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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Bewertung der kontraktilen Eigenschaften von gestreiften Muskelmyofibrils mit Nano-Newton-Auflösung vorgestellt. Das Protokoll verwendet ein Setup mit einer Interferometrie-basierten optischen Kraftsonde. Dieses Setup erzeugt Daten mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis und ermöglicht die Beurteilung der kontraktilen Kinetik von Myofibrils.

Zusammenfassung

Gestreifte Muskelzellen sind für die Aktivität von Mensch und Tier unverzichtbar. Einzelne Muskelfasern bestehen aus Myofibrillen, die aus seriell verbundenen Sarkomen bestehen, den kleinsten kontraktilen Einheiten im Muskel. Sarkomische Dysfunktion trägt zur Muskelschwäche bei Patienten mit Mutationen in Genen bei, die für sarkomerische Proteine kodieren. Die Untersuchung der Myofibril-Mechanik ermöglicht die Beurteilung von Actin-Myosin-Wechselwirkungen ohne mögliche verwirrende Auswirkungen von beschädigten, benachbarten Myofibrils bei der Messung der Kontraktilität einzelner Muskelfasern. Ultrastrukturelle Schäden und Fehlausrichtung von Myofibrils können zu einer beeinträchtigungen Kontraktilität beitragen. Wenn strukturelle Schäden in den Myofibrils vorhanden sind, brechen sie wahrscheinlich während des Isolationsverfahrens oder während des Experiments. Darüber hinaus liefern Studien an Myofibrils die Beurteilung von Actin-Myosin-Wechselwirkungen in Gegenwart der geometrischen Zwänge der Sarkome. Beispielsweise können Messungen in Myofibrils klären, ob myofibrillare Dysfunktion die primäre Wirkung einer Mutation in einem sarkomischen Protein ist. Darüber hinaus ist die Perfusion mit Calciumlösungen oder Verbindungen aufgrund des geringen Durchmessers des Myofibrils fast sofort. Dies macht myofibrils hervorragend geeignet, um die Aktivierungs- und Entspannungsraten während der Kraftproduktion zu messen. Das in diesem Papier beschriebene Protokoll verwendet eine optische Kraftsonde, die auf dem Prinzip eines Fabry-Pérot-Interferometers basiert, das kräfte im Nano-Newton-Bereich messen kann, gekoppelt an einen Piezolängenmotor und ein Schnellschritt-Perfusionssystem. Dieses Setup ermöglicht das Studium der myofibril Mechanik mit hochauflösenden Kraftmessungen.

Einleitung

Gestreifte Muskelzellen sind für den Alltag unverzichtbar. Die Bewegung der Gliedmaßen, die Atemfunktion und die Pumpbewegung des Herzens verlassen sich auf die Kraft, die von Muskelzellen erzeugt wird. Skelettmuskel besteht aus Muskelfascicles, die Bündel von einzelnen Muskelfasern enthalten (Abbildung 1A). Diese Muskelfasern bestehen aus Myofibrillen, die durch seriell verknüpfte Sarkome gebildet werden (Abbildung 1B,D). Die Sarkome enthalten dünne und dicke Filamente. Diese bestehen in erster Linie aus Ketten von Aktin- bzw. Myosinmolekülen (Abbildung 1B). Actin-Myosin-Wechselwirkungen sind verantwortlich für die krafterzeugende Kapazität der Muskeln. Patienten mit Mutationen in Genen, die für sarmere Proteine wie Nebulin, Actin und Troponin T kodieren, leiden an Muskelschwäche aufgrund kontraktiler Dysfunktion1.

Die Qualität der Muskelkontraktilität kann auf verschiedenen Ebenen der Organisation untersucht werden, von in vivo ganze Muskeln zu Actin-Myosin-Wechselwirkungen in In-vitro-Motilität assays. In den letzten Jahrzehnten haben mehrere Forschungsgruppen Setups entwickelt, um die Kontraktilität einzelner Myofibrils2,3,4,5,6,7,8,9,,10zu bestimmen. Diese Setups basieren auf der Detektion von Veränderungen der Laserablenkung durch einen Ausleger (d.h. optische Strahlverformung), die durch die Kontraktion des Myofibrils verursacht wird (Details siehe Labuda et al.11). Obwohl die Bestimmung der kontraktilen Funktion von Myofibrils einige Einschränkungen aufweist (z.B. fehlt die Dynamik der Anregungs-Kontraktions-Kopplungsprozesse, die vor den Myofibrils liegen), gibt es mehrere Vorteile für diesen Ansatz. Dazu gehören: 1) die Fähigkeit, Actin-Myosin-Wechselwirkungen in Gegenwart der geometrischen Abhängigkeiten der Sarkome zu bewerten; 2) die Fähigkeit, Actin-Myosin-Wechselwirkungen ohne mögliche verwirrende Auswirkungen von beschädigten, benachbarten Myofibrils zu bewerten (bei der Messung der Kontraktilität von einzelnen Muskelfasern ultrastrukturelle Schäden und Fehlausrichtung von Myofibrils könnte zu einer beeinträchtigten Kontraktilität beitragen) (Abbildung 1D); 3) der kleine Durchmesser von Myofibrils (1 m, Abbildung 2A) und der Mangel an Membranen ermöglichen eine fast sofortige Calciumdiffusion in die Sarkome. Wenn strukturelle Schäden in den Myofibrils vorhanden sind, brechen sie wahrscheinlich während ihrer Isolation oder während des Experiments. Daher ist die Beurteilung der myofibrilKontraktilität eine elegante Methode, um die grundlegenden Mechanismen der Muskelkontraktion zu studieren und zu verstehen, ob gestörte Actin-Myosin-Wechselwirkungen die primäre Ursache für Muskelerkrankungen sind, die durch Mutationen in sarkomerischen Proteinen verursacht werden.

Dieses Protokoll stellt ein neu entwickeltes Setup dar, um die Kontraktilität von Myofibrils zu bestimmen, die eine Freischwinger-Kraftsonde mit Nano-Newton-Auflösung (d. h. Optiforce) enthalten. Diese Kraftsonde basiert auf dem Prinzip der Interferometrie. Die Interferometrie ermöglicht die Verwendung relativ steifer Ausleger. Dies macht es möglich, Kraft mit wenig Ablenkung des Auslegers zu messen, nähern sich isometrischen Kontraktionen des Myofibrils. Die Sonde ermöglicht die Beurteilung niedriger passiver und aktiver Kräfte, die von einem einzelnen Myofibril erzeugt werden, das aus verschiedenen Muskelbiopsien, einschließlich von Menschen, mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis isoliert wird. Die in diesem Setup integrierte optische Auslegerkraftsonde basiert auf einem Fabry-Pérot Interferometer12. Das Interferometer erkennt kleine Verschiebungen zwischen einer Glasfaser und einem goldbeschichteten Ausleger, der auf einer Ferrule montiert ist (Abbildung 3). Der Spalt zwischen der Glasfaser und dem Ausleger wird Fabry-Pérot Hohlraum genannt. Myofibrils werden zwischen Sonde und Piezomotor mit zwei leimbeschichteten Glasfasern montiert. Die vom Myofibril erzeugte Kraft kann mathematisch aus den Interferometerdaten abgeleitet werden. Die Interferometrie basiert auf der Überlagerung oder Interferenz von zwei oder mehr Wellen (in diesem Setup drei Lichtwellen). Laserlicht mit einer Wellenlänge zwischen 1.528,77–1.563,85 nm wird vom Interferometer emittiert und durch die Optische Faser gesendet. In der Sonde wird das Licht 1) an der Schnittstelle zwischen der Optischen Faser und dem Medium reflektiert (Abbildung 3A); 2) an der Schnittstelle des Mediums und des Auslegers (Abbildung 3B); und 3) an der Schnittstelle zwischen der Metall- und Goldbeschichtung des Auslegers (Abbildung 3C). Die Reflexion an den Schnittstellen A und B ist abhängig vom Brechungsindex (n) des Mediums, in das die Sonde eingetaucht ist. Das Licht, bestehend aus den drei überlagerten Reflexionen, kehrt zu einer Photodiode im Interferometer zurück. Die Photodiode misst die Intensität des Lichts, die das Ergebnis des Interferenzmusters der drei überlagerten Reflexionen ist. Wenn kontraktile Kraft durch Aktivieren oder Dehnen eines Myofibril erzeugt wird, zieht das Myofibril auf den Ausleger. Diese Bewegung ändert die Hohlraumgröße(d) und damit die Anzahl der Wellenlängen, die in den Hohlraum passen. Das licht reflektiert am Ausleger hat eine andere Phase, was zu einem anderen Interferenzmuster führt. Die Photodiode zeichnet diese Änderung der Interferenzmusterintensität als Eine Änderung der Volt auf. Anschließend wird aus dieser Änderung die Myofibril-Krafterzeugung unter Berücksichtigung der Auslegersteifigkeit berechnet. Die Kraftsonde wird vom Hersteller kalibriert, indem die Spitze der Montagenadel, die am freien Handende des Auslegers befestigt ist, gegen eine Waage gedrückt wird, während die Biegung des Auslegers einem Vielfachen der Wellenlänge des Ausleselasers13entspricht. Daher ist die Interferometrie eine hochempfindliche Methode, um kleine Entfernungsänderungen zu erkennen, die eine Messung von Kräften mit Nano-Newton-Auflösung ermöglichen. Diese Auflösung ermöglicht die Beurteilung der myofibrillaren Kraftproduktion mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Während die traditionelle Interferometrie den Messbereich auf den linearen Teil der Interferenzkurve begrenzt, überwindet die Verwendung eines Einsperrverstärkers und die Modulation der Laserwellenlänge diese Einschränkung14. Dies wird im Diskussionsteil ausführlicher erläutert.

Um die myofibril aktive Spannung zu messen, wurde ein schnelles Perfusionssystem eingebaut, um das Myofibril Calciumlösungen auszusetzen (Abbildung 4A). Das schnelle Perfusionssystem ermöglicht Lösungsänderungen innerhalb von 10 ms. Aufgrund ihres geringen Durchmessers ist die Kalziumdiffusion in die Myofibrils fast augenblicklich. Daher eignet sich dieses System besonders zur Messung der Aktin-Myosin-Bindungsraten während der Aktivierung und Freisetzung während der Entspannung. Die Aktivierungsrate (kACT) und Entspannung (kREL) kann aus den Aktivierungs-Entspannungskurven bestimmt werden. Auch durch die Exposition der Myofibrils gegenüber Kalziumlösungen mit steigender Konzentration kann die Kraft-Calcium-Beziehung und Kalziumempfindlichkeit bestimmt werden.

Darüber hinaus ermöglicht ein Piezolängenmotor eine schnelle Dehnung und Verkürzung des Myofibrils. Dies bietet die Möglichkeit, die viskoelastischen Eigenschaften (d.h. passive Spannung) des Myofibrils zu untersuchen, sowie eine schnelle Verkürzung und Redehnung des Myofibrils durchzuführen, um die Spannungsrate der Neuentwicklung (kTR) zu bestimmen. Die Parameter, die sowohl aus aktiven als auch aus passiven Spannungsexperimenten gewonnen werden, können durch Genmutationen in einem sarkomischen Protein verändert werden.

Diese maßgeschneiderte Einrichtung wurde verwendet, um die aktiven und passiven kontraktilen Eigenschaften von Myofibrils zu messen, die aus gesunden menschlichen, geduldigen und Mausskelettmuskeln isoliert sind.

Protokoll

Das Protokoll zur Erlangung menschlicher Biopsien wurde vom institutionellen Prüfungsausschuss des VU University Medical Center (#2014/396) genehmigt und die schriftliche Zustimmung der Probanden in Kenntnis der Sachlage eingeholt. Das Protokoll zur Gewinnung von Tiermuskelbiopsien wurde von der lokalen Tierethikkommission der VU-Universität (AVD114002016501) genehmigt.

1. Vorbereitung und myofibril Isolation

HINWEIS: Verwenden Sie zuvor beschriebene Methoden, um Biopsien zu glycerinisieren, die verschiedenen Calciumkonzentrationslösungen (pCa)7,16,17, vorzubereiten und Myofibrils2,18zu isolieren.

  1. Die entspannenden (pCa 9.0, Rx) und aktivierenden (pCa 4.5, Act) Lösungen sowie die Inhibitoren (1 M E64, 1 M DTT, 1 M Leupeptin, 1 M PMSF), die bei -80 °C gelagert werden, auftauen.
  2. Nehmen Sie ein zerglyzeriniertes Stück gestreifte Muskelbiopsie von ca. 1 mm3 und legen Sie es in eine kleine Petrischale mit 1:1 Rx/Glycerin (v/v) Lösung und legen Sie die Petrischale auf eine kalte Platte bei 4 °C.
  3. Sezieren Sie das Muskelstück mit Seziermikroskop und Zangen, trennen einzelne Muskelfasern, ohne sie vom Muskelstück zu isolieren.
    HINWEIS: Entfernen Sie so viel Fett- und Bindegewebe wie möglich, um eine Kontamination der MyofibrilSuspension zu verhindern.
  4. Übertragen Sie das Stück des sezierten Gewebes in ein 5 ml-Rohr mit 1,5 ml Entspannungslösung mit Inhibitoren (1 l/ml E-64, 1 l/ml Leupeptin, 1 L/ml/ml DTT und 125 l/ml PMSF). Lassen Sie das Gewebe bei ca. 4 °C für 1 h temperieren.
  5. Starten Sie während der Inkubation beide PCs hoch, schalten Sie die Geräte ein, und öffnen Sie die zugehörige Software (siehe Tabelle der Materialien).
  6. Untertauchen Sie die Kraftsonde in Reinstwasser in eine Petrischale und kalibrieren Sie die Sonde.
    1. Drücken Sie den 'Start-Assistent' auf dem Interferometer und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm. Tippen Sie nach dem Drücken von Kalibrierenauf die Mikroskopstufe.
      HINWEIS: Das Tippen auf die Mikroskopstufe führt dazu, dass der Ausleger abgelenkt wird und durch Fransen geht. Dies ermöglicht die Kalibrierung der Sonde.
    2. Lassen Sie die Sonde nach der Kalibrierung in das Reinstwasser in der Petrischale eintauchen.
  7. Initialisieren Sie die Piezomotorposition. Führen Sie dazu einen der unten aufgeführten Schritte aus.
    1. Wenn der Piezomotor für kTR-Spannung verwendet wird, stellen Sie die Länge auf 0 m ein.
      Die Einstellungen für den Signalgenerator finden Sie in Tabelle 1, Abbildung 5A.
    2. Wenn der Piezomotor für passive Spannung verwendet wird, stellen Sie die Länge auf 50 m ein.
      Die Einstellungen für den Signalgenerator finden Sie in Tabelle 1.
      HINWEIS: Der Unterschied zwischen den Schritten ist die Ausgangsposition des Piezolängenmotors. Um die Myofibril zu dehnen, muss der Piezomotor ziehen, um den Abstand zwischen beiden Befestigungsnadeln zu erhöhen und die Myofibril zu verlängern. Um das Myofibril zu lockern, muss der Piezomotor drücken, um den Abstand zwischen beiden Befestigungsnadeln zu verringern und die Myofibril zu verkürzen.
  8. Bereiten Sie ein Mikroskopschlitten vor. Pipette 150 l Polyhydroxyethylmethacrylat (Poly-HEMA) Lösung (5% Poly-HEMA in 95% Ethanol, w/v) auf einem Mikroskopschlitten und verteilen Sie es über den Schlitten, so dass es alles abgedeckt ist.
    HINWEIS: Wenn eine myofibril Suspension auf einem unbeschichteten Mikroskopschlitten gepipetiert wird, kleben die Myofibrils, die nach unten sinken, am Mikroskopschlitten und es ist nicht möglich, sie zu kleben.
  9. Füllen Sie Spritzen mit pCa-Lösungen (siehe Abbildung 4A) und grunden Sie das Perfusionssystem.
    HINWEIS: In diesen Schritten werden alle Rohre mit der entsprechenden Lösung vorgefüllt, um sicherzustellen, dass alle Luftblasen aus dem Schlauch entfernt werden.
    1. Füllen Sie den Zuflussschlauch des Strömungskammerhintergrundstroms (Abbildung 3, 4A) mit Rx.
    2. Bei Verwendung spülen Sie den Verteiler mit reinem Reinstwasser, um Luft zu entfernen. Schließen Sie dazu die Spritze mit Reinstwasser an den Auslass an und spülen Sie sie in umgekehrter Richtung ein. Blockieren Sie die ungenutzten Anschlüsse des Verteilers.
    3. Ermöglichen Sie jeder pCa-Spritze, ihre jeweiligen Schläuche mit pCa-Lösung zu füllen. Verbinden Sie sie dann mit dem Verteiler und dem Glas.
    4. Öffnen Sie die Ventile 1 und 6 mit der Datenerfassungspanel-Software (siehe Tabelle der Materialien), indem Sie die Taste '1+6' (Abbildung 6A) überprüfen, um das Glas mit den entspannenden (pCa 9.0) und aktivierenden (4.5) Lösungen zu füllen und Ventile zu schließen, wenn das Glas gefüllt ist (Abbildung 6B).

2. Montage eines Myofibrils

  1. Mantel Sie ein Mikroskop-Dia mit Poly-HEMA, um zu verhindern, dass Myofibrils am Glas kleben.
  2. Bereiten Sie den Homogenisator (siehe Materialtabelle) auf die Gewebehomogenisierung vor. Reinigen Sie den inneren Rotorstab mit sauberem Gewebepapier, montieren Sie den Homogenisator und drehen Sie 1x für 15 s Alkohol und dreimal für 15 s in Reinstwasser. Prerinse den Homogenisator in Entspannungslösung 1 x für 15 s auf Eis.
  3. Legen Sie die Homogenisatorstange in das Rohr, die das Muskelgewebe enthält, wie in Schritt 1.4 beschrieben, und drehen Sie den Rotor, während Sie das Rohr auf Eis halten, den Rotor für 15 s auf Geschwindigkeit 5, um das Muskelgewebe zu reißen und eine myofibril Suspension zu erhalten.
  4. Pipette 50 l der myofibril Suspension und 250 l der Entspannungslösung auf dem Mikroskopschlitten, der mit Poly-HEMA im Gewebebad beschichtet ist. Dies bildet einen flüssigen Tropfen. Bedecken Sie das Bad mit einem Deckel, um vor Staub zu schützen und warten Sie 5–10 min, damit die Myofibrils auf den Boden sinken.
    ANMERKUNG: Das Verhältnis zwischen der Suspension und der Entspannungslösung hängt von der Qualität der Isolierung ab, daher passen Sie sich entsprechend an. Wenn z. B. die myofibril-Ausbeute gering ist und nur wenige geeignete Myofibrils in der Suspension vorhanden sind, fügen Sie mehr Myofibril Suspension hinzu und verdünnen Sie mit weniger entspannender Lösung (z. B. 75 l Myofibril Suspension und 225 l Entspannungslösung). Herz- und Skelettmuskelgewebe ist aufgrund seines Striationsmusters leicht zu erkennen. Mit einem 10x oder 40x Objektiv ist dieses Muster auch in einem einzelnen Myofibril sichtbar. Falls in der Suspension anderes Gewebe vorhanden ist, können Myofibrillen visuell ausgewählt werden. Man kann die 5-10 min Wartezeit überspringen. Dies erhöht jedoch die Schwierigkeit, ein Myofibril zu kleben.
  5. Beschichtungsnadeln mit Kleber (Shellac + Ethanol; 120 mg Schellack in 2 ml 70% Ethanol). Dazu den Kleber bei 65 °C für 30–60 s und die Pipette 6 l auf einem neuen unbeschichteten Glasschlitten erhitzen. Tauchen Sie die Spitze jeder Montagenadel in den Kleber und wiederholen Sie, bis eine Schicht Kleber sichtbar ist. Bewegen Sie die Sonde und piezo vertikal mit den Mikromanipulatoren nach oben, um Platz zu machen, um das Gewebebad auf die Mikroskopstufe zu stellen. Entfernen Sie die Glasrutsche, die den Kleber enthält.
  6. Montage der Myofibrils
    1. Legen Sie das Gewebebad mit dem mit Poly-HEMA beschichteten Mikroskopschlitten, der die myofibrilSuspension enthält, auf die Mikroskopstufe. Nutzen Sie die Bühne, um ein passendes Myofibril mit dem 40x Objektiv zu finden. Bei Bedarf das Gewebebad bewegen und drehen, um das Myofibril in eine montierbare Position zu bewegen.
      HINWEIS: Achten Sie auf Myofibrils mit einem sichtbaren Striationsmuster, das ca. 30 m lang ist. Wie in den Schritten 3.1 und 3.2.1 ausführlich beschrieben, ist es möglich, Länge und Sarcomere-Länge vor dem Kleben des Myofibrils zu überprüfen. Kleben Sie nicht zerrissene Myofibrils, weil diese wahrscheinlich während der Kontraktion brechen.
    2. Schieben Sie die Durchflusskammer direkt über dem Flüssigkeitstropfen, der die Myofibrillen im Gewebebad enthält (in Schritt 2.4 auf die Rutsche gepfetet) und senken Sie ihn. Stoppen Sie, bevor es den Flüssigkeitstropfen trifft.
    3. Senken Sie die Piezo-Montagenadel und drücken Sie sie auf die untere Spitze des Myofibrils. Heben Sie es leicht an, um zu überprüfen, ob das Myofibril an der Nadel befestigt ist.
    4. Senken Sie die Strömungskammer so weit, dass die Montagenadel der Sonde den Boden erreicht, ohne dass die Sonde die Strömungskammer berührt.
    5. Drücken Sie die Montagenadel der Sonde auf die obere Spitze des Myofibrils. Heben Sie es leicht an, um zu überprüfen, ob das Myofibril an der Nadel befestigt ist.
    6. Heben Sie das Myofibril so weit wie möglich von der Unterseite des Bades, ohne die Fähigkeit zu verlieren, sich zu fokussieren, ohne dass das Ziel den Boden des Glases berührt.

3. Initialisierungsexperiment

  1. Verwenden Sie die Software für Mikromanipulatoren, Kameras und Systemcontroller (Abbildung 7A, siehe Materialtabelle), um die Sarkome-Länge zu messen. Bewegen Sie die Piezo- und/oder Kraftsonde, um die anfängliche Sarcomere-Länge des Myofibrils auf 2,5 m einzustellen.
    HINWEIS: Eine Sarcomere-Länge von 2,5 m sorgt für eine optimale Überlappung zwischen Myosinköpfen und Actin.
  2. Mit der Gefäßfunktion der Systemsteuerungssoftware messen Sie die Myofibril-Länge und -Breite (Abbildung 7B,C).
    HINWEIS: Beim Drehen der Kamera kann sie horizontal und/oder vertikal geneigt werden. Um die Ausrichtung der Kamera zu überprüfen, kann ein Spirituosenpegel verwendet werden, um zu überprüfen, ob die Kamera gedreht und nicht geneigt ist.
    1. Positionieren Sie das Myofibril in der Mitte des Videobildes mit der Mikroskopstufe.
    2. Zeichnen Sie ein Quadrat von einer Seite des Myofibrils auf die andere. Stellen Sie für die Länge sicher, dass sie den dunklen Rand der Leimtröpfchen (Abbildung 2A) in das Quadrat einschließen, da die Bildverarbeitung auf Kontrast basiert.
    3. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Daten in der Systemcontroller-Software (siehe Tabelle der Materialien) durch Drücken von 'Start' und nach 5 s Pause die Systemcontroller-Software-Datenaufzeichnung durch Drücken der 'Pause' Taste. Die Länge wird nun in den Daten aufgezeichnet.
    4. Drehen Sie für die Breite zuerst die Kamera um 90° (siehe Materialtabelle) und verwenden Sie dann den Kontrast der Kante des Myofibrils selbst.
    5. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Daten in der Systemcontroller-Software (siehe Tabelle der Materialien) durch Drücken von'Start' und nach 5 s Pause die Systemcontroller-Softwaredatenaufzeichnung durch Drücken der Taste'Pause'. Die Breite wird nun in den Daten aufgezeichnet.
  3. Wenn die aktive Spannung des Myofibrils bestimmt werden muss, muss das Perfusions-Setup verwendet werden. Wenn ja, fahren Sie mit Schritt 3.4 fort. Wenn nur passive Spannung bestimmt wird, überspringen Sie die Schritte 3.4–4.1.3.7 und fahren Sie mit Schritt 4.2 fort.
  4. Positionieren und initialisieren Sie das Perfusions-Setup.
    HINWEIS: Dies ist nur für die Erzeugung von aktiver Kraft erforderlich. Fahren Sie mit Schritt 4.2 fort, wenn Sie passive Spannungsexperimente durchführen.
    1. Stellen Sie die Schnellschrittmotorposition auf 4 V ein (Abbildung 5B).
    2. Schieben Sie den Perfusionsständer auf dem Tisch, um die linke untere Ecke des Ständers mit dem Klebeband auf dem Tisch auszurichten.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht die Kraftsonde oder den Piezomotor zu treffen.
    3. Verwenden Sie den Manipulator, um das Glas mit dem Auge grob zu positionieren.
    4. Schauen Sie durch das Okular und bewegen Sie vorsichtig das Glas in Richtung Myofibril mit dem Manipulator.
    5. Richten Sie den oberen Kanal des -glases mit dem Myofibril mit dem Manipulator aus und überprüfen Sie die Position, indem Sie einen Schnellschritt (Signalgeneratoreinstellungen finden Sie in Tabelle 1) mit der Systemsteuerungssoftware(Abbildung 2B–C, siehe Materialtabelle) durchführen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der untere Kanal während der Aktivierungsphase des Schnellschritts (Abbildung 2B–C) am Myofibril ausgerichtet wird.
  5. Aktivieren Sie den Hintergrundfluss von Rx (Abbildung 4A), um einen laminaren Hintergrundfluss in der Strömungskammer zu erstellen.
    ANMERKUNG: Der Hintergrundfluss ist notwendig, um einen turbulenten Fluss infolge des pCa-Lösungsflusses aus dem Glas zu verhindern.
    1. Schalten Sie den Durchfluss der Durchflusskammer mit einem Luer-Ventilhebel ein.
      1. Senden Sie die folgenden Parameter an die Abflusspumpe, um mit dem Entleeren der Durchflusskammer zu beginnen und ein Überlaufen der Durchflusskammer zu verhindern (Abbildung 9): Ventil = Badventil (2); Microstep-Modus = Mikro; Plunger-Ziel = 48.000; Plunger-Geschwindigkeit = 38–40 (willkürlich).
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Flüssigkeitsstand jederzeit stabil ist. Das Myofibril sollte nicht trocken laufen und auch der Ausleger nicht. Es ist besser, einen kleinen Überlauf als zu wenig Fluss zu haben.
  6. Um die Temperatur mit dem thermoelektrischen Temperaturregler auf einen gewünschten Wert einzustellen (Abbildung 8, siehe Materialtabelle), geben Sie die gewünschte Temperatur ein und drücken Sie 'Start'. Warten Sie, bis die gewünschte Temperatur erreicht ist, indem Sie das Diagramm in der thermoelektrischen Temperaturregler-Software überprüfen und fortfahren.
    HINWEIS: Bei Experimenten bei Raumtemperatur muss der thermoelektrische Temperaturregler nicht verwendet werden.

4. Experimentelle Protokolle

  1. Entscheiden Sie, welche aktiven Kraftprotokolle ausgeführt werden müssen.
    ANMERKUNG: Abhängig von den für die Studie erforderlichen Daten können mehrere Arten von Aktivkraftexperimenten durchgeführt werden: Schritt 4.1.1, Messung der maximalen Kraft bei der Sättung [Ca2+]; Schritt 4.1.2, Die Erlangung einer Force-pCa-Kurve zur Bestimmung der Calciumempfindlichkeit zusätzlich zu Schritt 4.1.1; Schritt 4.1.3, Bestimmung der Spannungssanierungsrate durch Einkürzen des Restretch-Protokolls zusätzlich zu Schritt 4.1.1 oder 4.1.2.
    1. Messen Sie die maximale aktive Kraft.
      1. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Daten in der Systemcontroller-Software (siehe Tabelle der Materialien) durch Drücken von'Start'.
      2. Öffnen Sie die Ventile 1 und 6 mit der Datenerfassungs-Software (siehe Tabelle der Materialien) durch Die Überprüfung der Taste '1+6', um den S-Glas-Fluss der Entspannungslösung zu starten und die Lösung durch das Glas zu aktivieren (Abbildung 6A).
      3. Setzen Sie den Bereich des Interferometers so zurück, dass die Ausgangskraft 0 V beträgt, indem Sie 'Reset Range' auf dem Interferometer auswählen und drücken (siehe Tabelle der Materialien).
      4. Wenn die Kraftspur stabil ist, führen Sie den Schnellschritt "-Glas" (Schrittgröße = 100 m) aus.
        Die Einstellungen für den Signalgenerator finden Sie in Tabelle 1 (Abbildung 5C). Eine Aktivierungs-Entspannungsspur ähnlich Abbildung 4D wird aufgezeichnet und in der Systemcontroller-Software sichtbar.
      5. Halten Sie die Aufzeichnung der Systemcontroller-Softwaredaten durch Drücken der Taste "Pause"an.
      6. Wenn keine Aktivierungen mehr durchgeführt werden sollen, schließen Sie die Ventile 1 und 6, um den Durchfluss von B-Glas zu stoppen, indem Sie die Taste '1+6' (Abbildung 6B)deaktivieren, stoppen Sie die Spritzenpumpe (Abbildung 9, siehe Tabelle der Materialien) durch Drücken von'Beenden'und stoppen Sie den Hintergrundfluss, indem Sie das Luer-Ventil schließen.
    2. Force-pCa-Kurve
      HINWEIS: Dies ist ähnlich wie Schritt 4.1.1, um die maximale aktive Kraft zu erhalten, aber mit mehreren Aktivierungen mit verschiedenen pCa-Lösungen.
      1. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Daten in der Systemcontroller-Software, indem Sie'Start'drücken.
      2. Öffnen Sie die Ventile 1 und 2 mit der Datenerfassungspanel-Software, um den Fluss der entspannenden Lösung und pCa 6.2 durch das Glas zu starten.
      3. Setzen Sie den Bereich des Interferometers zurück, sodass die Ausgangskraft 0 V beträgt, indem Sie auf dem Interferometer denReset-Bereichauswählen und drücken.
      4. Wenn die Kraftspur stabil ist, führen Sie den Schnellschritt "-Glas" (Schrittgröße = 100 m) aus.
        Die Einstellungen für den Signalgenerator finden Sie in Tabelle 1.
      5. Halten Sie die Systemcontroller-Software an, indem Sie die Taste "Pause"drücken.
      6. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.2.1–4.1.2.4 für Ventile 1 und 3 (pCa 5.8), Ventile 1 und 4 (pCa 5.6), Ventile 1 und 5 (pCa 5.4) und Ventile 1 und 6 (pCa 4.5).
      7. Wenn keine Aktivierungen mehr durchgeführt werden sollen, schließen Sie die Ventile 1 und 6, um den Durchfluss von B-Glas zu stoppen, indem Sie die Taste '1+6' (Abbildung 6A)deaktivieren, stoppen Sie die Spritzenpumpe (Abbildung 9) durch Drücken von'Beenden'und stoppen Sie den Hintergrundfluss, indem Sie das Luer-Ventil schließen.
    3. Messrate der Spannungssanierung (kTR).
      HINWEIS: Dies ist ähnlich wie Schritt 4.1.1 für maximale aktive Kraft, aber mit einigen Änderungen und hinzugefügten Schritten.
      1. Berechnen Sie die Piezobewegung, die notwendig ist, um die Myofibril 15% zu lockern, und geben Sie diesen Wert in den Signalgenerator ein (Abbildung 5D, Tabelle 1).
      2. Starten Sie die Aufzeichnung der Daten in der Systemcontroller-Software, indem Sie 'Start' drücken.
      3. Öffnen Sie die Ventile 1 und 6 mit der Datenerfassungs-Software (Abbildung 6A), um den Fluss der Entspannungslösung zu starten und pCa 4.5 durch das Glas .
      4. Setzen Sie den Bereich des Interferometers zurück, sodass die Ausgangskraft 0 V beträgt, indem Sie auf dem Interferometer denReset-Bereichauswählen und drücken.
      5. Wenn die Kraftspur stabil ist, führen Sie den Schnellschritt "-Glas" (Schrittgröße = 100 m) aus.
        Die Einstellungen für den Signalgenerator finden Sie in Tabelle 1.
      6. Wenn das Kraftplateau erreicht ist, führen Sie die Verkürzungs-Restretch mit dem Piezo durch.
        Die Einstellungen für den Signalgenerator finden Sie in (Abbildung 5D, Tabelle 1). Eine Aktivierungs-Entspannungsspur ähnlich Abbildung 4E wird aufgezeichnet und in der Systemcontroller-Software sichtbar.
        HINWEIS: Es kann ein benutzerdefiniertes Protokoll zur Automatisierung der oben genannten Schritte hergestellt werden.
      7. Halten Sie die Systemcontroller-Software an, indem Sie die Taste "Pause"drücken.
      8. Wenn keine Aktivierungen mehr durchgeführt werden sollen, schließen Sie die Ventile 1 und 6, um den Durchfluss von B-Glas zu stoppen, indem Sie die Taste '1+6' (Abbildung 6B)deaktivieren, stoppen Sie die Spritzenpumpe (Abbildung 9) durch Drücken von'Beenden'und stoppen Sie den Hintergrundfluss, indem Sie das Luer-Ventil schließen.
  2. Führen Sie passive Kraftmessungen durch.
    1. Führen Sie eine kontinuierliche Dehnung durch.
      1. Berechnen Sie die Piezobewegung, die notwendig ist, um das Myofibril zu dehnen, und geben Sie diesen Wert in den Signalgenerator ein (Tabelle 1).
        HINWEIS: Dies sind Beispieleinstellungen. Berechnen Sie die Dehnungs- und Dehnungsdauer relativ zur Sarcomere-Länge. Diese Einstellungen sind notwendig, um sicherzustellen, dass die Geschwindigkeit der Dehnung pro Sarcomere in myofibrils gleich bleibt.
      2. Starten Sie die Aufzeichnung der Daten in der Systemcontroller-Software, indem Sie 'Start' drücken.
      3. Setzen Sie den Bereich des Interferometers zurück, sodass die Ausgangskraft 0 V beträgt, indem Sie auf dem Interferometer denReset-Bereichauswählen und drücken.
      4. Führen Sie eine kontinuierliche Dehnung mit dem Signalgenerator in der Systemcontroller-Software durch, um den Piezo zu betreiben. Beispiel-Signalgeneratoreinstellungen finden Sie in Tabelle 1.
      5. Verkürzen Sie die myofibril zu slack Länge mit dem Piezo nach der Strecke beendet ist (Tabelle 1).
    2. Führen Sie eine schrittweise Dehnung durch.
      1. Starten Sie die Aufzeichnung der Daten in der Systemcontroller-Software, indem Sie 'Start' drücken.
      2. Setzen Sie den Bereich des Interferometers zurück, sodass die Ausgangskraft 0 V beträgt, indem Sie auf dem Interferometer denReset-Bereichauswählen und drücken.
      3. Führen Sie eine schrittweise Dehnung mit dem Signalgenerator in der Systemcontroller-Software durch, um den Piezo zu betreiben. Die Einstellungen für den Signalgenerator finden Sie in Tabelle 1 (Abbildung 5E).
    3. Verkürzen Sie die Myofibril auf Slack Länge mit dem Piezo, nachdem die Strecke beendet ist. Beispiel-Signalgeneratoreinstellungen finden Sie in Tabelle 1.
  3. Halten Sie die Systemcontroller-Software an, indem Sie die Taste "Pause"drücken.
  4. Beenden Sie die Aufzeichnung von Daten, indem Sie die Taste"Stopp"in der Systemcontroller-Software drücken.
  5. Speichern Sie die Daten, indem Sie 'Datei' und 'Daten speichern' in der Systemcontroller-Software drücken.

5. Reinigung

  1. Entfernen Sie das gemessene Myofibril und bereiten Sie sich auf das nächste Myofibril vor.
    1. Um dies zu tun, reißen Sie vorsichtig das Myofibril ab, während Sie mit dem 40x Objektiv durch das Okular schauen.
    2. Bewegen Sie die Kraftsonde und den Piezo nach oben. Bewegen Sie das Glas ganz nach oben, nach rechts und nach hinten. Dann nach oben und schieben Sie die Strömungskammer weg. Entfernen Sie das Gewebebad.
    3. Um die Montagenadel zu reinigen, bringen Sie sie mit dem 10x und dem Okular in den Fokus. Tauchen Sie die Bürste in Ethanol und bürsten Sie vorsichtig ab und entfernen Sie den Kleber von der Nadel.
      HINWEIS: Denken Sie daran, dass es einige Zeit dauern kann, bis der Kleber abkommt.
    4. Spülen Sie die Durchflusskammer und das Gewebebad mit Reinstwasser.
    5. Legen Sie die Sonde in kleine eine Petrischale gefüllt mit reinem Wasser. Stellen Sie sicher, dass die Sonde vollständig untergetaucht ist.
  2. Wenn die Experimente abgeschlossen sind, reinigen Sie das Setup wie oben, und führen Sie die folgenden zusätzlichen Schritte aus.
    1. Leeren Sie die Schläuche aus dem Durchflussbad. Senden Sie die Parameter an die Abflussspritzenpumpe (siehe Materialtabelle, Abbildung 9). Ventil = Badventil (2); Microstep-Modus = Normal; Plunger-Ziel = 0; Plunger-Geschwindigkeit = 30.
      HINWEIS: Beenden Sie den Befehl, wenn der Schlauch leer ist.
    2. Initialisieren Sie die Pumpe mehrmals (Abbildung 9B).
    3. Entleeren Sie die Spritzen. Schließen Sie dazu alle Luer-Ventile, öffnen Sie alle Ventile, entfernen Sie die Schläuche von der Nadel der Spritze, halten Sie das Rohr eines bestimmten pCa unter der Nadel und öffnen Sie das Luer-Ventil. Verwenden Sie die Druckstecker, um den Prozess zu beschleunigen.
    4. Befestigen Sie den Schlauch wieder an der Nadel der Spritze. Füllen Sie Spritzen mit 5 ml Reinstwasser. Legen Sie eine Tasse unter das Glas. Öffnen Sie alle Ventile und öffnen Sie das Druckventil, um das System zu spülen.
    5. Fahren Sie das System herunter. Schalten Sie den Stromblock PC, Interferometer und Piezo-Controller aus.

6. Datenanalyse

  1. Exportieren Sie Datenablaufverfolgungen aus der Systemcontroller-Software (siehe Tabelle der Materialien) in ein Tabellenkalkulationssoftwareprogramm oder eine Zwischenablage, indem Sie die Datendatei öffnen und das gewünschte Segment auswählen. Die gezeigten Spuren werden exportiert (z. B. Rohkraft, Sarcomere-Länge und Piezoposition).
  2. Führen Sie die Analyse mit der Software der Wahl (z.B. MATLAB) durch.

Ergebnisse

Datenablaufverfolgungen wurden aufgezeichnet und mit der Systemcontroller-Software geöffnet (siehe Tabelle der Materialien). Vollständige Ablaufverfolgungen oder ausgewählte Segmente wurden zur weiteren Analyse mit einer gewünschten Software in die Zwischenablage oder Textdatei exportiert. Ventile zur Steuerung des Durchflusses der verschiedenen Lösungen wurden mit kundenspezifischer Software oder manuell geschaltet. Ein benutzerdefiniertes MATLAB-Skript wurde verwendet, um die Aktivierungs-, Spannu...

Diskussion

Beschrieben ist ein Protokoll zur Beurteilung der kontraktilen Funktion von Myofibrils, die aus menschlichen oder tierischen Skelettmuskelgeweben isoliert sind. Die Kraftauflösung dieses Setups wurde bereits von Chavan et al.12beschrieben. Kurz gesagt, wird durch die zufälligen Schwankungen der Länge der Fabry-Pérot-Kavität zwischen der Detektionsfaser und dem Ausleger gebildet, die den dominanten Teil des Rauschens am Ausgang der Auslese erzeugen (ausgedrückt in V), die, multipliziert mit d...

Offenlegungen

Michiel Helmes ist Gesellschafter und Miteigentümer der IONOptix Inc.

Danksagungen

Dieses Projekt wurde von AFM-Telethon und A Foundation Building Strength for Nemaline Myopathies finanziert. Die Autoren möchten den Schöpfer der in diesem Artikel genannten Produkte, IONOptix Inc.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Bio Spec Products, Inc.985370-XLTo isolate myofibrils
Custom codedMatlab
Custom fabricatedIncludes Labview program to control over serial connection; To control valves
Custom fabricatedTo cool the Peltier module
Custom fabricated
Custom fabricatedAluminum tissue chamber
Custom fabricatedTo control the valves; Includes PC software to control over USB
IonOptixSystem controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step
IonOptixMCS100To record sarcomere length
IonOptixIncludes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher
IonOptixForce probe
KoolanceADT-EX004S
KoolanceEX2-755To cool the Peltier module
MicrosoftData registration
OlympusIX71
OlympusTH4-200
Sigma-Aldrich529265Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue
Sigma-Aldrich78471Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue
TE Technology, Inc.TE-63-1.0-1.3To cool the tissue flow chamber
TE Technology, Inc.TC-720Includes PC software to control over USB
Tecan Trading AG20736652
Tecan Trading AG20739263Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber
Thermo scientific2441081
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)DiscontinuedAlternative: SF-77CST/VCS-77CSP
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)TG150-4To perfuse the tissue
1 PC for IonWizard and 1 PC for other software

Referenzen

  1. Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
  2. Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, 535-548 (1997).
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  10. Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
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