זיהוי SERS כמותי של חומצת שתן באמצעות היווצרות של ננו-צווים פלסמוניים מדויקים בתוך אגרגטים של ננו-חלקיקי זהב ו-Cucurbit[n]uril

Summary

קומפלקס מארח-אורח של cucurbit[7]uril וחומצת שתן נוצר בתמיסה מימית לפני שהוסיף כמות קטנה לתמיסת Au NP עבור חישת ספקטרוסקופיית ראמאן (SERS) כמותית משופרת על פני השטח באמצעות ספקטרומטר מודולרי.

Abstract

עבודה זו מתארת שיטה מהירה ורגישה מאוד לזיהוי כמותי של סמן ביולוגי חשוב, חומצת שתן (UA), באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן משופרת על פני השטח (SERS) עם מגבלת זיהוי נמוכה של ~ 0.2 מיקרומטר עבור פסגות אופייניות מרובות באזור טביעת האצבע, באמצעות ספקטרומטר מודולרי. סכמת ביוסנסינג זו מתווכת על-ידי קומפלקס בין קומפלקס בין מקרו-מחזור, cucurbit[7]uril (CB7) ו-UA, וההיווצרות שלאחר מכן של ננו-צווים פלסמוניים מדויקים בתוך Au NP המורכב מעצמו: ננו-אגרגטים של CB7. סינתזת Au NP facile של גדלים רצויים עבור מצעי SERS בוצעה גם היא על סמך גישת הפחתת הציטראט הקלאסית עם אפשרות להקלה באמצעות סינתיסייזר אוטומטי שנבנה במעבדה. ניתן להרחיב פרוטוקול זה בקלות לזיהוי מרובב של סמנים ביולוגיים בנוזלי גוף ליישומים קליניים.

Introduction

חומצת שתן, שהיא התוצר הסופי של חילוף החומרים של נוקלאוטידים פורין, היא סמן ביולוגי חשוב בסרום הדם ובשתן לאבחון מחלות כגון שיגדון, רעלת הריון, מחלות כליות, יתר לחץ דם, מחלות לב וכלי דם וסוכרת ^1,2,3,4,5. השיטות הנוכחיות לזיהוי חומצות שתן כוללות בדיקות אנזימטיות צבעוניות, כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים ואלקטרופורזה נימית, שהן גוזלות זמן רב, יקרות ודורשות הכנת דגימה מתוחכמת 6,7,8,9.

ספקטרוסקופיית ראמאן המשופרת על פני השטח היא טכניקה מבטיחה לאבחון נקודתי שגרתי, שכן היא מאפשרת זיהוי סלקטיבי של ביו-מולקולות באמצעות טביעות האצבעות של הרטט שלהן ומציעה יתרונות רבים כגון רגישות גבוהה, תגובה מהירה, קלות שימוש והכנת דגימה ללא דגימה או מינימלית. מצעי SERS המבוססים על ננו-חלקיקי מתכת אצילים (לדוגמה, Au NPs) יכולים לשפר את אותות הראמן של מולקולות האנאליט ב-4 עד 10 סדרי גודל¹⁰ באמצעות שיפור אלקטרומגנטי חזק הנגרם על ידי תהודת פלסמון פני השטח¹¹. ניתן לסנתז בקלות Au NPs בגדלים מותאמים אישית, בניגוד לייצור הגוזל זמן רב של ננו-קומפוזיטים מתכתיים מורכבים¹², ולכן נעשה בהם שימוש נרחב ביישומים ביו-רפואיים בשל תכונותיהם המעולות 13,14,15,16. חיבור של מולקולות מקרוציקליות, cucurbit[n]urils (CBn, כאשר n = 5-8, 10), על פני השטח של Au NPs יכול לשפר עוד יותר את אותות ה-SERS של מולקולות האנאליטים, שכן מולקולות ה-CB הסימטריות והנוקשות ביותר יכולות לשלוט במרווח המדויק בין ה-Au NPs ולמקם את מולקולות האנאליט במרכז או בסמיכות לנקודות החמות הפלסמוניות באמצעות היווצרות של קומפלקסים מארחים-אורחים (איור 1)^17, 18,19,20. דוגמאות קודמות למחקרי SERS שהשתמשו ב-Au NP: CBn nanoaggregates כוללים ניטרו-אקספלוזיבים, ארומטיים פוליציקליים, דיאמינוסטילבן, מוליכים עצביים וקריאטינין 21,22,23,24,25, כאשר מדידות ה-SERS מבוצעות בקובטה או על ידי העמסת טיפה קטנה על מחזיק דגימה מותאם אישית. ערכת זיהוי זו שימושית במיוחד לכימות מהיר של סמנים ביולוגיים במטריצה מורכבת עם יכולת שכפול גבוהה.

כאן, הודגמה שיטה פזיזה ליצירת קומפלקסים מארחים-אורחים של CB7 ו-UA חשוב של סמנים ביולוגיים, ולכימות UA עם מגבלת זיהוי של 0.2 μM באמצעות צבירה בתיווך CB7 של Au NPs במדיה מימית באמצעות ספקטרומטר מודולרי, המבטיח ליישומים אבחוניים וקליניים.

Protocol

1. סינתזה של Au NPs

1. סינתזה של זרעי Au בשיטת טורקביץ ' הקונבנציונלית²⁶
   1. הכן 10 מ"ל של 25 mM תמיסת HAuCl₄ על ידי המסת 98.5 מ"ג של HAuCl₄· 3H₂O מבשר עם 10 מ"ל של מים deionized בבקבוקון זכוכית.
      הערה: העבר כמות קטנה של מבשר HAuCl₄ לתוך סירת שקילה והשתמש במרית פלסטיק במקום במרית מתכתית כדי לשקול את הגבישים מכיוון שמבשר HAuCl₄ יתאים לכלי מעבדה ממתכת. שלב השקילה צריך להתבצע במהירות האפשרית, שכן HAuCl₄ הוא היגרוסקופי ולכן יגדיל את משקלו לאורך זמן על ידי ספיגת מים מהאטמוספרה. HAuCl₄ הוא קורוזיבי מאוד ועלול לגרום לכוויות עור קשות ולפגיעה בעיניים. היזהרו במיוחד כשאתם מטפלים בו.
   2. להכין 0.5 מ"ל של תמיסת נתרן ציטראט 500 mM על ידי המסת 64.5 מ"ג של אבקת נתרן ציטראט עם 0.5 מ"ל של מים deionized בבקבוקון זכוכית.
   3. דילול 1 מ"ל של תמיסת HAuCl₄ של 25 mM עם 99 מ"ל מים בבקבוק עם פקק כחול של 250 מ"ל כדי לתת 100 מ"ל של תמיסת HAuCl₄ של 0.25 mM.
   4. הוסיפו 99.5 מ"ל של תמיסת HAuCl₄ של 0.25 מ"מ לתוך בקבוקון בעל תחתית עגולה בעלת שלושה מ"ל עם שלושה מ"ל המצוידים במעבה. מחממים את התמיסה ל-90 מעלות צלזיוס תחת ערבוב נמרץ ושומרים על הטמפרטורה במשך 15 דקות.
   5. להזריק 0.5 מ"ל של תמיסת נתרן ציטראט 500 mM לתוך תערובת התגובה ולשמור על הטמפרטורה והערבוב עד שצבע התמיסה הופך לאדום-אודם.
      הערה: התגובה אורכת כ-30 דקות.
2. צמיחה נזרעת של Au NPs באמצעות השיטה הנשלטת באופן קינטי¹³
   1. מצננים את תמיסת זרעי Au המסונתזת ל-70 מעלות צלזיוס.
   2. מכינים 10 מ"ל של תמיסת נתרן ציטראט של 60 מ"מ על ידי המסת 154.8 מ"ג של אבקת נתרן ציטראט עם 10 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה בבקבוקון זכוכית.
   3. הזריקו 0.67 מ"ל של תמיסת HAuCl₄ של 25 mM ו-0.67 מ"ל של תמיסת הנתרן ציטראט של 60 mM לזרעי Au עם מרווח זמן של 2 דקות.
   4. חזור על שלב 1.2.3 כדי להגדיל בהדרגה את הגודל של Au NPs ל- 40 ננומטר.
      הערה: נדרשים כ-10 צעדי גדילה כדי להגיע ל-40 ננומטר. מספר הצעדים הדרוש בפועל עשוי להיות תלוי בהגדרה המדויקת.
3. צמיחה נזרעת של Au NPs באמצעות סינתיסייזר אוטומטי (איור 2)
   1. העבר 25 מ"ל של תמיסת זרעי Au שהוכנה בקטע 1 לצינור צנטריפוגה חרוטית של 50 מ"ל וקרירה ל-70 מעלות צלזיוס בתרמומיקסר.
      הערה: עקוב אחר הטמפרטורה בתוך התרמומיקסר באמצעות מדחום thermocouple הממוקם בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל המכיל 25 מ"ל מים.
   2. מלאו מזרק חד פעמי של מנעול Luer 3 מ"ל עם 2.5 מ"ל של תמיסת HAuCl₄ של 25 mM. מלאו עוד מזרק חד פעמי של 3 מ"ל Luer lock עם 2.5 מ"ל של תמיסת נתרן ציטראט 60 מ"ל.
   3. הניחו את המזרקים במשאבות המזרקים והשתמשו במתאמי Luer-to-MicroTight כדי לחבר את צינורות PEEK (קוטר פנימי של 150 מיקרומטר) למזרקים. הכנס את הצינורות לתוך צינור הצנטריפוגה המכיל את תמיסת זרעי Au בתרמומיקסר.
   4. הגדר את שתי משאבות המזרק לחלוקת 0.1675 מ"ל של תמיסה מעל 20 דקות (8.357 μL לדקה).
   5. הגדר את מהירות הסיבוב של התרמומיקסר ל-700 סל"ד ולחץ על התחל במשאבת המזרק המכילה את פתרון HAuCl₄ של 25 mM.
   6. לאחר 2 דקות, לחץ על התחל במשאבת המזרק המכילה את תמיסת הנתרן ציטראט 60 mM.
   7. 30 דקות לאחר תחילת הזרקת תמיסת HAuCl₄ , הסר aliquot של פתרון Au NP לניתוח.
   8. חזור על שלבים 1.3.5 – 1.3.7 כדי להגדיל בהדרגה את קוטר ה- Au NPs עד 40 ננומטר.
      הערה: ניתן להשתמש בהגדרה זו כדי להגדיל את Au NPs עד 40 ננומטר בשלב אחד על ידי הגדלת נפח המגיבים שנוספו בשלב 1.3.4. זה מושג על ידי הגדלת זמן החלוקה תוך שמירה על אותו קצב של הזרקה.

2. אפיון של Au NPs

1. ספקטרוסקופיה UV-Vis
   1. הוסף 1 מ"ל של תמיסת Au NP לקובט חצי מיקרו קוורץ.
   2. הפעל את הספקטרומטר.
   3. הגדר את טווח אורכי הגל ל- 400 - 800 ננומטר.
   4. רכוש את ספקטרום UV-Vis עבור כל דגימה.
2. פיזור אור דינמי (DLS)
   1. סנן את התמיסה לדוגמה לתוך קובט חצי מיקרו-מיקרו מפלסטיק עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
   2. הפעל את מכשיר ה- DLS.
   3. הגדר את הטמפרטורה ל- 25 ° C ושווי משקל במשך 60 שניות.
   4. מדוד את הגודל ההידרודינמי של כל דגימה.
3. מיקרוסקופיית אלקטרונים תמסורת (TEM)
   1. טיפה יצוקה טיפה של 5 μL של תמיסת הדגימה על רשת 300 Cu מצופה C וייבוש באוויר.
      הערה: יש צורך בדילול עבור דגימות תמיסות Au NP מרוכזות יותר כדי לקבל Au NPs מפוזרים היטב ברשת TEM.
   2. השג תמונות TEM מרובות עבור כל דגימה באמצעות TEM במתח האצה של 200 קילו-וולט.
   3. מדוד את הקוטר של 200 Au NPs עבור כל דגימה באמצעות ImageJ כדי לחשב את הגודל הממוצע וסטיית התקן.

3. היווצרות מתחמי CB7-UA

1. הכנת תמיסת 0.4 mM CB7
   1. הוסיפו 4.65 מ"ג של CB7 לבקבוקון זכוכית של 15 מ"ל.
      הערה: כמות ה- CB7 מחושבת על סמך משקל הנוסחה של CB7 (= 1163 Da) אשר שימשה את רוב הדוחות בספרות. עם זאת, דגימות מוצקות של CB7 מכילות בדרך כלל מים, HCl, מתנול ומלחים אחרים שנותרו משלבי הסינתזה והטיהור, מה שתורם למשקל מת של כ-10 - 20% בדגימה. לא ניתן היה להסיר את הממסים והמלחים הכלואים על ידי חימום בתנור ואקום או באמצעים אחרים. הכמויות שלהם משתנות בין קבוצות שונות של דגימות, אך ניתן לכמת אותן באמצעות ניתוח אלמנטים. עם זאת, הפרוטוקול המוצג אינו רגיש לנוכחות כמות בלתי מסויגת של ממסים ומלחים בדגימות CB7.
   2. מוסיפים 10 מ"ל מים לבקבוקון ומהדקים את המכסה.
   3. נקו את הדגימה בטמפרטורת החדר עד שמוצק CB7 יתמוסס לחלוטין.
      הערה: CB7 סונתז על פי ספרות²⁷ אך הוא גם זמין מסחרית.
2. הכנת פתרון 0.4 mM UA
   1. הוסף 2.69 מ"ג של UA לצינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
   2. מוסיפים 40 מ"ל מים לצינור ומהדקים את המכסה.
   3. השתמש בתרמומיקסר כדי לסובב את תמיסת הדגימה על ידי הגדרת הטמפרטורה ל-70 מעלות צלזיוס, מהירות ל-800 סל"ד וזמן ל-2 שעות. אפשרו לפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר.
      הערה: ל-UA יש מסיסות נמוכה במים (0.40 מ"מ)⁵. מערבולת למשך זמן רב יותר אם אבקת ה-UA לא הומסה לחלוטין. לחלופין, ניתן להשתמש באולטרה-סוניזציה כדי להקל על הפירוק.
3. דילולים רציפים של פתרון 0.4 mM UA
   1. דילול 5 מ"ל של תמיסת UA 0.4 mM עם 5 מ"ל מים בבקבוקון זכוכית 15 מ"ל כדי לתת 10 מ"ל של תמיסת UA 0.2 mM. הדקו את הכובע וסוניקציה במשך 30 שניות.
   2. חזור על שלב 3.3.1 באמצעות כמות מתאימה של UA ומים כמתואר בטבלה 1.
4. הכנת מתחמי CB7-UA
   1. הוסף 0.75 מ"ל של תמיסת CB7 של 0.4 mM ו- 0.75 מ"ל של תמיסת UA של 0.4 mM לתוך צינור 1.5 מ"ל. אבטחו את המכסה וסוניקציה במשך 30 שניות.
   2. המתן במשך 30 דקות כדי להבטיח את היווצרותם של מתחמי מארח-אורח.
   3. חזור על שלב 3.4.1 – 3.4.2 באמצעות תמיסת UA בריכוזים שונים.

4. חישת SERS של UA

1. מערך ניסיוני של מערכת ראמאן (איור 3)
   1. הפעל את לייזר He-Ne 633 ננומטר (22.5 mW).
   2. הפעילו את הספקטרומטר המודולרי של ראמאן.
   3. הפעל את המחשב והפעל את התוכנה.
   4. לחץ על סמל אשפי יישומים ספקטרוסקופיים ולאחר מכן בחר ראמאן.
   5. התחל רכישה חדשה. הגדר את זמן האינטגרציה ל- 30 שניות, סריקות לממוצע ל- 5 ו- boxcar ל- 0.
   6. אחסן את ספקטרום הרקע והזן את אורך הגל של הלייזר (כלומר, 633 ננומטר).
      הערה: זמן האינטגרציה הוא הזמן עבור כל סריקה, סריקות לממוצע הוא מספר הסריקות הממוצע ליצירת כל ספקטרום ו- boxcar הוא מספר הפיקסלים השכנים בממוצע²⁸.
2. היווצרות מצעי ה-SERS
   1. הוסף 0.9 מ"ל של תמיסת Au NP של 40 ננומטר ו- 0.1 מ"ל של הפתרון המורכב CB7-UA שנוצר מראש לצינור 1.5 מ"ל. מאבטחים את המכסה ומסתננים עד שהתמיסה משתנה מאדום-אודם לסגול.
      הערה: ניתן להשתמש גם בדגימות מסחריות של תמיסת Au NP המיוצבת על ידי ציטראט 40 ננומטר. בדרך כלל, הצפיפות האופטית של שיא התהודה המקומית של פלסמון המשטח (LSPR) מותאמת ל-1 באמצעות דילול מדגימות של תמיסות מלאי מרוכזות. ריכוז הציטראט בדגימה נשמר בדרך כלל כ-2 mM.
   2. העבר את הפתרון לדוגמה למיקרו-קובט למחצה. מכניסים את הקובט למחזיק הדגימה של ראמאן וסוגרים את העטיפה.
   3. התחל את המדידה.
   4. הגדר את החיסכון האוטומטי כדי לרשום חמישה ספקטרום SERS רצופים.
   5. עצור את המדידה ושנה את המדגם.
   6. חזור על שלב 4.2.1 – 4.2.5 באמצעות תמיסת CB7-UA בריכוזים שונים.
      הערה: זמן הצבירה נמצא כתלוי בריכוז של UA בננו-אגרגטים, החל מ-30 שניות עבור 0.1 μM UA ועד 30 דקות עבור 20 μM UA, בשל ההבדל בריכוז של CB7 ריק שיש לו תרומה גדולה לתיווך הצבירה של Au NPs. עבור קומפלקס CB7-UA, פורטל אחד נחסם על ידי מולקולת ה-UA המגושמת, מה שהופך אותו ללא זמין לקשירתו למשטח Au NP ולכן אינו מסוגל לתווך את צבירת ה-NP²¹. הדגימה מוכנה למדידה כאשר צבע התמיסה משתנה מאדום-אודם לסגול.

5. ניתוח נתונים

1. עיבוד נתונים
   1. הורד והתקן את קו הבסיס עם תוסף ריבועים לפחות אסימטריים (ALS) לתוך Origin.
      הערה: תוסף ה-ALS דורש את OriginPro.
   2. הכנס את הנתונים הגולמיים למקור.
   3. חשב ערך ממוצע מתוך חמשת ספקטרום ה-SERS של כל דגימה. חלקו את הערך בעוצמת הלייזר (כלומר, 22.5 mW) ובזמן האינטגרציה (כלומר, 30 שניות).
   4. לחץ על סמל ALS כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח. הגדר את הגורם האסימטרי ל- 0.001, את הסף ל- 0.03%, את גורם ההחלקה ל- 2 ואת מספר האיטרציות ל- 20 כדי לתקן את הבסיס של כל ספקטרום ממוצע.
   5. תרשים ספקטרום SERS של ריכוזי UA שונים באמצעות קווים מוערמים על ידי קיזוזים y. הפלט צריך להיות בעוצמה (סופר ^{s-1 mW-1}) כנגד הסטת ראמאן (^cm-1).

תוצאות

בסינתזת Au NP שהוצגה, ספקטרום ה-UV-Vis מראה תזוזה של פסגות ה-LSPR מ-521 ננומטר ל-529 ננומטר לאחר 10 צעדי גדילה (איור 4A,B) בעוד שנתוני ה-DLS מראים התפלגות גודל צרה כאשר הגודל של Au NPs גדל מ-25.9 ננומטר ל-42.8 ננומטר (איור 4C,D). הגדלים הממוצעים של G0, G5 ו-G10 שנמדדו מתמו?...

Discussion

שיטת הסינתזה האוטומטית המתוארת בפרוטוקול מאפשרת ל- Au NPs בגדלים הולכים וגדלים להיות מסונתזים באופן רנדוקטיבי. למרות שיש כמה אלמנטים שעדיין צריכים להתבצע באופן ידני, כגון הוספה מהירה של נתרן ציטראט במהלך סינתזת הזרעים ובדיקה מעת לעת כדי להבטיח כי צינורות PEEK מאובטחים, שיטה זו מאפשרת Au NPs של ג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 nm gold nanoparticles	NanoComposix	AUCN40-100M	NanoXact, 0.05 mg/ mL, bare (citrate)
Centrifuge tube	Corning Falcon	14-432-22	50 mL volume
Cucurbit[7]uril	Lab-made		see ref. 19
Gold(III) chloride trihydrate	Sigma aldrich	520918	≥99.9% trace metals basis
Luer lock disposable syringe	Cole-Parmer	WZ-07945-15	3 mL volume
Luer-to-MicroTight adapter	LuerTight	P-662	360 μm outer diameter Tubing to Luer Syringe
PEEK tubing	IDEX	1572	360 μm outer diameter, 150 μm inner diameter
PEEK tubing cutter	IDEX	WZ-02013-30	Capillary Polymer Chromatography Tubing Cutter For 360 µm to 1/32" OD tubing
Raman spectrometer	Ocean Optics	QE pro
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma aldrich	S4641	ACS reagent, ≥99.0%
Sonicator
Standard Probe	Digi-Sense	WZ-08516-55	Type-K
Syringe pump	Aladdin	ALADDIN2-220	2 syringes, maximum syringe volume 60 mL
Thermocouple thermometer	Digi-Sense	WZ-20250-91	Single-Input Thermocouple Thermometer with NIST-Traceable Calibration
ThermoMixer	Eppendorf	5382000031	With an Eppendorf SmartBlock for 50 mL tubes
Uric acid	Sigma aldrich	U2625	≥99%, crystalline