olup olmadığını kontrol etmek için hafifçe kaldırın.
    4. Sondanın montaj iğnesinin akış odasına dokunmadan dibe ulaşması için akış odasını yeterince düşürün.
    5. Miyofibril'in üst ucuna sondanın montaj iğnesini bastırın. Miyofibril iğneye bağlı olup olmadığını kontrol etmek için hafifçe kaldırın.
    6. Camın dibine dokunmadan odaklama yeteneğini kaybetmeden banyonun alt kısmından miyofibril'i kaldırın.

3. Denemenin başlatılması

  1. Sarcomere uzunluğunu ölçmek için mikromanipülörler, kamera ve sistem denetleyici yazılımını(Şekil 7A, Bkz. Malzeme Tablosu)kullanın. Miyofibrilin başlangıç sarcomere uzunluğunu 2,5 m'ye ayarlamak için piezo ve/veya kuvvet sondasını hareket ettirin.
    NOT: Sarcomere uzunluğu 2.5 m miyozin başları ve aktin arasında optimum örtüşme sağlar.
  2. Sistem denetleyici yazılımının gemi işlevini kullanarak miyofibril uzunluk ve genişliği ölçmek(Şekil 7B,C).
    NOT: Kamerayı döndürürken yatay ve/veya dikey olarak eğilebilir. Kameranın hizasını kontrol etmek için, kameranın döndürüldüğünü ve eğilmediğini doğrulamak için bir ruh seviyesi kullanılabilir.
    1. Mikroskop aşamasını kullanarak miyofibril'i video görüntüsünün ortasına yerleştirin.
    2. Miyofibril'in bir tarafından diğerine bir kare çizin. Uzunluk için, görüntü işleme kontrasta dayandığı için tutkal damlacıklarının(Şekil 2A)koyu kenarını kareye eklediğinden emin olun.
    3. Sistem denetleyici yazılımındaki verileri kaydetmeye başlayın (Bkz. Malzeme Tablosu) 'Başlat' tuşuna basarak ve 5 s'den sonra 'Duraklat'düğmesine basarak sistem denetleyici yazılım veri kaydını duraklatın. Uzunluk artık verilere kaydedilir.
    4. Genişlik için önce kamerayı 90° döndürün (Bkz. Malzeme Tablosu)ve sonra miyofibril'in kenarının kontrastını kullanın.
    5. 'Başlat ' tuşuna basarak sistem denetleyici yazılımındakiStartverileri kaydetmeye başlayın (Bkz. Malzeme Tablosu've 5 s'den sonra 'Duraklat' düğmesine basarak sistem denetleyici yazılım veri kaydını duraklatın. Genişlik artık verilere kaydedilir.
  3. Miyofibrilin aktif geriliminin belirlenmesi gerekiyorsa, perfüzyon kurulumunun kullanılması gerekir. Eğer öyleyse, adım 3.4 devam edin. Sadece pasif gerilim tespit edilirse, 3.4-4.1.3.7 adımlarını atlayın ve 4.2 adımda devam edin.
  4. Perfüzyon kurulumunu konumlandırın ve başlatın.
    NOT: Bu sadece aktif kuvvet üretimi için gereklidir. Pasif gerilim deneyleri yaparken adım 4.2'ye devam edin.
    1. Hızlı motor pozisyonunu 4 V(Şekil 5B)olarak ayarlayın.
    2. Standın sol alt köşesini masadaki bantla hizalamak için perfüzyon standını masanın üzerine kaydırın.
      NOT: Kuvvet sondasını veya piezo motorunu vurmamaya dikkat edin.
    3. Manipülatörü kullanarak camı kabaca göz göre konumlandırın.
    4. Merceğin etekini inceleve manipülatörü kullanarak bardağı miyofibril'e doğru dikkatlice hareket ettirin.
    5. Manipülatörü kullanarak camın üst kanalını miyofibril ile hizalayın ve hızlı bir adım atarak pozisyonu kontrol edin (sinyal jeneratörü ayarları Tablo 1'debulunabilir ) sistem denetleyici yazılımı ile(Şekil 2B–C, bkz. Malzeme Tablosu).
      NOT: Hızlı adımın aktivasyon aşamasında alt kanalın miyofibril ile hizalandığından emin olun (Şekil 2B–C).
  5. Akış odasında laminar bir arka plan akışı oluşturmak için Rx 'in(Şekil 4A)arka plan akışını açın.
    NOT: PCa çözeltisi akışı sonucu oluşan türbülanslı akışı önlemek için arka plan akışı gereklidir.
    1. Luer valf kolu ile akış odasıgirişini açın.
      1. Akış odasının drenajını başlatmak ve akış odasının taşmasını önlemek için aşağıdaki parametreleri çıkış pompasına gönderin (Şekil 9): Vana = Banyo valfi (2); Microstep modu = Mikro; Piston hedefi = 48.000; Piston hızı = 38-40 (keyfi).
        NOT: Sıvı seviyesinin her zaman sabit olduğundan emin olun. Miyofibril kuru çalışmamalı ve kantilever de çalışmamalıdır. Çok az akış daha biraz taşma olması daha iyidir.
  6. Termoelektrik sıcaklık denetleyicisi ile sıcaklığı istenilen değere ayarlamak için(Şekil 8, bkz. Malzemeler Tablosu),istenilen ısıyı girin ve 'Başlat' tuşuna basın. Termoelektrik sıcaklık kontrol yazılımındaki grafiği kontrol ederek istenilen sıcaklığa ulaşınve devam edin.
    NOT: Oda sıcaklığında deneyler yaparken termoelektrik sıcaklık denetleyicisinin kullanılması gerekmez.

4. Deneysel protokol(ler)

  1. Hangi etkin kuvvet protokollerinin gerçekleştirileceğine karar verin.
    NOT: Çalışma için gerekli verilere bağlı olarak, birden fazla türde aktif kuvvet deneyi yapılabilir: adım 4.1.1, doyması gereken maksimum kuvvetin ölçümü [Ca2+]; adım 4.1.2, adım 4.1.1 ek olarak kalsiyum hassasiyetini belirlemek için bir Kuvvet-pCa eğrisi elde; adım 4.1.1 veya 4.1.2 ek olarak bir kısaltma-restretch protokolü yaparak gerilim yeniden geliştirme oranını belirleme.
    1. Maksimum aktif kuvveti ölçün.
      1. 'Başlat' tuşuna basarak verileri sistem denetleyici yazılımına kaydetmeye başlayın (bkz. Malzemeler Tablosu).
      2. Veri toplama paneli ile 1 ve 6 no'lu vanaları açın (Bkz. Malzeme Tablosu) yazılımı '1+6' tuşuna basarak rahatlatıcı çözeltinin cam akışını başlatmak ve çözeltiyi Aktive etmek IçinŞekil 6A).
      3. Interferometrenin aralığını, interferometreüzerinde'Sıfırlama Aralığı'seçeneğini belirleyerek ve basarak temel kuvvetin 0 V olması için sıfırla (Bkz. Malzeme Tablosu).
      4. Kuvvet izi sabit olduğunda, Cam-cam hızlı adımını (adım boyutu = 100 μm) gerçekleştirin.
        Sinyal jeneratörü ayarları Tablo 1'de bulunabilir (Şekil 5C). Şekil 4D'ye benzer bir aktivasyon-gevşeme izi sistem denetleyici yazılımında kaydedilir ve görünür.
      5. 'Duraklat' düğmesine basarak sistem denetleyici yazılım veri kaydını duraklatın.
      6. Daha fazla aktivasyon yapılmayacaksa, '1+6' (Şekil 6B)düğmesini kontrol ederek cam akışını durdurmak için 1 ve 6 numaralı kapakları kapatın, şırınga pompasını durdurun (Şekil 9, Malzeme Tablosu'nabakınız ) 'Sonlandırma' tuşuna basarak, Ve Luer vanasını kapatarak arka plan akışını durdurun.
    2. Kuvvet-pCa eğrisi
      NOT: Bu, maksimal etkin kuvveti elde etmek için 4.1.1 adıma benzer, ancak farklı pCa çözümleri kullanılarak birden fazla etkinleştirme ile.
      1. 'Başlat'tuşuna basarak verileri sistem denetleyici yazılımında kaydetmeye başlayın.
      2. Açık vanalar 1 ve 2 veri toplama paneli yazılımı ile rahatlatıcı çözüm akışını başlatmak ve pCa 6.2 ile Cam-cam.
      3. Interferometrenin menzilini sıfırlayarak temel kuvvetin interferometrede'Sıfırlama Aralığı'tuşuna basarak 0 V'dir.
      4. Kuvvet izi sabit olduğunda, Cam-cam hızlı adımını (adım boyutu = 100 μm) gerçekleştirin.
        Sinyal jeneratörü ayarları Tablo 1'debulunabilir.
      5. 'Duraklat'düğmesine basarak sistem denetleyici yazılımını duraklatın.
      6. 1 ve 3 (pCa 5.8), 1 ve 4 (pCa 5.6), 1 ve 5 (pCa 5.4) valfler ve 1 ve 6 (pCa 4.5) valfleri için 4.1.2.1-4.1.2.4 adımlarını tekrarlayın.
      7. Daha fazla aktivasyon yapılmayacaksa, '1+6' (Şekil 6A)düğmesini kontrol ederek cam akışını durdurmak için 1 ve 6 numaralı kapakları kapatın, 'Sonlandırma' tuşuna basarak şırınga pompasınıdurdurunve Luer valfini kapatarak arka plan akışını durdurun.
    3. Gerilim inkişa sı (kTR)ölçüm hızı.
      NOT: Bu, maksimal aktif kuvvet için 4.1.1 adımına benzer, ancak bazı değişiklikler ve eklenen adımlarla birlikte.
      1. Miyofibril%15'i gevşetmek için gerekli piezo hareketini hesaplayın ve bu değeri sinyal jeneratörüne girin (Şekil 5D, Tablo 1).
      2. 'Başlat' tuşuna basarak verileri sistem denetleyici yazılımında kaydetmeye başlayın.
      3. Veri toplama paneli(Şekil 6A)ile açık vanalar ( Şekil 6A ) yazılımı ile rahatlatıcı çözeltinin akışını başlatmak ve pCa 4.5'i camdan geçirin.
      4. Interferometrenin menzilini sıfırlayarak temel kuvvetin interferometrede'Sıfırlama Aralığı'tuşuna basarak 0 V'dir.
      5. Kuvvet izi sabit olduğunda, Cam-cam hızlı adımını (adım boyutu = 100 μm) gerçekleştirin.
        Sinyal jeneratörü ayarları Tablo 1'debulunabilir.
      6. Kuvvet platosu ulaşıldığında, piezo ile kısaltma-restretch gerçekleştirin.
        Sinyal jeneratörü ayarlarını (Şekil 5D, Tablo 1) bulunabilir. Şekil 4E'ye benzer bir aktivasyon-gevşeme izi sistem denetleyici yazılımında kaydedilir ve görünür hale gelir.
        NOT: Yukarıdaki adımları otomatikleştirmek için özel bir protokol yapılabilir.
      7. 'Duraklat'düğmesine basarak sistem denetleyici yazılımını duraklatın.
      8. Daha fazla aktivasyon yapılmayacaksa, '1+6' (Şekil 6B)düğmesinin kontrolünü açarak cam akışını durdurmak için 1 ve 6 numaralı kapakları kapatın, 'Sonlandırma' tuşuna basarak şırınga pompasınıdurdurunve Luer valfini kapatarak arka plan akışını durdurun.
  2. Pasif kuvvet ölçümleri yapın.
    1. Sürekli bir esneme gerçekleştirin.
      1. Miyofibril'i germek ve bu değeri sinyal jeneratörüne girmek için gerekli piezo hareketini hesaplayın(Tablo 1).
        NOT: Bunlar örnek ayarlardır. Sarcomere uzunluğuna göre streç ve streç süresini hesaplayın. Bu ayarlar, sarcomere başına germe hızının myofibrils boyunca eşit kalmasını sağlamak için gereklidir.
      2. 'Başlat' tuşuna basarak verileri sistem denetleyici yazılımında kaydetmeye başlayın.
      3. Interferometrenin menzilini sıfırlayarak temel kuvvetin interferometrede'Sıfırlama Aralığı'tuşuna basarak 0 V'dir.
      4. Piezo çalıştırmak için sistem denetleyici yazılımı sinyal jeneratörü ile sürekli streç gerçekleştirin. Örnek sinyal jeneratörü ayarları Tablo 1'debulunabilir.
      5. Streç bittikten sonra piezo ile bolluk uzunluğu namına myofibril kısaltmak(Tablo 1).
    2. Adım adım esneme gerçekleştirin.
      1. 'Başlat' tuşuna basarak verileri sistem denetleyici yazılımında kaydetmeye başlayın.
      2. Interferometrenin menzilini sıfırlayarak temel kuvvetin interferometrede'Sıfırlama Aralığı'tuşuna basarak 0 V'dir.
      3. Piezo çalıştırmak için sistem denetleyici yazılımı sinyal jeneratörü ile adım adım germe gerçekleştirin. Örnek sinyal jeneratörü ayarları Tablo 1'de bulunabilir (Şekil 5E).
    3. Streç bittikten sonra piezo ile bolluk uzunluğu için myofibril kısaltmak. Örnek sinyal jeneratörü ayarları Tablo 1'debulunabilir.
  3. 'Duraklat'düğmesine basarak sistem denetleyici yazılımını duraklatın.
  4. Sistem denetleyici yazılımındaki 'Durdur' düğmesine basarak verilerin kaydını durdurun.
  5. Sistem denetleyici yazılımında 'Dosya' ve 'Verileri Kaydet' tuşuna basarak verileri kaydedin.

5. Temizlik

  1. Ölçülen miyofibril çıkarın ve bir sonraki miyofibril için hazırlayın.
    1. Bunu yapmak için, dikkatle 40x hedefi ile oküler ile bakarken miyofibril yırtmak.
    2. Kuvvet sondasını ve piezo'yu yukarı taşıyın. Camdan yukarı, sağa ve arkaya doğru hareket edin. Sonra yukarı hareket edin ve akış odası uzak slayt. Doku banyosunu çıkarın.
    3. Montaj iğnetemizlemek için, 10x ve oküler kullanarak odak haline getirmek. Fırçayı etanole batırın ve dikkatlice fırçalayın ve yapıştırıcıyı iğneden çıkarın.
      NOT: Yapıştırıcının çıkmasının biraz zaman alacağını unutmayın.
    4. Akış odasını ve doku banyosunu ultra saf suyla durulayın.
    5. Sondayı ultra saf suyla dolu küçük bir Petri kabına yerleştirin. Sondanın tamamen dolduğundan emin olun.
  2. Denemeler tamamlandığında, kurulumu yukarıdaki gibi temizleyin ve aşağıdaki ek adımları gerçekleştirin.
    1. Tüpleri akış banyosundan boşaltın. Parametreleri çıkış şırınga pompasına gönderin (bkz. Malzeme Tablosu, Şekil 9). Vana = Banyo valfi (2); Microstep modu = Normal; Piston hedefi = 0; Piston hızı = 30.
      NOT: Tüp boşolduğunda komutu sonlandırın.
    2. Pompayı birkaç kez başlatma(Şekil 9B).
    3. Şırıngaları boşaltın. Bunu yapmak için, tüm Luer vanaları kapatın, tüm vanaları açın, şırınga nın iğnesinden boruyu çıkarın, iğnenin altında belirli pCa tüpünü tutun ve Luer valfini açın. İşlemi hızlandırmak için basınç fişlerini kullanın.
    4. Tüpü şırınganın iğnesine yeniden takın. Şırıngaları ~5 mL ultra saf su ile doldurun. Bardağın altına bir bardak yerleştirin. Tüm vanaları açın ve sistemi yıkamak için basınç valfini açın.
    5. Sistemi kapatın. Bilgisayarı, interferometreyi ve piezo denetleyici güç bloğunu kapatın.

6. Veri analizi

  1. Veri izlemelerini sistem denetleyici yazılımından (bkz. Malzeme Tablosuna)veri dosyasını açarak ve istenen segmenti seçerek bir elektronik tablo yazılım programına veya panosuna aktarın. Gösterilen izler ihraç edilecektir (örneğin, ham kuvvet, sarcomere uzunluğu ve piezo pozisyonu).
  2. Tercih edilen yazılımla (örneğin, MATLAB) analiz yapın.

Sonuçlar

Veri izleri sistem denetleyici yazılımı ile kaydedildi ve açıldı (bkz. Malzemeler Tablosu). Tam izlemeler veya seçili segmentler, istenen bir yazılımla daha fazla analiz edilmek üzere panoya veya metin dosyasına aktarıldı. Farklı çözümlerin akışını kontrol etmek için vanalar özel yazılım veya manuel olarak değiştirildi. Etkinleştirme, gerilim yeniden geliştirme ve gevşeme oranlarını analiz etmek için özel bir MATLAB komut dosyası kullanılmıştır. Pasif kuvvet deneyle...

Tartışmalar

Açıklanan insan veya hayvan iskelet kas dokularından izole miyofibrils kontraktil fonksiyondeğerlendirmek için bir protokoldür. Bu kurulumun kuvvet çözünürlüğü daha önce Chavan ve ark.12tarafından tanımlanmıştır. Kısacası, algılama lifi ile kantil arasında oluşan Fabry-Pérot boşluğunun uzunluğundaki rastgele dalgalanmalar tarafından belirlenir, bu da okuma çıkışındaki gürültünün baskın kısmını (V ile ifade edilir) oluşturur, sapma hassasiyeti (m/V ile ifa...

Açıklamalar

Michiel Helmes, IONOptix Inc.'in hissedarı ve ortağıdır.

Teşekkürler

Bu proje AFM-Telethon ve Nemaline Myopathies için A Vakfı Yapı Gücü tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar bu makalede belirtilen ürünlerin yaratıcısı kabul etmek istiyorum, IONOptix Inc.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Bio Spec Products, Inc.985370-XLTo isolate myofibrils
Custom codedMatlab
Custom fabricatedIncludes Labview program to control over serial connection; To control valves
Custom fabricatedTo cool the Peltier module
Custom fabricated
Custom fabricatedAluminum tissue chamber
Custom fabricatedTo control the valves; Includes PC software to control over USB
IonOptixSystem controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step
IonOptixMCS100To record sarcomere length
IonOptixIncludes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher
IonOptixForce probe
KoolanceADT-EX004S
KoolanceEX2-755To cool the Peltier module
MicrosoftData registration
OlympusIX71
OlympusTH4-200
Sigma-Aldrich529265Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue
Sigma-Aldrich78471Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue
TE Technology, Inc.TE-63-1.0-1.3To cool the tissue flow chamber
TE Technology, Inc.TC-720Includes PC software to control over USB
Tecan Trading AG20736652
Tecan Trading AG20739263Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber
Thermo scientific2441081
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)DiscontinuedAlternative: SF-77CST/VCS-77CSP
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)TG150-4To perfuse the tissue
1 PC for IonWizard and 1 PC for other software

Referanslar

  1. Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
  2. Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).
  3. Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
  4. Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, 127-135 (2002).
  5. Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
  6. Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
  7. Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
  8. de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
  9. Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
  10. Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
  11. Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).
  12. Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).
  13. Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
  14. van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
  15. Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
  16. Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
  17. Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
  18. Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
  19. Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
  20. Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
  21. Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 159iskelet kassarcomere kinetikmiyofibril mekani ikontraktillikkalsiyumcantilever nano Newton kuvvet sondas

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır